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Biology

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

Dall'inizio degli anni 1970, tomografia avvicina in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di campioni biologici 1, 2, 3. Il ricorso della tomografia elettronica a trasmissione era che potrebbe essere utilizzata per studiare una vasta gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall'architettura delle cellule e l'ultrastruttura di organelli alla struttura di complessi macromolecolari e proteine. Tuttavia, tomografia elettronica a trasmissione non può essere usato per studiare campioni molto spessi (superiore a 0,5 micron). In effetti, i campioni di spessore producono troppi elettroni sparsi, generando basso rapporto segnale-rumore (SNR) immagini. Inoltre, tomografia comporta la raccolta di immagini di campioni inclinati, con lo spessore apparente del campione aumenta con l'angolo di inclinazione. Anche se scattering anelastico può essere filtratautilizzando filtri di energia, la quantità critica di elettroni necessari per le immagini ad alta SNR è a malapena raggiunto in TEM. Quindi, campioni biologici di spessore sono stati studiati solo mediante sezionamento 4.

Alcuni campioni non possono essere tagliati: alcuni potrebbero deteriorarsi se non vengono tagliati, e gli altri devono essere studiati nella loro interezza al fine di comprendere la loro complessità. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare TEM in modalità 5, 6, 7, 8 scansione. In scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), il percorso ottico degli elettroni è diversa da quella in TEM convenzionale. Gli elettroni che passano attraverso il campione senza dispersione possono essere raccolti sull'asse ottico con un rivelatore 9 campo chiaro (BF), mentre quelli sparsi elasticamente possono essere raccolti in un certo angolo rispetto all'asse ottico con un rivelatore di campo scuro (DF).L'altro vantaggio di STEM è che il fascio elettronico focalizzato viene scansionato alla superficie del campione, consentendo la raccolta di pixel-per-pixel delle immagini. Anche se il fascio elettronico allarga mentre passa attraverso il campione 10, questo particolare sistema di raccolta è meno sensibile agli elettroni anelasticamente sparsi rispetto TEM convenzionale. Inoltre, non vi è nessun obiettivo post-campione in STEM, evitando le aberrazioni cromatiche che possono verificarsi in TEM. La lunghezza telecamera può essere regolata in modo che il rilevatore BF rileva principalmente elettroni unscattered. Utilizzando il rilevatore di DF per studiare campioni di spessore non è raccomandato a causa di scattering multiplo, che produce immagini imprecise. Invece, il rivelatore BF può essere utilizzato 11. Mentre staminali possono produrre alti immagini SNR, ha una relativamente bassa profondità di campo per la convergenza relativamente elevato fascio rispetto al TEM, diminuendo la quantità di informazioni approfondite che possono essere recuperate da spessaesemplari. Nel caso di microscopi STAMINALI aberrazione-corretto, in cui l'angolo di convergenza può essere alto come 30 mrad, la profondità di campo-può essere sufficientemente bassa in modo che le informazioni che è a fuoco proviene da un piano focale di solo pochi nanometri . Impostazione del fascio di elettroni in modo parallelo aumenta la profondità di campo del fascio di elettroni a scapito della risoluzione 12. Tuttavia, questa configurazione non è sempre possibile.

