Introduction
Desde o início da década de 1970, a tomografia abordagens em microscopia electrónica de transmissão (MET) têm sido amplamente utilizados para a caracterização estrutural de espécimes biológicos 1, 2, 3. O recurso de tomografia electrónico de transmissão mostrou que poderia ser usado para estudar uma vasta gama de estruturas biológicas em escala nanométrica, a partir da arquitectura das células e a ultra-estrutura de organelos para a estrutura dos complexos macromoleculares e as proteínas. No entanto, a tomografia electrónica de transmissão não pode ser usado para estudar amostras muito espessos (mais do que 0,5 micron). De fato, as amostras de espessura produzir muitos elétrons dispersos, gerando imagens de baixa relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a tomografia envolve a recolha de imagens de espécimes inclinado, com a espessura aparente da amostra aumenta com o ângulo de inclinação. Apesar de dispersão não elástica pode ser filtradausando filtros de energia, a quantidade crítica de elétrons necessários para imagens de alta SNR é mal chegou na TEM. Assim, amostras biológicas de espessura única têm sido estudados utilizando seccionamento 4.
Algumas amostras não pode ser cortado: alguns podem degradar quando são cortadas, e outros precisam ser estudados na sua totalidade, a fim de compreender a sua complexidade. Uma abordagem alternativa é usar TEM no modo 5, 6, 7, 8 digitalização. Em microscopia de varrimento electrónico de transmissão (STEM), o percurso óptico de electrões é diferente do que no TEM convencional. Os electrões passam através da amostra sem dispersão pode ser recolhida no eixo óptico com um de campo claro (BF) detector de 9, ao passo que as dispersa elasticamente podem ser recolhidos a um certo ângulo a partir do eixo óptico com um detector de campo escuro (DF).A outra vantagem da haste é que o feixe de electrões focado é digitalizado na superfície da amostra, permitindo a recolha de pixel-a-pixel da imagem. Mesmo que o feixe de electrões expande ao passar através da amostra 10, este sistema de recolha em particular é menos sensível aos electrões inelasticamente dispersos do que MET convencional. Além disso, não há nenhuma lente de pós-espécime em STEM, evitando-se assim as aberrações cromáticas que podem ocorrer em MET. O comprimento da câmara pode ser ajustado de modo que o detector detecta BF principalmente electrões não dispersa. Usando o detector DF para estudar amostras de espessura não é recomendado por causa da dispersão múltipla, que produz imagens imprecisas. Em vez disso, o detector pode ser usado BF 11. Enquanto STEM pode produzir imagens de alta SNR, tem uma relativamente baixa profundidade de campo por causa da convergência relativamente elevado feixe comparação com TEM, diminuindo a quantidade de informações detalhadas que podem ser recuperados a partir de espessuraespécimes. No caso dos microscópios STEM corrigiu-aberração, onde o ângulo de convergência pode ser tão alta quanto 30 mrad, a profundidade de campo-pode ser baixa o suficiente para que a informação que está em foco origina de um plano focal de apenas alguns nanômetros . Configurando o feixe de elétrons em modo paralelo aumenta a profundidade de campo do feixe de elétrons em detrimento da resolução 12. No entanto, esta configuração não é sempre possível.
Sempre que é necessário utilizar um feixe de electrões convergente, deve-se usar técnicas que melhoram a profundidade de campo do feixe de electrões quando estudar amostras grossas. Estudos recentes têm relatado a aquisição de imagens múltiplas em vários planos focais em toda a amostra para recuperar o máximo de informações em foco 13, 14. Os dois estudos descrevem maneiras diferentes de lidar com as informações dos diferentes planos focais. Hovden et ai.combinado no espaço Fourier das imagens que foram recolhidos em vários planos focais, ea reconstrução final foi obtido directamente a partir da inversa 3D transformada de Fourier 13. Em contraste, Dahmen et ai. desenvolveu um motor de reconstrução feixe convergente para reconstruir no espaço real o volume 3D dos vários planos focais 14. O nosso laboratório também desenvolvido um método para imagiologia de espécimes biológicos grossas. Nossa estratégia era diferente dos dois métodos descritos acima, em que fundiu as informações que está em foco nos vários planos focais e reconstruído o volume 3D final em espaço real usando um projetor de feixe paralelo 15. O nosso objectivo foi desenvolver um método que pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório microscopia electrónica. Para este fim, o nosso objectivo de recolher as imagens focais em uma quantidade limitada de tempo, comparável com o período de tempo de experimentos de tomografia convencionais. Além disso, o nosso método proposto could ser adaptada para uso com diferentes tipos de software de alinhamento e de reconstrução.
