Summary
ここでは、 インビボでのブタの腰椎モデルを用いて経椎骨のネジを評価する方法を紹介する。
Abstract
椎弓根スクリュー固定は、脊髄疾患の処置のためのゴールドスタンダードです。しかし、脊髄手術後の茎ねじ緩みの問題が多くの研究によって報告されており、これは深刻な問題である。この問題に対処するために、様々なタイプの椎弓根スクリューを検査し、脊椎骨における良好な固定強度および骨結合を有するものを同定した。ブタの脊椎は、解剖学的サイズ、機械的特性、およびコストのために椎弓根スクリューの評価における人間の背骨のための良い選択肢です。いくつかの研究では、椎弓根スクリューはブタモデルにおいて効率的であると報告されているが、ブタモデルを用いた椎弓根スクリューの評価のための詳細なプロトコールは記載されていない。ここでは、インビボブタ腰椎モデルを使用して経椎骨ねじを評価するための詳細な方法を説明する。ここで提供される麻酔、背骨手術、収穫の技術的な詳細は、ranspedicularスクリュー固定モデル。
Protocol
全北国立大学法人化審査委員会がこの研究を承認した。動物の治療、使用、取り扱いは、すべてのガイドラインとポリシーに従った。 24℃で手術室を維持する。
1.麻酔
- 少なくとも1週間、実験単位で12カ月齢の小型ブタを順化させる。呼吸数、心拍数、体温を測定する臨床検査を行う。麻酔処置の12時間前に各小型豚に餌を与えないでください。
- 前投与のために、耳の後ろ側の子宮頸部筋領域にアトロピン（0.05mg / kg）およびケタミン（20mg / kg）/キシラキシン（2mg / kg）を注入する。
- 鎮静後、耳の根元にゴムバンドをしっかりと掛けて、局所アルコールで耳をきれいにしてください。
- オーバー・ザ・ニードルのプラスチックカテーテルを耳静脈に置き、ゴムバンドを外す。カテーテルが正しく配置されていることを確認します。インフルエンザカテーテルをヘパリン処理した生理食塩水で洗浄し、テープで固定する。
- 気管内挿管のために、小型豚を胸骨の臥位に配置する。アシスタントの助けを借りて、適切なスリングで豚の顎を持ち、口を開ける。
- 喉頭鏡の先端を咽頭腔に通して、喉頭蓋を軟口蓋から押し退ける。喉頭鏡の先端を使って声帯を見えるようにし、呼気中気管内チューブを気管に進める。
- 適切な挿管のための空気の自由な通過を感じ、ミニブタの左右両側の呼吸音の胸部聴診を確認する。
- 10 mLの注射器を使用して気管内チューブの空気の適切な容量の空気でカフを満たし、接着テープを使用してチューブをスナウトに固定する。
- 長期間の麻酔のための吸入麻酔剤であるイソフルラン2.0％濃度をエンドトールを通して提供する痛みのある挿管。角膜および眼球の反射を検査して麻酔を確認し、眼に軟膏を使用して乾燥を防ぐ。
- ミニブタが回復するまで少なくとも5分ごとに麻酔中の心臓血管系、呼吸器系および体温を監視する。
- 脊髄手術の30分前に、セファロスポリン抗生物質の第1世代であるセファゾリンIVを30mg / kgでゆっくりと投与する。
- 恒常性を維持するためにIVラインを用いて5〜10 mL / kg /時の温（37℃）生理食塩水を投与し、痛みを抑制するために50μg/ kg /分のフェンタニルを投与する。
- 脊椎手術の後、強い嚥下反射が明らかな場合には抜管を行う。
- ミニ豚を部屋に持ち込み、麻酔から回復するまでモニターします。ミニブタが完全に意識しているときには、食べ物と水を提供してください。
- 最初の3日間の疼痛管理のために、毎日4.4mg / kgのカルプロフェンを含む3mg / kgのエンロフロキサシン抗生物質を適用する。
- Moni縫合糸が取り除かれるまで毎日ブタを服用してください。
2.脊椎手術
- 製造業者のガイドラインに従って、透過性スクリューおよび後固定器システムをオートクレーブして滅菌する。
- ブタが仰臥位にある間にシェーバーを使用して、中央から左または右に約10cmの小型ブタの背部を剃る。ポビドンヨード溶液と70％アルコールで皮膚を洗浄する。
- メスを使用して、腰椎の第2の棘突起から第1の正中仙骨紋に縦中心線切開を行う。皮下組織および筋膜を棘突起の先端まで解剖する。
- Cobbエレベーターを用いて、下層の小層から傍脊髄筋を腹膜下に上昇させる。棘状突起に沿って解剖し、椎弓板を椎間関節に限定する。
- エントリーポイントの表在皮質を開く（これはL3から哺乳類のプロセスにちょうど劣る）両側のL5まで）にバリまたはロングガールを付けます。
- ガイドピンを開いた場所、上端板と平行に、棘突起に対して20°の角度で挿入します。 Cアームまたはポータブルポストロ - 前方/側方X線を使用して理想的な出発点を定義します。
- X線に従ってペディクルプローブを最大25 mm挿入します。椎弓根の鳴動装置を用いて、椎弓根および体の触診によって完全な骨内軌跡を確認する。
- 準備されたL3〜L5の椎弓根に6つの椎弓根スクリューを差し込み、ネジ頭がしっかりと固定されるようにします。インプラントヘッドの側面開口部を所望の方向に向け、水平位置をロッド軌道と整列させる。
- 茎ネジ頭の両側にそれぞれ2本のロッドを挿入します。ユニバーサルハンドルを使用してペディクルスクリューヘッドのスリーブとナットを入れます。