Qualora sia necessario utilizzare un fascio convergente di elettroni, si dovranno impiegare tecniche che esaltano la profondità di campo del fascio elettronico studiando campioni spessi. Recenti studi hanno riportato l'acquisizione di immagini multiple in diversi piani focali per tutto il campione di recuperare la massima quantità di informazioni di messa a fuoco 13, 14. I due studi descrivono modi diversi per gestire le informazioni dai diversi piani focali. Hovden et al.combinati nello spazio di Fourier le immagini che sono stati raccolti in diversi piani focali, e la ricostruzione finale è stato ottenuto direttamente dalla inversa 3D trasformata di Fourier 13. Al contrario, Dahmen et al. sviluppato un motore ricostruzione fascio convergente ricostruire nello spazio reale volume 3D dai vari piani focali 14. Il nostro laboratorio ha anche sviluppato un metodo per l'imaging campioni biologici spessi. La nostra strategia era diverso dai due metodi descritti in precedenza in quanto ci siamo fusi l'informazione che è a fuoco nei vari piani focali e ricostruito il volume 3D finale nello spazio reale utilizzando un proiettore fascio parallelo 15. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo che può essere facilmente eseguito in qualsiasi laboratorio di microscopia elettronica. A questo scopo, abbiamo voluto raccogliere le immagini focali in una quantità limitata di tempo, paragonabile al lasso di tempo di esperimenti tomografia convenzionali. Inoltre, il metodo proposto could essere adattato per l'uso con differenti tipi di allineamento e software di ricostruzione.

Nel contesto della nostra pubblicazione dal 2015 15, volevamo visualizzare e caratterizzare il recupero della profondità di campo, quindi abbiamo usato una grande convergenza semi-angolo di 25 mrad. Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per l'esecuzione tramite-focale di imaging in STEM secondo il metodo messo a punto nel nostro laboratorio nel 2015 15, e presentiamo come i dati a partire dal 2015 è stato elaborato. Questo metodo recupera informazioni a fuoco da diversi piani focali tutta una (750 nm) campione biologico spessore e permette ricostruzioni 3D di alta qualità. Se del caso, vengono anche presentate le differenze in questa metodologia rispetto i metodi utilizzati da altri gruppi.

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Protocol

Attenzione: consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) dei vari reagenti prima di utilizzarli. Molti dei prodotti chimici utilizzati durante la preparazione dei campioni sono tossiche, cancerogene, mutagene e / o tossiche per la riproduzione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, pantaloni full-length, e scarpe chiuse) e il lavoro sotto una cappa aspirante durante la manipolazione del campione. Sezionamento il campione con un ultramicrotomo prevede l'utilizzo di strumenti appuntiti e attento uso di questi strumenti è obbligatorio. Nei passi descritti di seguito, gli autori assumono che il campione è un campione di coltura cellulare. Il protocollo può essere necessario modificare secondo il tipo di campione, soprattutto le fasi di centrifugazione.

1. Preparazione di buffer e delle miscele

  1. Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, e 1,76 mM KH 2 PO 4).
  2. Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50% e 70% etHANOL in PBS per la disidratazione del campione. Eseguire campione disidratazione incubando gradualmente il campione in concentrazioni crescenti di etanolo.
  3. Preparare resina epossidica mescolando bisfenolo-A- (epicloridrina) (20 mL), dodecenil anidride succinica (9 mL), metil-5-norbornene-2,3-dicarbossilico (11 mL), e 2,4,6-tris ( dimetilamminometil) fenolo (0,7 mL); altri rapporti di miscelazione possono essere utilizzate a seconda della durezza desiderata della resina.
  4. Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50%, e resina epossidica 70% in etanolo per incorporamento campione. Eseguire embedding resina incubando gradualmente il campione con concentrazioni crescenti di resina.
    NOTA: I volumi delle soluzioni preparate dipendono dal tipo di campione che viene studiato. Altre soluzioni sono necessarie per tessuti che per colture cellulari.

2. Fissazione e colorazione del campione

  1. Centrifugare la coltura cellulare per 5 minuti a 5000 x g. Eseguire tutte le seguenti centrifugazioni utilizzando le stesse condizioni.
  2. Eliminare il supernatante e fissare il pellet cellulare da risospendere in PBS (1 mL) con 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2%. Incubare a temperatura ambiente per 30 min (Figura 1A). In alternativa, fissare le cellule a 4 ° C durante la notte o durante il fine settimana.
  3. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente gli agenti fissativi.
  4. Post-fissare il campione con 1% OsO 4 in PBS (1 mL) per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente i OsO 4. Disattivare la OsO 4 in olio e degli scarti.
  6. Aggiungere 2% acetato di uranile in PBS (1 mL) come agente di contrasto e incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 1B).
  7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere l'ac uranile non legatoetate; acetato di uranile contiene elementi radioattivi e deve essere smaltito in un contenitore dedicato ai rifiuti radioattivi.
    NOTA: I tempi di incubazione può essere modificato a seconda delle dimensioni del campione. Ad esempio, la fissazione e la colorazione dei campioni più spessi, come i tessuti campioni, richiedono tempi di incubazione più lunghi. tempi di incubazione più lunghi possono anche essere meglio per la disidratazione e le fasi di incorporamento. acetato di uranile può essere sostituita da una soluzione "uranile-less", che contiene sali di gadolinio.

