Introduction
Desde principios de la década de 1970, la tomografía se acerca en la microscopía electrónica de transmisión (TEM) han sido ampliamente utilizados para la caracterización estructural de las muestras biológicas 1, 2, 3. El atractivo de la tomografía electrónica de transmisión era que podría ser utilizado para estudiar una amplia gama de estructuras biológicas a escala nanométrica, de la arquitectura de las células y la ultraestructura de los orgánulos a la estructura de los complejos macromoleculares y proteínas. Sin embargo, la tomografía electrónica de transmisión no se podría utilizar para estudiar muestras muy gruesas (mayor de 0,5 m). De hecho, las muestras gruesas producen demasiados electrones dispersos, la generación de imágenes de baja relación señal-ruido (SNR). Además, la tomografía implica la colección de imágenes de especímenes inclinados, con el espesor aparente de la muestra aumenta con el ángulo de inclinación. A pesar de que la dispersión inelástica se puede filtrarutilizando filtros de energía, la cantidad crítica de electrones necesarios para imágenes de alto SNR apenas se alcanza en TEM. Por lo tanto, las muestras biológicas de espesor sólo se han estudiado utilizando seccionamiento 4.
Algunas muestras no pueden ser cortadas: algunos pueden degradar cuando se cortan, y otros necesitan ser estudiados en su totalidad con el fin de comprender su complejidad. Un enfoque alternativo es utilizar TEM en el modo 5, 6, 7, 8 de exploración. En microscopía de barrido electrónico de transmisión (STEM), la trayectoria óptica de los electrones es diferente de la de TEM convencional. Los electrones pasan a través de la muestra sin dispersión se pueden recoger en el eje óptico con un detector de campo brillante (BF) 9, mientras que dispersa elásticamente se pueden recoger en un cierto ángulo desde el eje óptico con un detector de campo oscuro (DF).La otra ventaja de STEM es que el haz de electrones enfocado es escaneado en la superficie de la muestra, lo que permite la colección de píxel por píxel de las imágenes. A pesar de que el haz de electrones se ensancha mientras pasa a través de la muestra 10, este sistema de recogida es menos sensible a los electrones inelástica dispersos que TEM convencional. Además, no hay lente post-espécimen en STEM, evitando así las aberraciones cromáticas que pueden ocurrir en TEM. La longitud de la cámara se puede ajustar de manera que el detector detecta BF principalmente electrones dispersados. Utilizando el detector DF para estudiar muestras gruesas, no se recomienda debido a la dispersión múltiple, que produce imágenes imprecisas. En lugar de ello, el detector de BF se puede utilizar 11. Mientras STEM puede producir imágenes de alta SNR, tiene una relativamente baja profundidad de campo debido a la relativamente alta convergencia de haz en comparación con TEM, disminuyendo la cantidad de información en profundidad que se puede recuperar a partir de espesorespecímenes. En el caso de microscopios de STEM de aberración corregida, en el que el ángulo de convergencia puede ser tan alta como 30 mrad, el campo de profundidad de puede ser lo suficientemente baja para que la información que está en el foco origina a partir de un plano focal de sólo unos pocos nanómetros . Configuración del haz de electrones en el modo paralelo aumenta la profundidad de campo del haz de electrones en detrimento de la resolución 12. Sin embargo, esta disposición no siempre es posible.
Siempre que sea necesario el uso de un haz de electrones convergente, deberán utilizarse las técnicas que mejoran la profundidad de campo del haz de electrones en el estudio de muestras de espesor. Estudios recientes han informado de la adquisición de varias imágenes en diferentes planos focales en toda la muestra de recuperar la máxima cantidad de información que tiene el foco 13, 14. Los dos estudios describen diferentes maneras de manejar la información de los diferentes planos focales. Hovden et al.combinan en el espacio de Fourier de las imágenes que se recogieron en diferentes planos focales, y se obtuvo la reconstrucción final directamente a partir de la inversa 3D transformada de Fourier 13. Por el contrario, Dahmen et al. desarrollado un motor de reconstrucción de haz convergente para reconstruir en el espacio real del volumen 3D a partir de los diferentes planos focales 14. Nuestro laboratorio también desarrolló un método para obtener imágenes de muestras biológicas de espesor. Nuestra estrategia era diferente de los dos métodos descritos anteriormente en que nos fusionamos la información que está en el foco en los diferentes planos focales y reconstruido el volumen final en 3D en el espacio real mediante un proyector de haz paralelo 15. Nuestro objetivo fue desarrollar un método que se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio de microscopía electrónica. Con este fin, que tuvo como objetivo recoger las imágenes focales en una cantidad limitada de tiempo, comparable con el marco de tiempo de los experimentos de tomografía convencionales. Además, nuestra propuesta de método de could ser adaptado para su uso con diferentes tipos de alineación y software de reconstrucción.