No contexto da nossa publicação a partir de 2015 15, que queria para visualizar e caracterizar a recuperação da profundidade de campo, por isso usamos uma grande convergência semi-ângulo de 25 mrad. Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo para a execução através de imagiologia-focal em espigão de acordo com o método desenvolvido no nosso laboratório em 2015 15, e que apresentam a forma como os dados a partir de 2015 foi processada. Este método recupera informação de focagem a partir de vários planos focais ao longo de um (750 nm) da amostra biológica de espessura e permite reconstruções 3D de alta qualidade. Se for caso disso, as diferenças de metodologia em relação aos métodos utilizados por outros grupos também são apresentados.
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Protocol
Cuidado: Consulte as fichas de segurança (MSDS) dos vários reagentes antes de usá-los. Vários dos produtos químicos utilizados durante a preparação da amostra são tóxicas, cancerígenas, mutagénicas e / ou tóxicas para a reprodução. Use equipamento de protecção individual (luvas, jaleco, calças compridas e sapatos fechados) e trabalhar sob um exaustor durante o manuseio da amostra. Seccionamento da amostra com um ultramicrotome envolve o uso de instrumentos cortantes, e uso cuidadoso dessas ferramentas é obrigatória. Nos passos descritos abaixo, os autores assumem que a amostra é uma amostra de cultura de células. O protocolo pode necessitar de ser modificada de acordo com o tipo de amostra, especialmente os passos de centrifugação.
1. Preparação de buffers e misturas
- Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, e 1,76 mM de KH 2 PO 4).
- Preparar soluções contendo 30%, 50%, e 70% de Ethanol em PBS durante a desidratação amostra. Realizar a desidratação da amostra por incubação da amostra gradualmente em concentrações crescentes de etanol.
- Prepare resina epoxi misturando bisfenol-A- (epicloridrina) (20 mL), anidrido succínico dodecenilo (9 mL), metil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (11 mL), e 2,4,6-tris ( dimetilaminometil) fenol (0,7 mL); outras proporções de mistura pode ser utilizado, dependendo da dureza desejada da resina.
- Preparar soluções contendo 30%, 50%, e a resina epóxi 70% em etanol para a incorporação da amostra. Realizar a incorporação da resina por incubação da amostra gradualmente com o aumento das concentrações de resina.
NOTA: Os volumes das soluções preparadas dependem do tipo de amostra que é estudada. Mais soluções são necessários para os tecidos do que para as culturas celulares.
2. Fixação e coloração da Amostra
- Centrifugar a cultura de células durante 5 min a 5000 x g. Realiza todas as seguintes centrifugações, usando as mesmas condições.
- Descartar o sobrenadante e fixar o sedimento de células por ressuspensão em PBS que (1 mL) com 4% de paraformaldeído e glutaraldeído 2%. Incubar-la à temperatura ambiente durante 30 min (Figura 1A). Em alternativa, fixar as células a 4 ° C durante a noite ou no fim de semana.
- Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para eliminar completamente os agentes fixadores.
- Pós-fixar a amostra com 1% de OsO 4 em PBS (1 mL) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para se remover completamente o OsO4. Desactivar o OsO 4 em óleo e descarte.
- Adicionar 2% de acetato de uranilo em PBS (1 ml) como agente de contraste e incubar a amostra durante 30 minutos à temperatura ambiente (Figura 1B).
- Após centrifugação, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de 3 vezes com PBS (1 mL) para remover o ac uranilo não ligadoetate; acetato de uranilo contém elementos radioativos e devem ser eliminados de uma bin dedicado aos resíduos radioactivos.