Disidratazione 3. Campione

  1. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e incubare il campione per 30 minuti a 4 ° C in PBS (1 mL) con il 30% di etanolo (Figura 1C).
  2. Ripetere il passaggio 3.1 utilizzando soluzioni con concentrazioni progressivamente crescenti di etanolo (50%, 70%, e fino al 100%). Durante queste fasi di disidratazione, di mantenere il campione a 4 ° C per scopi di conservazione del campione.
  3. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatformica e risospendere il pellet in etanolo puro (1 ml); incubare una notte a 4 ° C.

4. Resina Embedding

  1. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in etanolo con resina epossidica 30% (1 ml) per 30 minuti a RT (Figura 1D).
  2. Ripetere passaggio 4,1 utilizzando soluzioni con concentrazioni resina gradualmente crescente epossidiche (50%, 70% e fino al 100%).
  3. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in resina epossidica pura (1 mL); incubare una notte a temperatura ambiente. La presenza di indurimento DMP-30 potrebbe innescare la polimerizzazione della resina; Se questo accade, preparare due lotti di resina epossidica, con e uno senza DMP-30.
  4. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 200 ml di resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) in una capsula di plastica; il campione deve essere in fondo della capsula in plastica.

5. Resina polimerizzazione

  1. ioncubate la capsula di plastica contenente il campione in un incubatore a 60 ° C per 48 h; altri tipi di resina possono polimerizzare con impostazioni diverse.
  2. Rimuovere la capsula dal termostato e verificare che la resina è polimerizzata; la resina dovrebbe essere difficile se premuto contro una superficie dura.
  3. Aggiungere resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) sulla parte superiore della resina polimerizzata contenente il campione; questo strato aggiuntivo di resina sarà più facile per tagliare il campione. Incubare la capsula a 60 ° C per 48 h.

Sezioni 6. Campione

  1. Montare il campione capovolto in un portacampioni in modo che il campione sia verso l'alto e fissarlo sul blocco rifilatura del ultramicrotomo. chiudere strettamente la leva per fissare il blocco di taglio al ultramicrotomo.
  2. Utilizzando una lama di rasoio o simile strumento tagliente, tagliare la capsula di plastica per separarlo dalla resina polimerizzata. Tagliare la resina in modo che il campione sia contieneed in resina o meno nella forma di una piramide. Non vi è alcuna necessità di rimuovere l'intera capsula di plastica; rimuovere solo la parte che copre il campione polimerizzato.
  3. Prendete la capsula e il titolare del campione fuori del blocco di taglio e installarli sul braccio mobile del ultramicrotomo.
  4. Installare un coltello taglio sul blocco coltello e tagliare con precisione le facce della piramide. Si consiglia l'uso di un binocolo per dare una forma perfetta alla piramide; meglio piramide, meglio sezioni saranno.
  5. Rimuovere la lama di taglio e sostituirlo con un coltello istologico che può essere usato per tagliare sezioni che sono più spessi di 0,5 micron.
  6. Dopo aver riempito la cuvetta del coltello istologico con la giusta quantità di acqua, portare il tagliente del coltello alla superficie del campione e utilizzare le binocoli per regolare l'angolo capsule passo in modo che il coltello taglierà perpendicolarmente alla piramide.
  7. Regolare la velocità di taglio secondo l'desiderataspessore della sezione per recuperare sezioni omogenee.
  8. Sia il galleggiante sezione sull'acqua e pesce con un ciclo.
  9. Spostare il loop verso una griglia di rame microscopia elettronica che è stato posto sopra la carta filtro.
    NOTA: La griglia deve essere stato precedentemente trattato per aumentare la sua idrofilia. Questo può essere eseguito con una penna grid-rivestimento.
  10. A causa di assorbimento di acqua dalla carta da filtro, lasciare che la sezione bastone alla rete. Lasciare asciugare per qualche minuto prima di inserirla nel microscopio elettronico.