En el contexto de nuestra publicación a partir de 2015 15, queríamos visualizar y caracterizar la recuperación de la profundidad de campo, por lo que se utilizó una gran convergencia semi-ángulo de 25 mrad. A continuación, presentamos un protocolo paso a paso para realizar a través focal imágenes in STEM de acuerdo con el método desarrollado en nuestro laboratorio en 2015 15, y presentamos cómo se procesan los datos de 2015. Este método recupera la información que tiene el foco de varios planos focales a lo largo de un (750 nm) muestra biológica de espesor y permite reconstrucciones en 3D de alta calidad. En su caso, también se presentan las diferencias en esta metodología en comparación con los métodos utilizados por otros grupos.
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Protocol
Precaución: Consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) de los diversos reactivos antes de usarlos. Varios de los productos químicos utilizados durante la preparación de la muestra son tóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y / o tóxicos para la reproducción. Usar el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) y el trabajo bajo una campana de humos durante la manipulación de la muestra. Seccionar la muestra con un ultramicrotomo implica el uso de instrumentos afilados, y el uso cuidadoso de estas herramientas es obligatorio. En los pasos descritos a continuación, los autores suponen que la muestra es una muestra de cultivo celular. puede necesitar ser modificada de acuerdo con el tipo de muestra, especialmente los pasos de centrifugación el protocolo.
1. Preparación de tampones y mezclas
- Una solución salina tamponada con fosfato (PBS) Preparar (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, y 1,76 mM KH 2 PO 4).
- Preparar soluciones que contienen 30%, 50% y 70% etHanol en PBS durante la deshidratación de la muestra. Realizar la deshidratación de la muestra mediante la incubación de la muestra gradualmente en concentraciones crecientes de etanol.
- Preparar resina epoxi mezclando bisfenol-A- (epiclorhidrina) (20 ml), dodecenilo anhídrido succínico (9 ml), metil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (11 ml), y 2,4,6-tris ( dimetilaminometil) fenol (0,7 ml); otras relaciones de mezcla pueden ser utilizados en función de la dureza deseada de la resina.
- Preparar soluciones que contienen 30%, 50%, y la resina epoxi 70% en etanol durante la incrustación de la muestra. Realizar la incrustación de resina mediante la incubación de la muestra gradualmente con el aumento de las concentraciones de resina.
NOTA: Los volúmenes de las soluciones preparadas dependen del tipo de muestra que se estudia. Se necesitan más soluciones para los tejidos que para los cultivos celulares.
2. La fijación y coloración de la prueba
- Centrifugar el cultivo de células durante 5 minutos a 5000 x g. Realizar todos los siguientes centrifugaciones utilizando las mismas condiciones.
- Descartar el sobrenadante y fijar el sedimento celular por resuspensión en PBS (1 ml) con 4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min (Figura 1A). Por otra parte, fijar las células a 4 ° C durante la noche o durante el fin de semana.
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar por completo los agentes de fijación.
- Post-fijar la muestra con 1% OSO 4 en PBS (1 ml) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar completamente el OsO4. Desactivar el OsO4 en aceite y descarte.
- Añadir 2% de acetato de uranilo en PBS (1 ml) como agente de contraste y se incuba la muestra durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 1B).
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar el aire acondicionado de uranilo no unidoetate; acetato de uranilo contiene elementos radiactivos y debe desecharse en un contenedor dedicado a los residuos radiactivos.