NOTA: Os tempos de incubação podem ser modificados de acordo com o tamanho da amostra. Por exemplo, fixação e coloração das amostras mais espessas, tais como amostras de tecidos, requerem tempos de incubação mais longos. tempos de incubação mais longos podem também ser melhor para a desidratação e os passos de incorporação. acetato de uranilo pode ser substituída por uma solução "de uranilo-menos" que contém sais de gadolínio.
A desidratação 3. Amostra
- Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e incubar a amostra durante 30 min a 4 ° C em PBS (1 mL) com etanol a 30% (Figura 1C).
- Repetir o passo 3.1 utilizando soluções com concentrações gradualmente crescentes de etanol (50%, 70%, e até 100%). Durante estes passos de desidratação, manter a amostra a 4 ° C para fins de conservação das amostras.
- Após a centrifugação, descartar o Supernatformigas e ressuspender o sedimento em etanol puro (1 mL); incubar durante a noite a 4 ° C.
4. Resina Embedding
- Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em etanol com 30% de resina epoxi (1 mL) durante 30 min à temperatura ambiente (Figura 1D).
- Repetir o passo 4.1 utilizando soluções com concentrações de resina epoxi gradualmente crescente (50%, 70%, e até 100%).
- Após centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em resina epóxi puro (1 mL); incubar durante a noite à TA. A presença de endurecimento DMP-30 pode desencadear a polimerização da resina; Se isso acontecer, preparar dois lotes de resina epoxi, um com e um sem DMP-30.
- Após centrifugação, ressuspender o sedimento em 200 ul de resina epóxi pura (contendo o endurecedor) em uma cápsula de plástico; a amostra deve estar na parte inferior da cápsula de plástico.
5. Resina de polimerização
- Euncubate a cápsula de plástico contendo a amostra numa incubadora a 60 ° C durante 48 h; outros tipos de resina pode polimerizar com configurações diferentes.
- Remover a cápsula da incubadora e verificar que a resina tenha polimerizado; a resina deve ser difícil se pressionado contra uma superfície dura.
- Adicionar resina epóxi pura (contendo o endurecedor) no topo da resina polimerizada que contém a amostra; Esta camada extra de resina vai torná-lo mais fácil de cortar a amostra. Incubar a cápsula a 60 ° C durante 48 h.
Seccionamento 6. Amostra
- Monte a amostra de cabeça para baixo em um suporte de amostra, de modo que a amostra é em direção ao topo e corrigi-lo no bloco de corte do ultramicrotome. Firmemente bloquear a alavanca para fixar o bloco de corte ao ultramicrotome.
- Usando uma lâmina de barbear ou de um instrumento de corte afiada semelhante, cortar a cápsula de plástico para separá-lo a partir da resina polimerizada. Cortar a resina de modo que a amostra é conterEd na resina em aproximadamente a forma de uma pirâmide. Não há necessidade de remover toda a cápsula de plástico; só remover a parte que cobre a amostra polimerizada.
- Tome a cápsula e o suporte de amostras fora do bloco de corte e instalá-los no braço móvel da ultramicrotome.
- Instalar uma faca corte no bloco faca e cortar com precisão as faces da pirâmide. O uso de binóculos é aconselhado a dar uma forma perfeita para a pirâmide; o melhor da pirâmide, melhor as seções será.
- Retire a faca de corte e substitui-lo com uma faca histologia que pode ser usado para cortar secções que são mais espessas do que 0,5 um.
- Após o enchimento da cuvete da faca histologia com a quantidade correcta de água, trazer a aresta de corte da faca à superfície da amostra e usar o binóculo para ajustar o ângulo de passo da cápsula de modo que a faca irá cortar perpendicularmente à pirâmide.
- Ajustar a velocidade de corte de acordo com o pretendidoespessura de corte para recuperar seções homogêneas.
- Deixe o flutuador seção sobre a água e pescá-lo com um loop.
- Mover o ciclo no sentido de uma grelha de cobre de microscopia electrónica que foi colocado em cima do papel de filtro.