7. Progettazione del Attraverso-focale Tilt-series

  1. Raccogliere immagini attraverso-focale a intervalli costanti di messa a fuoco.
    NOTA: L'inclinazione serie passante focale consiste di una serie di immagini attraverso focali che sono raccolti ad ogni angolo di inclinazione del tilt-serie. Il fuoco intero ampiezza dovrebbe essere sufficiente a coprire tutto lo spessore del campione.
  2. Determinare il valore dell'intervallo di messa a fuoco. Se l'intervallo è uguale al dapprofondito lavoro di campo, raccogliere l'intero campione a fuoco; questa impostazione rappresenta il più alto campionamento possibile. Se l'intervallo è maggiore della profondità di campo, alcune parti del campione non verranno acquisiti a fuoco, il che significa che alcune parti del campione non verranno raccolti a fuoco.
  3. Calcolare la profondità di campo di un fascio di elettroni dalla lunghezza d'onda del elettrone e la convergenza semi-angolo del fascio di elettroni. Considerando che la lunghezza d'onda di elettroni è direttamente collegato alla tensione di accelerazione, utilizzare la convergenza semi-angolo fornito dal produttore microscopio elettronico o determinare sperimentalmente dal modello di diffrazione di un campione noto 16. Poiché elettroni accelerati ad una lunghezza d'onda λ colpire il campione con una convergenza semi-angolo α in un microscopio elettronico, utilizzare la seguente equazione per determinare la profondità di campo-(DOF):

    Equazione
  4. Designla serie focale, in modo che il fuoco intero ampiezza coprirà il campione a suo spessore apparente massimo (cioè, al massimo di inclinazione).
    NOTA: Un campione micron di spessore 0,75 avrà uno spessore apparente di 2.19 micron ad una inclinazione di 70 °, quindi l'ampiezza attenzione dovrebbe essere maggiore di 2,19 micron. Per questo esempio, se l'intervallo di messa a fuoco sopra determinato è pari a 50 nm, che richiederà 44 immagini (2.19 micron / 50 nm) per coprire il campione al suo spessore massimo apparente. Il fuoco intero ampiezza è uguale al valore dell'intervallo fuoco moltiplicato per il numero di passaggi focali. Alla massima inclinazione (θ), lo spessore apparente campione è definito come segue:

    Equazione

Imaging 8. Campione

NOTA: E 'oltre lo scopo di questo protocollo per descrivere come impostare un microscopio elettronico in modalità STEM; la maggior parte di queste informazioni si possono trovare in il manuale di riferimento fornito dal produttore microscopio elettronico. Tuttavia, tenere presente quanto segue: i) la dimensione del punto deve essere scelto in base alla ingrandimento desiderato; ii) il Ronchigram deve essere ben allineato; e iii) in modalità BF, la lunghezza telecamera deve essere regolata per selezionare elettroni unscattered pur mantenendo una buona illuminazione del rivelatore. sezioni resina depositati su griglie di rame di microscopia elettronica devono essere illuminati prima di acquisizione delle immagini per evitare il restringimento. ritiro in resina e gli effetti di ricarica potrebbero essere confusi durante l'acquisizione dell'immagine. L'uso di una apertura lente obiettivo potrebbe migliorare la stabilità di esempio quando si verificano effetti ricarica. Tuttavia, nel caso specifico delle configurazioni gambo, l'apertura obiettivo non è compatibile con la modalità di imaging HAADF, e molto piccole aperture oggettivi non sono compatibili con la modalità di imaging BF.