NOTA: Los tiempos de incubación pueden ser modificados de acuerdo con el tamaño de la muestra. Por ejemplo, la fijación y la tinción de las muestras más gruesas, tales como muestras de tejidos, requieren tiempos de incubación más largos. tiempos de incubación más largos también pueden ser mejores para la deshidratación y los pasos de incrustación. acetato de uranilo se puede sustituir por una solución "de uranilo menos" que contiene sales de gadolinio.
La deshidratación 3. Muestra
- Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y se incuba la muestra durante 30 min a 4 ° C en PBS (1 ml) con 30% de etanol (Figura 1C).
- Repita el paso 3.1 utilizando soluciones con concentraciones gradualmente crecientes de etanol (50%, 70%, y hasta 100%). Durante estas etapas de deshidratación, mantener la muestra a 4 ° C con fines de conservación de la muestra.
- Después de la centrifugación, desechar la Supernathormigas y resuspender el precipitado en etanol puro (1 ml); incubar durante la noche a 4 ° C.
4. Incorporación de Resina
- Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en etanol con resina epoxi 30% (1 ml) durante 30 min a RT (Figura 1D).
- Repita el paso 4.1 utilizando soluciones con concentraciones de resina epoxi gradualmente creciente (50%, 70%, y hasta 100%).
- Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en resina epoxi puro (1 ml); incubar durante la noche a TA. La presencia de endurecimiento DMP-30 podría desencadenar la polimerización de la resina; si esto sucede, preparar dos lotes de resina epoxi, una con y otra sin DMP-30.
- Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 200 l de resina de epoxi pura (que contiene el endurecedor) en una cápsula de plástico; la muestra debe ser en la parte inferior de la cápsula de plástico.
5. Resina de polimerización
- yoncubate la cápsula de plástico que contiene la muestra en un incubador a 60 ° C durante 48 h; otros tipos de resina pueden polimerizarse con diferentes configuraciones.
- Retire la cápsula de la incubadora y verificar que la resina ha polimerizado; la resina debe ser duro si se presiona contra una superficie dura.
- Añadir resina epoxi puro (que contiene el endurecedor) en la parte superior de la resina polimerizada que contiene la muestra; esta capa adicional de resina hará que sea más fácil de cortar la muestra. Incubar la cápsula a 60 ° C durante 48 h.
Seccionamiento 6. Muestra
- Montar la muestra al revés en un portamuestras de modo que la muestra es hacia la parte superior y fijarlo en el bloque de corte de la ultramicrotomo. bloquear firmemente la palanca para asegurar el bloque de corte a la ultramicrotomo.
- Utilizando una hoja de afeitar o un instrumento de corte puntiagudo similar, cortar la cápsula de plástico para separarlo de la resina polimerizada. Cortar la resina de manera que la muestra es contenered en resina en aproximadamente la forma de una pirámide. No hay necesidad de eliminar toda la cápsula de plástico; Sólo eliminar la parte que cubre la muestra polimerizado.
- Tome la cápsula y el soporte de la muestra fuera del bloque de recorte e instalarlas en el brazo móvil de la ultramicrotomo.
- Instalar un cuchillo de corte en el bloque del cuchillo y cortar con precisión las caras de la pirámide. Se recomienda el uso de prismáticos para dar una forma perfecta de la pirámide; mejor será la pirámide, la mejor de las secciones serán.
- Quitar el cuchillo de recorte y reemplazarlo con un cuchillo de histología que se puede utilizar para cortar secciones que son más gruesas que 0,5 micras.
- Después de llenar la cubeta de la cuchilla de la histología con la cantidad correcta de agua, llevar el borde de corte de la cuchilla a la superficie de la muestra y el uso de los prismáticos para ajustar el ángulo de paso de la cápsula de modo que el cuchillo cortará perpendicularmente a la pirámide.
- Ajustar la velocidad de corte de acuerdo con la deseadaespesor de la sección para recuperar secciones homogéneas.
- Dejar que la sección de flotar sobre el agua y los peces con un bucle.
- Mueva el bucle hacia una rejilla de cobre de microscopía electrónica que se ha colocado en la parte superior de papel de filtro.
NOTA: La parrilla debe haber sido previamente tratado para aumentar su hidrofilicidad. Esto se puede realizar con una pluma de rejilla de recubrimiento. - Debido a la absorción de agua por el papel de filtro, deje que la sección se adhieren a la red. Deje secar durante unos minutos antes de insertarlo en el microscopio electrónico.