NOTA: A grade deveria ter sido previamente tratados para aumentar a sua hidrofilicidade. Isto pode ser realizado com uma caneta de revestimento grade. - Devido à absorção de água pelo filtro de papel, deixe a secção de manter o grid. Deixe secar por alguns minutos antes de inseri-lo no microscópio eletrônico.
7. Desenho do meio-focal Tilt-series
- Recolher imagens através focais em intervalos foco constante.
NOTA: A inclinação da série através de-focal consistem em um conjunto de imagens através focais que são coletados em cada ângulo de inclinação da série de inclinação. Toda a amplitude foco deve ser suficiente para cobrir toda a espessura da amostra. - Determinar o valor do intervalo de foco. Se o intervalo é igual a d oepth de campo, recolher toda a amostra em foco; esta configuração representa a mais alta de amostragem possível. Se o intervalo é maior do que a profundidade de campo, algumas partes da amostra não será adquirida em foco, o que significa que algumas partes da amostra não irá ser recolhido em foco.
- Calcula-se a profundidade de campo de um feixe de electrões de comprimento de onda do electrão e o semi-ângulo de convergência do feixe de electrões. Considerando que o comprimento de onda dos electrões está directamente ligada à voltagem de aceleração, utilizar o semi-ângulo de convergência fornecida pelo fabricante microscópio de electrões ou determinar experimentalmente a partir do padrão de difracção de uma amostra de 16 conhecido. Porque os elétrons acelerados a um λ comprimento de onda atingiu a amostra com uma convergência semi-ângulo de α em um microscópio eletrônico, use a seguinte equação para determinar a profundidade de campo-(DOF):
- desenhara série focal de modo que toda a amplitude foco vai cobrir a amostra na sua espessura aparente máxima (isto é, na sua maior inclinação).
NOTA: Uma amostra de 0,75 um de espessura terá uma espessura aparente de 2,19 uM a uma inclinação de 70 °, de modo que a amplitude foco deve ser maior do que 2,19 | im. Para este exemplo, se o intervalo de focagem acima determinado é igual a 50 nm, será necessária imagens 44 (2,19 ^ M / 50 nm) para cobrir a amostra na sua espessura máxima aparente. Toda a amplitude do foco é igual ao valor do intervalo de foco multiplicado pelo número de passos focais. Na maior inclinação (θ), a espessura aparente da amostra é definido como o seguinte:
Imagem 8. Amostra
NOTA: é para além do âmbito deste protocolo para descrever como configurar um microscópio eletrônico no modo STEM; a maioria desta informação pode ser encontrada in o manual de referência fornecido pelo fabricante do microscópio eletrônico. No entanto, observe o seguinte: i) o tamanho do ponto deve ser escolhido de acordo com a ampliação desejada; ii) o Ronchigram deve ser bem alinhados; e iii) no modo de BF, o comprimento da câmara deve ser ajustado para seleccionar electrões não dispersa mantendo ao mesmo tempo uma boa iluminação do detector. secções de resina depositados em grades de cobre de microscopia eletrônica deve ser iluminado antes de aquisição de imagem para evitar o encolhimento. encolhimento resina e efeitos de carregamento pode ser confundido durante a aquisição de imagem. O uso de uma abertura lente objetiva pode melhorar a estabilidade da amostra quando ocorrem efeitos de tarifação. No entanto, no caso específico de configurações STEM, a abertura objectivo não é compatível com o modo de imagem HAADF, e muito pequenas aberturas objetivos não são compatíveis com o modo de imagem BF.
- Usando baixa ampliação (cerca 20,000X em STEM), navegue através da amostra e localizar a região de interesse.
- Ajuste tele eucentric altura (eixo Z), de modo que a região de interesse não se afastam enquanto se rodam a amostra.
- Verifique se o objeto de interesse permanecerá visível em toda a faixa de inclinação.
- Devido ao número substancial de imagens adquiridas durante uma tilt-série através de-focal, use um software de coleta automática. Ou usar uma solução comercial ou projetar um software de coleta de dados personalizado, se desejar. Certifique-se de que o programa de software é capaz de executar os três passos que se seguem:
- Rastrear e focar como em um esquema padrão de coleção da série de inclinação.