  1. Utilizzando basso ingrandimento (circa 20,000X in STEM), sfogliare il campione e individuare la regione di interesse.
  2. regolare tha eucentrica altezza (asse Z) in modo che la regione di interesse non allontanarsi durante la rotazione del campione.
  3. Verificare che l'oggetto di interesse rimarrà visibile su tutto il campo di inclinazione.
  4. A causa del consistente numero di immagini acquisite nel corso di un passante focale tilt-serie, utilizzare un software automatico di raccolta. Utilizzare una soluzione commerciale o di progettare un software di raccolta dati personalizzati se lo si desidera. Verificare che il programma software è in grado di eseguire le seguenti tre fasi:
    1. Traccia e mettere a fuoco come in un sistema di raccolta tilt-serie standard.
    2. Assicurarsi che le immagini attraverso-focale sovrappongono con la Z-posizione del campione.
    3. acquisire automaticamente una serie di immagini attraverso focale ad ogni angolo di inclinazione.
  5. Dare il programma software i principali parametri del tilt-serie attraverso-focale (ovvero, gli intervalli di focale, passo focale, angolo minimo di inclinazione, angolo di inclinazione massima, passo inclinazione e velocità di scansione).
  6. Inizioil processo di raccolta di immagini e attendere che il programma software per terminare.

Processing 9. Immagine

NOTA: In questo protocollo, il trattamento attraverso focale tilt-serie è eseguita utilizzando ImageJ plug-17. Supplementare dei dati 1 mostra una macro ImageJ per la fase di allineamento (Turboreg) e per unire le informazioni di messa a fuoco (profondità di campo estesa) per un tilt-serie attraverso focale progettato con tre valori di messa a fuoco.

  1. Allineare le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione (ad esempio, le immagini attraverso-focale). Dal momento che le immagini non hanno le stesse informazioni di messa a fuoco, non porto le stesse caratteristiche di allineamento; eseguire l'allineamento allineando immagini adiacenti a due a due (cioè, dopo una gerarchia piramidale, con i valori di messa a fuoco più vicini prime) utilizzando Turboreg 18, un plugin ImageJ.
  2. Coerentemente verificare l'allineamento delle immagini attraverso focali ad ogni angolo di inclinazione.Stack i allineate immagini attraverso-focale per migliorare l'ispezione visiva.
    NOTA: solo la zona che è a fuoco dovrebbe muoversi durante la navigazione attraverso lo stack. allineamento accurato è la cosa più importante, poiché il passo successivo consiste nel recupero delle informazioni che è a fuoco da diverse immagini.
  3. Unire le informazioni che è a fuoco con profondità di campo estesa 19, un plugin ImageJ; questo puo 'generare una singola immagine dalla pila di immagini. Diverse impostazioni possono essere utilizzati durante il recupero della profondità di campo, ma utilizzano le impostazioni più alte per preservare le informazioni dell'immagine.
    NOTA: L'inclinazione-serie è ora composta da una singola immagine per angolo di inclinazione, ogni immagine contenente le informazioni in-focus recuperato dalle immagini attraverso focali.
  4. Elaborare i dati.
    NOTA: Gli strumenti standard per l'allineamento e la ricostruzione può essere utilizzato in quanto i dati ora è stato ridotto a un tilt-serie standard. In questo protocollo, TomoJ noi èEd per l'allineamento dei dati e la ricostruzione dei dati 20, 21. Maggiori informazioni su come utilizzare TomoJ possono essere trovati nella pubblicazione originale 22.
  5. Eseguire bene allineamento del tilt-serie.
    NOTA: Una buona strategia è quella di utilizzare oro perle come marcatori fiduciali di monitorare con precisione spostamenti tra le immagini. minimi locali può essere utilizzata anche se perline oro non possono essere aggiunte al campione.
  6. Eseguire una ricostruzione in 3D dei dati allineati; diversi algoritmi sono disponibili per eseguire le ricostruzioni nello spazio reale o spazio di Fourier, ciascuno con vantaggi e limitazioni.
  7. Se l'allineamento finale del tilt-serie è povero, apportare alcuni miglioramenti, ottimizzando le fasi iniziali. Ribadire le fasi di allineamento se la ricostruzione 3D finale appare sfuocata o deformata; in pratica, maggiore è il numero di piani focali raccolti, migliore è il contrasto e dettagli della ricostruzione 3D.
    NOTA: Seprogrammi software veral possono essere utilizzati per elaborare il passante focale tilt-serie. Tuttavia, gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono stati scelti perché, nella nostra esperienza, si sono esibiti i migliori. Turboreg 18 risultati migliori in termini di allineare le immagini quando un gradiente di concentrazione era presente. Maggiori informazioni possono essere trovate sul sito dedicato 23. La profondità di campo estesa plug-19 è comportato molto bene in termini di recupero delle informazioni di messa a fuoco da diverse immagini, mentre altri strumenti provocato pixel visibili modifiche. Maggiori informazioni, soprattutto per quanto riguarda la scrittura di script, si possono trovare su questo sito web dedicato 24.