7. Diseño de la inclinación de la serie A través focal
- Recoger imágenes a través de interés secundario a intervalos constantes de enfoque.
NOTA: La serie de inclinación a través focal consiste en un conjunto de imágenes a través de esferas de actividad que se recogen en cada ángulo de inclinación de la serie de inclinación. La amplitud de enfoque conjunto debe ser suficiente para cubrir todo el espesor de la muestra. - Determinar el valor del intervalo de enfoque. Si el intervalo es igual a la depth de campo, recoger toda la muestra en el foco; este valor representa el más alto de muestreo posible. Si el intervalo es mayor que la profundidad de campo, algunas partes de la muestra no serán adquiridos en el foco, lo que significa que algunas partes de la muestra no serán recogidos en el enfoque.
- Calcular la profundidad de campo de un haz de electrones a partir de la longitud de onda del electrón y la convergencia semi-ángulo del haz de electrones. Considerando que la longitud de onda de electrones está directamente vinculada a la tensión de aceleración, utilizar la convergencia semi-ángulo proporcionado por el fabricante microscopio electrónico o determinar experimentalmente a partir del patrón de difracción de una muestra conocida 16. Debido a que los electrones acelerados a una longitud de onda λ golpear la muestra con un semi-ángulo de convergencia de α en un microscopio electrónico, utilizar la siguiente ecuación para determinar el campo de profundidad de (DOF):
- Diseñola serie focal de modo que toda la amplitud de enfoque cubrirá la muestra en su espesor aparente máxima (es decir, en su más alto de inclinación).
NOTA: Una muestra de 0,75 micras de espesor tendrá un espesor aparente de 2,19 micras, con un inclinación de 70 °, por lo que la amplitud de enfoque debe ser mayor que 2,19 m. Para este ejemplo, si el intervalo de enfoque determinado anteriormente es igual a 50 nm, se requerirá de 44 imágenes (2,19 m / 50 nm) para cubrir la muestra en su máximo espesor aparente. La amplitud de enfoque conjunto es igual al valor del intervalo de enfoque, multiplicado por el número de pasos focales. En el más alto de inclinación (θ), el espesor aparente de la muestra se define como la siguiente:
8. Muestra Imaging
NOTA: Está más allá del alcance de este protocolo para describir cómo configurar un microscopio electrónico en modo STEM; la mayor parte de esta información se puede encontrar in el manual de referencia proporcionado por el fabricante del microscopio electrónico. Sin embargo, tenga en cuenta lo siguiente: i) el tamaño del punto debe ser elegido de acuerdo con el cambio de tamaño deseado; ii) la Ronchigram debe estar bien alineado; y iii) en el modo de BF, la longitud de la cámara se debe ajustar para seleccionar electrones dispersados manteniendo una buena iluminación del detector. secciones de resina depositado sobre rejillas de cobre de microscopía electrónica debe estar encendida antes de la adquisición de imágenes para evitar la contracción. la contracción de la resina y los efectos de carga podrían ser confundidos durante la adquisición de imágenes. El uso de una apertura de la lente objetivo podría mejorar la estabilidad de la muestra cuando se producen efectos de carga. Sin embargo, en el caso específico de las configuraciones de STEM, la apertura del objetivo no es compatible con el modo de imagen HAADF, y muy pequeñas aberturas objetivas no son compatibles con el modo de imagen BF.
- El uso de bajo aumento (alrededor 20.000X en STEM), navegar a través de la muestra y localizar la región de interés.
- Ajuste tque eucéntrica altura (eje Z) de manera que la región de interés no se alejan mientras gira la muestra.
- Compruebe que el objeto de interés permanecerá visible en toda la gama de inclinación.
- Debido al gran número de imágenes adquiridas durante una inclinación de la serie a través focal, utilice un software automático de la colección. O bien utilizar una solución comercial o si se desea diseñar un software de recogida de datos personalizado. Asegúrese de que el programa de software es capaz de realizar los tres pasos siguientes:
- Y realizar un enfoque como en un esquema estándar de recogida de la serie de inclinación.
- Asegúrese de que las imágenes a través focal se solapan con la posición Z de la muestra.
- adquirir automáticamente una serie de imágenes a través focal en cada ángulo de inclinación.