- Certifique-se de que as imagens através focal-se sobrepõem com o Z-posição da amostra.
- adquirir automaticamente uma série de imagens através de-focal em cada ângulo de inclinação.
- Dê o programa de software os principais parâmetros da série de inclinação por meio-focal (ou seja, intervalos focais, etapa focal, ângulo mínimo de inclinação, ângulo de inclinação máxima, o passo de inclinação e velocidade de varredura).
- Começaro processo de recolha de imagem e esperar que o programa de software para terminar.
Processamento 9. Imagem
NOTA: Neste protocolo, o processamento da série de inclinação por meio-focal é realizada utilizando ImageJ plugins 17. Dados Suplementar 1 mostra um macro ImageJ para a etapa de alinhamento (Turboreg) e para mesclar informações em foco (profundidade de campo estendida) para um tilt-série através de-focal projetado com três valores de foco.
- Alinhe as imagens recolhidas no mesmo ângulo de inclinação (isto é, as imagens através focais). Desde imagens não têm a mesma informação em foco, eles não abrigam as mesmas características de alinhamento; realizar o alinhamento, alinhando imagens vizinhos dois a dois (ou seja, seguindo uma hierarquia piramidal, com os valores mais próximos concentrar primeiro) usando Turboreg 18, um plugin do ImageJ.
- Consistentemente verificar o alinhamento das imagens através focais em cada ângulo de inclinação.Empilhar as imagens através focais alinhados para melhorar a inspeção visual.
NOTA: Somente a zona que está em foco deve mover-se enquanto navega através da pilha. alinhamento preciso é a coisa mais importante, uma vez que o passo seguinte consiste na recuperação da informação que está em foco a partir de imagens diferentes. - Mesclar as informações que está em foco usando Depth of Field estendida 19, um plugin do ImageJ; este acabará por gerar uma única imagem a partir da pilha de imagens. Várias configurações podem ser usadas durante a recuperação da profundidade de campo, mas use as configurações mais altas para preservar as informações da imagem.
NOTA: A série de inclinação é agora composta por uma única imagem por ângulo de inclinação, cada imagem contém a informação em foco recuperado das imagens através focais. - Processar os dados.
NOTA: ferramentas padrão para alinhamento e reconstrução podem ser usados desde que os dados agora foi reduzido a uma série de inclinação padrão. Neste protocolo, TomoJ nós éed para o alinhamento de dados e reconstrução de dados 20, 21. Mais detalhes sobre como usar TomoJ pode ser encontrada na publicação original 22. - Executar bem o alinhamento da série de inclinação.
NOTA: Uma boa estratégia é usar contas de ouro como marcadores fiduciais de controlar com precisão mudanças entre imagens. mínimos locais pode também ser usado se contas de ouro não pode ser adicionada à amostra. - Executar uma reconstrução 3D dos dados alinhados; vários algoritmos estão disponíveis para executar as reconstruções no espaço real ou espaço de Fourier, cada um com vantagens e limitações.
- Se o alinhamento final da série de inclinação é pobre, fazer algumas melhorias, otimizando os passos iniciais. Reiterar as etapas de alinhamento se a reconstrução 3D última parece desfocada ou deformada; Na prática, quanto maior for o número de planos focais recolhidos, melhor será o contraste e os detalhes da reconstrução 3D.
NOTA: Several programas de software pode ser utilizado para processar a inclinação-série por meio-focal. No entanto, as ferramentas utilizadas neste protocolo foram escolhidos porque, em nossa experiência, eles tiveram o melhor desempenho. Turboreg 18 tiveram melhor desempenho em termos de alinhamento das imagens, quando um gradiente de foco esteve presente. Mais informações podem ser encontradas no site dedicado 23. A profundidade de campo estendida plug-in 19 um desempenho muito bom em termos de recuperar a informação em foco a partir de imagens diferentes, ao passo que outras ferramentas resultaram em modificações pixels visíveis. Mais informações, especialmente em relação escrita de argumentos, podem ser encontradas neste site dedicado 24.