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Representative Results

Nel nostro studio, gli elettroni sono stati accelerati a 200 kV nel microscopio elettronico a trasmissione pistola emissione di campo. Le immagini sono state raccolte in modalità STEM BF utilizzando un tempo di sosta di 20 ms. Per quanto riguarda il disegno del tilt-serie passante focale, abbiamo riscontrato che gli intervalli di messa a fuoco di 150 nm hanno dato risultati soddisfacenti per lo studio ultrastrutturale di un campione, anche se la profondità di campo-del fascio di elettroni è stato solo 750 nm di spessore biologica 3 nm-dato che abbiamo usato una convergenza molto ampia semi-angolo di 25 mrad.

Il campione analizzato in questo rapporto è Trypanosoma brucei, un eucariote unicellulare cui flagello è intensamente studiato, perché questo organello è notevolmente conservata da protisti ai mammiferi 25. Le cellule sono state trattate come presentato nel protocollo di preparazione del campione, e ci siamo concentrati l'analisi strutturale sulla tasca flagellare di T. brucei ( (Figura 2B, C, e D). Sulle immagini raccolte, la zona che è a fuoco appare sottile, e la maggior parte di questa immagine è sfocata a causa della profondità di campo-limitata. La fusione delle informazioni di messa a fuoco viene eseguita sulle immagini raccolte e produce una singola immagine, dove la zona di messa a fuoco è molto più ampio (Figura 2E).

La fusione delle informazioni di messa a fuoco può essere meglio visualizzati evidenziando le aree ad alta frequenza delle immagini di inclinazione della serie attraverso-focale (pixel bianchi in figura 2F, G e H). Il comando ImageJ "Trova bordi" noi eraDE al presente studio. Questo comando utilizza un filtro Sobel per rilevare i cambiamenti di intensità dei pixel adiacenti. Lo spostamento della zona alta frequenza rilevata può essere osservato da un'immagine all'altra. Sull'immagine cui le informazioni di messa a fuoco è stata unita, le alte frequenze coprono la maggior parte dell'immagine (Figura 2I). Questo metodo permette la verifica della buona elaborazione del passa-focale tilt-serie.

Utilizzando attraverso focale tilt-serie, in più le informazioni di messa a fuoco viene raccolta e utilizzata durante il processo di ricostruzione in 3D. Questo produce un maggiore contrasto e SNR e riduce gli effetti di sfocatura osservati nelle ricostruzioni 3D di profondità di campo-limitata immagini 15. Nello spazio di Fourier, informazioni aggiuntive viene recuperato rispetto ad un sistema di raccolta tilt-serie classica, dove solo sul piano focale vengono raccolte 13. Nel complesso, la qualità in tutta la 3ricostruzione D è più isotropo rispetto ad un classico schema di raccolta tilt-serie.