- Dar el programa de software de los principales parámetros de la serie a través de inclinación-focal (es decir, intervalos de actividad, paso focal, ángulo de inclinación mínimo, el máximo ángulo de inclinación, paso de inclinación y velocidad de barrido).
- comienzoel proceso de recogida de imagen y esperar a que el programa de software para finalizar.
Procesamiento 9. Imagen
NOTA: En este protocolo, el procesamiento de la serie de inclinación a través focal se realiza usando ImageJ plugins 17. Datos suplementarios 1 muestra una macro ImageJ para el paso de alineación (Turboreg) y para la fusión de la información de enfoque (profundidad de campo) para una serie de inclinación a través focal diseñado con tres valores de enfoque.
- Alinear las imágenes recogidas en el mismo ángulo de inclinación (es decir, a través de las imágenes-focales). Dado que las imágenes no tienen la misma información de enfoque, que no albergan las mismas características para la alineación; la alineación de las imágenes mediante la alineación de vecinos de dos en dos (es decir, a raíz de una jerarquía piramidal, con los valores de enfoque más cercanas primero) usando Turboreg 18, un plugin de ImageJ.
- Consistentemente verificar la alineación de las imágenes a través de-focales en cada ángulo de inclinación.Apilar las imágenes alineadas a través de interés secundario para mejorar la inspección visual.
NOTA: Sólo la zona que está en el foco debe moverse durante la navegación a través de la pila. La alineación exacta es lo más importante, ya que el siguiente paso consiste en la recuperación de la información que está en el foco de diferentes imágenes. - Combinar la información que está en el foco usando profundidad de campo 19, un plugin de ImageJ; esto eventualmente generará una sola imagen de la pila de imágenes. Existen varios valores se pueden utilizar durante la recuperación de la profundidad de campo, pero el uso de la configuración más alta para preservar la información de la imagen.
NOTA: La serie de inclinación está compuesta de una sola imagen por ángulo de inclinación, cada imagen que contiene la información de enfoque se recuperó de las imágenes a través de-focales. - Procesar los datos.
NOTA: Las herramientas estándar para la alineación y la reconstrucción se puede utilizar ya que los datos se ha reducido ahora a una serie de inclinación estándar. En este protocolo, TomoJ nosotros esed para la alineación de los datos y la reconstrucción de datos 20, 21. Más detalles acerca de cómo utilizar TomoJ se pueden encontrar en la publicación original 22. - Realizar ajuste fino de la serie de inclinación.
NOTA: Una buena estrategia es utilizar cuentas de oro como marcadores de referencia para rastrear con precisión los cambios entre imágenes. mínimos locales también se puede utilizar si cuentas de oro no se pueden añadir a la muestra. - Realizar una reconstrucción 3D de los datos alineados; varios algoritmos están disponibles para la realización de las reconstrucciones en el espacio real o en el espacio de Fourier, cada uno con ventajas y limitaciones.
- Si la alineación final de la serie de inclinación es pobre, hacer algunas mejoras mediante la optimización de los pasos iniciales. Reiterar los pasos de alineación si la reconstrucción 3D final aparece borrosa o deformada; en la práctica, mayor será el número de planos focales recogidos, mejor será el contraste y detalles de la reconstrucción 3D.
NOTA: Seprogramas de software Veral se pueden usar para procesar la inclinación de la serie a través de-focal. porque sin embargo, se eligieron las herramientas utilizadas en este protocolo, en nuestra experiencia, se obtuvieron los mejores resultados. Turboreg 18 obtenido mejores resultados en cuanto a la alineación de las imágenes cuando estaba presente un gradiente de concentración. Más información se puede encontrar en el sitio web dedicado 23. La gran profundidad de campo Plugin 19 realiza muy bien en términos de recuperación de la información de enfoque a partir de diferentes imágenes, mientras que otras herramientas resultaron en pixeles modificaciones visibles. Más información, especialmente en relación con la escritura de guiones, se puede encontrar en este sitio web dedicado 24.