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Representative Results
Em nosso estudo, os elétrons foram acelerados a 200 kV na emissão de campo microscópio eletrônico de transmissão arma. As imagens foram coletadas no modo STEM BF usando um tempo de permanência de 20 uS. Quanto ao design do tilt-série através de-focal, descobrimos que os intervalos de focagem de 150 nm deram resultados satisfatórios para o estudo ultra-estrutural de uma amostra-even 750 nm de espessura biológica que a profundidade de campo-do feixe de elétrons foi apenas 3 nm-desde que usamos uma convergência muito grande semi-ângulo de 25 mrad.
A amostra analisada neste relatório é Trypanosoma brucei, um eucariota unicelular cujo flagelo é intensamente estudado porque esta organela é notavelmente conservada desde protistas aos mamíferos 25. As células foram tratadas tal como apresentado no protocolo de preparação de amostra, e focado na análise estrutural no bolso flagelar de T. brucei (
A fusão das informações em foco pode ser melhor visualizado, destacando as áreas de alta frequência das imagens da série de inclinação através de-focal (pixels brancos na Figura 2F, G e H). O comando ImageJ "Arestas" foi-nosed no presente estudo. Este comando usa um filtro de Sobel para detectar mudanças na intensidade dos pixels vizinhos. O deslocamento da zona de alta frequência detectado pode ser observado a partir de uma imagem para o outro. Na imagem onde a informação em foco foi fundida, as altas frequências abrangem a maior parte da imagem (Figura 2I). Este método permite a verificação do bom processamento da inclinação-série por meio-focal.
Usando through-focal tilt-série, extra informações em foco são coletadas e utilizadas durante o processo de reconstrução 3D. Isso produz um maior contraste e SNR e reduz os efeitos de borrão observadas nas reconstruções em 3D de imagens 15 de profundidade de campo-limitada. No espaço de Fourier, informação extra é recuperado em comparação com um sistema de recolha da série de inclinação clássico, onde apenas no plano focal é coletado 13. No geral, a qualidade em todo o conjunto 3D reconstrução é mais isotrópica em comparação com um esquema clássico coleção da série de inclinação.
Figura 1: Imagens que apresentam as diferentes etapas do protocolo de preparação da amostra biológica. O protocolo de preparação da amostra pode ser dividida em quatro passos de alimentação. A amostra é a) fixadas em paraformaldeído e glutaraldeído, B) pós-fixadas em tetróxido de ósmio e contrastadas com acetato de uranilo, C) em etanol desidratado, e D) embebidos em resina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar 1. Arquivo Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
Neste artigo, apresentamos um protocolo de preparação da amostra convencional, juntamente com um guia passo-a-passo para a realização de análise 3D em amostras biológicas de espessura usando STEM tomografia meio-focal. Resina incorporação de espécimes biológicos tem sido usado por décadas 26 e protocolos alternativos que são adaptados a diferentes tipos de amostras podem ser encontrados em toda a literatura 27. Em contraste, a imagem espécimes de espessura em STEM usando métodos através de foco é um novo empreendimento, e os métodos provavelmente irá ser melhorada, uma vez que torna-se mais generalizada.
O objetivo deste trabalho foi descrever um protocolo de preparação de amostras e, mais especificamente, as condições de imagem para realizar through-focal aquisição da série de inclinação na haste com o equipamento que é actualmente disponíveis e em uma quantidade razoável de tempo. Por esta razão, foram utilizados grandes intervalos de focagem. Na verdade, não há consenso sobre como fechar aplanos focais deve ser para a imagem de um espécime com grossas STEM para meio-focal tilt-série. Geralmente, leva até vários segundos para recolher imagens STEM, e todo um tilt-série convencional pode levar horas para ser concluído. Como prova de conceito, é possível recolher centenas ou mesmo milhares de imagens. No entanto, é claro que a longos tempos de recolha não são adequados para o uso diário. estabilidade do feixe e deriva da amostra deve ser levado em conta na concepção de tais experiências longas. Além disso, os tempos de recolha de longas levantar a questão da dose de elétrons acumulados. Assim, por enquanto, Caule through-focal tilt-série só é adequado para o estudo de amostras de feixes resistentes, tais como amostras biológicas embebidos em resina ou materiais inorgânicos, principalmente por causa da dose de elétrons substancial necessário. Por causa do trade-off entre o tempo de aquisição e qualidade da reconstrução 3D final, recomendamos a utilização de alguns intervalos através de-focal em projetos onde a alta resolução não é necessária, umand recomendamos a utilização de uma maior quantidade de intervalos através de-focal em projectos onde se requer alta resolução.