Figura 1
Figura 1: Immagini presentano le diverse fasi del protocollo di preparazione campione biologico. Il protocollo di preparazione del campione può essere diviso in quattro fasi principali. Il campione è A) fissato in paraformaldeide e glutaraldeide, B) post-fissati in tetrossido di osmio e contrastato con acetato di uranile, C) disidratati in etanolo, e D) incorporato nella resina. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Verifica del recupero di profondità di campo. Il recupero della profondità di campo-può essere verificata su immagini di un campione inclinato. A) a 0 ° di inclinazione, diversi dettagli possono essere osservati nella tasca flagellare (Bandiera tasca) della cellula T. brucei resina-embedded. La tasca flagellare si trova nel citoplasma (Cyt), e basale corpo (BB) àncora il flagello (Flag) alla membrana flagellare. B, C, e D) Tre immagini della stessa tasca flagellare, inclinato di 70 ° nel microscopio elettronico, sono stati acquisiti. Sono stati raccolti ad intervalli di messa a fuoco di 300 nm. E) Questa immagine è stata generata dalla profondità di campo estesa ImageJ plug-in e contiene le informazioni di messa a fuoco di B, C, e D. F, G, H e I) Queste immagini sono state calcolate con il comando "Trova bordi" in ImageJ al fine di Highlight l'informazione ad alta frequenza contenuta in B, C, D, ed E, rispettivamente. I pixel bianchi rappresentano le alte frequenze, corrispondenti alle informazioni di messa a fuoco. La barra della scala è di 250 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Supplemental file 1. Clicca qui per scaricare il file.

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Discussion

In questo articolo, vi presentiamo un protocollo convenzionale preparazione del campione insieme a una guida passo-passo per l'esecuzione di analisi 3D su campioni biologici spessi usando STEM attraverso focale tomografia. Resina incasso di campioni biologici è stato utilizzato per decenni 26 e protocolli alternativi che si adattano a diversi tipi di campioni si trovano in tutta la letteratura 27. Al contrario, di imaging campioni spessi in staminali utilizzando metodi attraverso la messa a fuoco è una nuova impresa, ei metodi molto probabilmente essere migliorata in quanto diventa più diffuso.

Lo scopo di questo lavoro è di descrivere un protocollo di preparazione del campione e, più in particolare, le condizioni di imaging per eseguire attraverso focale acquisizione tilt-serie nel fusto con apparecchiature che è attualmente disponibile e in un ragionevole lasso di tempo. Per questo motivo, sono stati usati intervalli fuoco grandi. Infatti, non vi è consenso su come chiudere lapiani focali dovrebbero essere per l'imaging una spessa esemplare con stelo tramite focale tilt-serie. Di solito ci vogliono fino a diversi secondi per raccogliere le immagini STEM, e un intero convenzionale tilt-serie può richiedere ore per completare. Come prova-of-concept, è possibile raccogliere centinaia o anche migliaia di immagini. Tuttavia, è chiaro che i tempi lunghi di raccolta non sono adatti per l'uso quotidiano. stabilità del fascio e la deriva campione devono essere presi in considerazione quando si progetta tali esperimenti lunghi. Inoltre, tempi di incasso lunghi sollevano la questione della dose di elettroni accumulati. Così, per il momento, STELO attraverso focale tilt-serie è adatta solo per lo studio dei campioni fascio resistenti, quali campioni biologici resina incorporato o materiali inorganici, soprattutto a causa della notevole dose di elettroni richiesto. A causa del trade-off tra tempo di acquisizione e la qualità della ricostruzione finale in 3D, si consiglia di utilizzare alcuni intervalli attraverso focale nei progetti in cui non è richiesta alta risoluzione, unND si consiglia di utilizzare una maggiore quantità di intervalli attraverso focale nei progetti in cui è richiesta alta risoluzione.