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Representative Results
En nuestro estudio, los electrones se aceleran a 200 kV en el microscopio electrónico de transmisión cañón de emisión de campo. Las imágenes se recogieron en modo STEM BF utilizando un tiempo de permanencia de 20 mu s. En cuanto al diseño de la serie de inclinación a través de-focal, encontramos que los intervalos de enfoque de 150 nm dieron resultados satisfactorios para el estudio ultraestructural de una muestra, incluso biológica 750 nm de espesor, aunque la profundidad de campo de haz de electrones fue sólo 3-nm ya que utilizamos una convergencia muy grande semi-ángulo de 25 mrad.
La muestra analizada en este informe es Trypanosoma brucei, un eucariota unicelular cuyo flagelo se estudia intensamente porque este orgánulo se conserva notablemente de los protistas a los mamíferos 25. Las células fueron tratadas como se presenta en el protocolo de preparación de la muestra, y nos centramos el análisis estructural de la bolsa flagelar de T. brucei (
La fusión de la información de enfoque puede ser mejor visualizada, poniendo de relieve las áreas de alta frecuencia de las imágenes de la serie a través de la inclinación-focal (píxeles blancos en la Figura 2F, G y H). El comando ImageJ "Hallar bordes" fuimos nosotrosed en el presente estudio. Este comando utiliza un filtro Sobel para detectar cambios en intensidades de los píxeles vecinos. El desplazamiento de la zona de alta frecuencia detectada se puede observar de una imagen a la otra. En la imagen, donde la información de enfoque se ha fusionado, las altas frecuencias abarcan la mayor parte de la imagen (Figura 2I). Este método permite la verificación de la buena transformación de la inclinación de la serie a través de-focal.
El uso de la inclinación de la serie a través focal, extra información de enfoque se recoge y se utiliza durante el proceso de reconstrucción en 3D. Esto produce un mayor contraste y SNR y reduce los efectos borrosos observados en las reconstrucciones en 3D de de profundidad de campo limitada-imágenes 15. En el espacio de Fourier, la información adicional se recupera en comparación con un sistema de recogida de la serie de inclinación clásica, donde sólo en el plano focal 13 se recaba. En general, la calidad en el conjunto 3D reconstrucción es más isótropo en comparación con un sistema de recogida de inclinación de la serie clásica.
Figura 1: Imágenes que presentan las diferentes etapas del protocolo de preparación de muestra biológica. El protocolo de preparación de la muestra puede dividirse en cuatro pasos de red. La muestra se A) fijado en paraformaldehído y glutaraldehído, B) con puestos fijos en tetróxido de osmio y contrastados con acetato de uranilo, C) se deshidrataron en etanol, y D) embebido en resina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, se presenta un protocolo de preparación de muestras convencional junto con una guía paso a paso para realizar el análisis 3D en muestras biológicas de espesor utilizando la tomografía por STEM-focal. Resina incrustación de muestras biológicas se ha utilizado durante décadas 26 y protocolos alternativos que se adaptan a diferentes tipos de muestras se pueden encontrar en la literatura 27. Por el contrario, las muestras gruesas de imagen en STEM está utilizando métodos a través de enfoque de una nueva empresa, y los métodos más probable es que pueden mejorar a medida que está más extendido.
El objetivo de este trabajo fue describir un protocolo de preparación de muestras y, más concretamente, las condiciones de formación de imágenes para llevar a cabo a través focal adquisición de series de inclinación en el tallo con el equipo que está disponible en la actualidad y en un tiempo razonable. Por esta razón, se han utilizado intervalos de enfoque de gran tamaño. De hecho, no existe un consenso acerca de la proximidad de laplanos focales deben ser gruesas para obtener imágenes de un espécimen con el vástago de la inclinación de la serie a través focal. Por lo general toma hasta varios segundos para recoger las imágenes de STEM, y toda una serie de inclinación convencional puede tardar horas en completarse. Como prueba de concepto, es posible recoger cientos o incluso miles de imágenes. Sin embargo, es claro que los largos tiempos de recogida no son adecuados para el uso diario. estabilidad de la viga y la deriva de la muestra deben ser tomadas en cuenta al diseñar tales experimentos largos. Además, los tiempos de recogida largas plantean la cuestión de la dosis acumulada de electrones. Por lo tanto, por el momento, a través de STEM-focal de inclinación de la serie sólo es adecuado para el estudio de muestras de haz resistentes, tales como muestras biológicas incrustado en resina o materiales inorgánicos, principalmente debido a la dosis de electrones sustancial requerida. Debido a la compensación entre el tiempo de adquisición y la calidad de la reconstrucción 3D final, se recomienda utilizar unos intervalos-focal a través de proyectos que no se requiera alta resolución, unand se recomienda utilizar una mayor cantidad de intervalos a través de-focal en proyectos donde se requiere alta resolución.