Há uma falta de consenso sobre os passos específicos neste método devido à sua novidade. No entanto, é claro que vários passos são críticos para as reconstruções de alta qualidade a partir de STEM através de-focal conjuntos de dados da série de inclinação. Em primeiro lugar, o alinhamento das imagens focais em cada ângulo de inclinação deve ser cuidadosamente executado, como apontado nos três artigos originais descrevendo through-focal coleção de imagens 13, 14, 15. Mesmo que as imagens recolhidas em vários valores focais não compartilham informação comum, Turboreg continua a ser uma boa solução para o alinhamento preciso, automático de imagens. Em segundo lugar, a fusão das imagens focais, conforme realizado neste protocolo, tem a vantagem de gerar uma única imagem por ângulo de inclinação, que é facilmente manipulado por qualquer align série tiltmento e um programa de software de reconstrução 3D. A profundidade de campo estendida plug-in foi inicialmente projetado para imagens de microscopia de luz; no entanto, parece ser a melhor solução para a fusão das informações em foco a partir de micrografias eletrônicas 28. Uma solução alternativa é a de considerar todo o conjunto de imagens como um único conjunto de dados da série de inclinação com várias imagens por ângulo de inclinação, à semelhança do que foi feito por Hovden et al. 13 e Dahmen et al. 14. Isto requer a utilização de algoritmos de reconstrução baseados em 13 de Fourier ou Ettention, que foi desenvolvido por Dahmen et ai. 29 e que é o único software de reconstrução em 3D que pode reconstruir volumes 3D a partir de imagens recolhidas em vários valores focais no espaço real. Nomeadamente, essas soluções alternativas implica um passo adicional de alinhamento na direcção de focagem (eixo Z), que pode produzir resu confusolts que são inconsistentes com os intervalos de desfocagem escolhidos durante a coleta de imagem, como discutido em Dahmen et al. 14. A fusão das informações em foco, conforme apresentado neste protocolo, tem a vantagem de gerar uma imagem como se os dados foram coletados por meio de um paralelo, evitando assim esse passo extra alinhamento no Z-direção.
Através-focal métodos da série de inclinação foram desenvolvidos para estudar amostras de espessura (cerca de 1 mm). A principal limitação destes métodos é que eles não podem ser utilizados para estudar amostras mais espessas que vários micra, uma vez que o feixe de electrões não pode penetrar tais amostras. Esta limitação vem do percurso livre médio dos electrões, o qual está dependente da tensão de aceleração. Apesar de muito alta voltagem (isto é, 1.000 kV) microscópios de electrões pode ser usado para imagiologia de células eucarióticas 30, amostras muito espessas exigem ainda a utilização de outras técnicas, tais como focusefeixe de íons d ou microscopia eletrônica de varredura de série bloco-face 31, 32. No entanto, estes métodos geram reconstruções anisotrópicos que pode ser considerado pilhas de imagens, porque o eixo Z, que é definido como a profundidade de corte do método, não é equivalente à X- e Y- eixos. Estas técnicas não pode ser utilizado para estudos de alta resolução.
Em 2014 e 2015, três artigos originais relataram diferentes métodos para imagiologia amostras de espessura 13, 14, 15. Desde então, poucos estudos têm utilizado qualquer um destes métodos para estudar amostras de espessura 33. Melhorias nos métodos ajudará a generalizar imagens através-focal em STEM. Particularmente nas ciências da vida, por meio-focal métodos precisam ser otimizados para a observação de amostras em condições criogênicas. Este é um dos principais desafios, uma vez que as amostras são criogénicosparticularmente sensível à dosagem de electrões, e por meio de métodos de focagem requerem muitas imagens.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
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