Vi è una mancanza di consenso sui passi specifici in questo metodo a causa della sua novità. Tuttavia, è chiaro che diversi passaggi sono critici per ricostruzioni alta qualità da STEM attraverso focale set di dati tilt-serie. Innanzitutto, l'allineamento delle immagini focali ad ogni angolo di inclinazione deve essere ben eseguita, come sottolineato nelle tre articoli originali descrivono passante focale raccolta di immagini 13, 14, 15. Anche se le immagini raccolti a vari valori focali non condividono informazioni comuni, Turboreg rimane una buona soluzione per la precisione, allineamento automatico delle immagini. In secondo luogo, la fusione delle immagini focale, come eseguito in questo protocollo, ha il vantaggio di generare una singola immagine per angolo di inclinazione, che è facilmente da qualsiasi inclinazione serie allineamentomento e il programma di software di ricostruzione 3D. La profondità di campo estesa plug-in è stato inizialmente progettato per le immagini di microscopia di luce; tuttavia, sembra essere la soluzione migliore per unire le informazioni a fuoco da micrografie elettroniche 28. Una soluzione alternativa è quella di considerare l'intero set di immagini come un unico tilt-serie di dati con diverse immagini al angolo di inclinazione, in modo simile a quanto fatto da Hovden et al. 13 e Dahmen et al. 14. Ciò richiede l'uso di algoritmi di ricostruzione Fourier basati 13 o Ettention, che è stato sviluppato da Dahmen et al. 29 e che è l'unico software di ricostruzione 3D in grado di ricostruire i volumi 3D da immagini raccolte in vari valori focali nello spazio reale. In particolare, tali soluzioni alternative richiederanno un passo ulteriore allineamento nella direzione focale (asse Z), ciò potrebbe produrre resu confusioneLTS che sono in contrasto con gli intervalli di sfocatura scelti durante la raccolta di immagini, come discusso in Dahmen et al. 14. La fusione delle informazioni a fuoco, come presentato in questo protocollo, ha il vantaggio di generare un'immagine come se i dati sono stati raccolti usando un parallelo, evitando così la fase di allineamento supplementare in direzione Z.

Attraverso-focale sono stati sviluppati metodi di inclinazione della serie di studiare campioni di spessore (circa 1 micron). Il limite principale di questi metodi è che essi non possono essere utilizzati per studiare i campioni spessi di alcuni micron, in quanto il fascio di elettroni non può penetrare tali campioni. Questa limitazione deriva dal cammino libero medio degli elettroni, che dipende dalla tensione di accelerazione. Anche se molto alta tensione (cioè, 1,000 kV) microscopi elettronici possono essere utilizzati per l'imaging cellule eucariotiche 30, campioni molto spesse richiedono ancora l'impiego di altre tecniche, come focused fascio ionico o seriale blocco faccia microscopia elettronica a scansione 31, 32. Tuttavia, questi metodi generano ricostruzioni anisotrope che possono essere considerate pile di immagini perché l'asse Z, che è definita come la profondità di taglio del metodo, non è equivalente alla X- assi Y-. Queste tecniche non possono essere utilizzati per studi di alta risoluzione.

Nel 2014 e nel 2015, tre articoli originali riportati diversi metodi per campioni di imaging di spessore 13, 14, 15. Da allora, solo pochi studi hanno utilizzato uno di questi metodi per studiare campioni di spessore 33. I miglioramenti nei metodi aiuteranno generalizzare immagini attraverso-focale in STEM. In particolare, nelle scienze della vita, attraverso la focale metodi devono essere ottimizzate per l'osservazione di campioni in condizioni criogeniche. Si tratta di una sfida importante, dal momento che i campioni criogenici sonoparticolarmente sensibile alla Electron dosaggio, e metodi, attraverso la messa a fuoco richiedono molte immagini.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

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References

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Biologia Cellulare Numero 121 tomografia elettronica microscopia a scansione elettronica a trasmissione campione biologico di spessore, La profondità di campo attraverso la focale tilt-serie
Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia
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Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

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