Hay una falta de consenso sobre los pasos específicos de este método debido a su novedad. Sin embargo, está claro que varios pasos son críticos para las reconstrucciones de alta calidad de vástago a través-focal de la serie de inclinación conjuntos de datos. En primer lugar, la alineación de las imágenes focales en cada ángulo de inclinación debe ser ejecutado cuidadosamente, como se ha señalado en los tres artículos originales que describen a través focal colección de imágenes 13, 14, 15. A pesar de que las imágenes recogidas a diversos valores focales no comparten información común, Turboreg sigue siendo una buena solución para la alineación precisa, automática de imágenes. En segundo lugar, la fusión de las imágenes de actividad, tal como se realiza en este protocolo, tiene la ventaja de generar una única imagen por ángulo de inclinación, que se maneja fácilmente por cualquier align-series de inclinaciónción y el programa de software de reconstrucción 3D. La profundidad de campo plug-in fue diseñado inicialmente para imágenes de microscopía de luz; No obstante, parece ser la mejor solución para la fusión de la información de enfoque a partir de micrografías de electrones 28. Una solución alternativa es considerar todo el conjunto de imágenes como un único conjunto de datos de series de inclinación con varias imágenes por ángulo de inclinación, de manera similar a lo que se hizo por Hovden et al. 13 y Dahmen et al. 14. Esto requiere el uso de algoritmos de reconstrucción a base de Fourier 13 o Ettention, que fue desarrollado por Dahmen et al. 29 y que es el único software de reconstrucción en 3D que puede reconstruir volúmenes 3D a partir de imágenes recogidas a diversos valores focales en el espacio real. En particular, tales soluciones alternativas requerirán un paso de alineación adicional en la dirección focal (eje Z), lo que podría producir confuso results que son incompatibles con los intervalos de desenfoque elegidos durante la recogida de la imagen, como se discutió en Dahmen et al. 14. La fusión de la información de enfoque, tal como se presenta en este protocolo, tiene la ventaja de generar una imagen como si los datos se recogieron usando un paralelo, evitando así esta etapa de alineación adicional en la dirección Z.
A través focal se han desarrollado métodos de series de inclinación para estudiar muestras de espesor (alrededor de 1 micra). La principal limitación de estos métodos es que no se pueden utilizar para estudiar muestras más gruesas que varias micras, puesto que el haz de electrones no puede penetrar en estas muestras. Esta limitación viene de la trayectoria libre media de los electrones, que depende de la tensión de aceleración. Aunque muy alta tensión (es decir, 1.000 kV) microscopios electrónicos se pueden utilizar para obtener imágenes de células eucariotas 30, las muestras muy gruesas todavía requieren el uso de otras técnicas, tales como focused haz de iones o bloque cara microscopía electrónica de barrido de serie 31, 32. Sin embargo, estos métodos generan reconstrucciones anisótropas que pueden ser considerados pilas de imágenes debido a que el eje Z, que se define como la profundidad de corte del método, no es equivalente a los ejes X y ejes Y-. Estas técnicas no pueden ser utilizados para estudios de alta resolución.
En 2014 y 2015, tres artículos originales informaron diferentes métodos para muestras de imágenes gruesas 13, 14, 15. Desde entonces, sólo unos pocos estudios han utilizado cualquiera de estos métodos para estudiar muestras gruesas 33. Las mejoras en los métodos ayudarán a generalizar a través de imágenes-focal en STEM. Particularmente en ciencias de la vida, los métodos deben ser optimizados para la observación de muestras en condiciones criogénicas a través focal. Este es un gran reto, ya que las muestras son criogénicosparticularmente sensibles a los electrones de dosificación y métodos a través de enfoque requieren muchas imágenes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al.
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
- Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
- Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
- Kohl, L., Bastin, P.
- Luft, J. H.
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al.
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