- ストレートソケットレンチを使用してナットを緩く締め、カウンタートルクレンチを使用してナットをしっかり締めます。
- ポジションを確認するポータブルな前後前後のX線を使用した茎ねじ。
注：ミニブタが目を覚ますのを待って、後ろ足の歩行パターンと運動機能をチェックして、ねじがひどく植え込まれているかどうかを判断します。 - 吸引を伴うバルブ洗浄シリンジを使用して、手術部位を通常の生理食塩水3Lで灌注する。
- 手術部位にシリコーンを流し、シリコンチップを取り出します。 1.0メートルの吸収可能な縫合糸を用いて、傍脊髄の筋肉および皮下を閉じる。非吸収性ナイロン縫合糸2.0メートルで皮膚を閉じます。
- ポビドンヨードで縫合部位を消毒し、滅菌ガーゼおよびテープを用いて包帯を適用する。
収穫手続き
- 術後12週目に、キシラジン（2mg / kg）およびケタミン（10mg / kg）を耳の後ろ側の子宮頸部筋領域に注射し、前投薬する。
- 鎮静後、耳静脈に直接15mg / kgのKClを投与する安楽死のためのカテーテル。
- 以前の手術瘢痕病変で縦中心線切開を行う。軟組織と傍脊髄の筋肉を解剖する。
- 腰椎、薄層板、ロッド、ナット、および横断プロセスの棘突起をL3からL5に露出させる。
- カウンタートルクレンチとロッドを使用してナットを取り外します。振動刃を使用して、L2-3ディスクスペースとL5-S1ディスクスペースをカットします。
- コブエレベーターとタワー鉗子でL3-5脊柱の中部と前部の両側を解剖する。収穫後、直ちに脊椎を検査することができない場合は、食塩水を浸したガーゼで包んで-20℃で保存する。
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Representative Results
インビボでのブタの腰椎モデルを用いた経椎間膜スクリューの評価のための麻酔、手術、および収穫の詳細なプロトコールをここに記載する。このプロトコルは、機械的試験（ 図1 ）、定量的マイクロCT評価（ 図2 ）、および組織学（ 図3 ）を含む多くの下流分析に適しています。代表的な機械的試験（ 図1 ）は、平均抽出ねじりピークトルクを示す。これは、機械的試験ゲージを使用して、茎ねじと骨との間の結合強度を表す。 3つのタイプの椎弓根スクリューが評価された：未被覆、ヒドロキシアパタイト（HA）被覆、およびチタン被覆。データは、3つの群のそれぞれからの14の椎弓根スクリューから収集した。平均抽出ねじりピークトルクは、チタン被覆椎弓根スクリュー群で大きかった。
図2A ）は、関心のある領域（スクリューの全長の内部空間）が、骨の分析のためのマイクロCTプログラムによって評価され得ることを実証している（ 図2B1 ）、骨の表面密度（ 図2B2 ）、および特定の骨の表面（ 図2B3 ）を含むが、これらに限定されない。データは3つの群のそれぞれからの4つの茎ネジから収集した。
代表的な組織像（ 図3 ）をGoldner trichromeで染色した。椎弓根スクリューと骨との間の境界面が観察された。赤色は線維組織を示し、青色は骨を示す。被覆されていない椎弓根スクリューでは、椎弓根スクリューと骨との間の界面に繊維組織が観察された。 HAおよびチタンコーティングされた椎弓根スクリューおよび骨の両方のねじの間の界面に新しい骨形成が見られた。その中で骨をネジで締め付け、ネジのネジ山と骨との間の空間を骨で圧縮した（ 図3 ）。
図1：豚の腰椎の茎ねじの機械的解析椎弓根スクリューと骨との間の結合強度の平均抽出ねじりピークトルクを機械的試験ゲージで測定した。参考文献6から変更。値は、平均±SEM（ n = 14）として示される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2. Pにおける茎ねじの組織形態分析orcine腰椎。 （ A ）手動の関心領域（ROI）は、ねじの全長の内部空間に設定した。 （ B ）マイクロCTを用いて、骨体積率、骨表面密度、および特異的骨表面積を測定した。参考文献6から変更。値は、平均±SEM（ n = 4）として示される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：ブタ腰椎における茎ねじの組織学的分析。椎弓根スクリュー表面と骨との間の界面を観察するためにGoldner trichrome染色（x1、x20、およびx40）を行った。参考文献6から変更。スケールバー（黒）= 1 mm。スケールバー（white）=500μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ブタ背骨における経直腸スクリューの評価は、多くの時間と労力を必要とする。まず、ミニブタは大きな動物です。動物のケアと麻酔については、研究者は特別なプロトコルが必要です。第二に、手術は人間の手術と同様の環境を維持すべきである。ブタ背骨の椎弓根スクリューを評価する目的は、ヒトに適用できる効率的なスクリューを開発することです。第3に、経直腸ねじの長期安定性を評価するには、背骨手術の約3ヶ月後が必要です。したがって、椎弓根スクリュー固定の分野の研究者は、正確な計画を実行することによってプロトコルを標準化する必要がある。脊椎モデルの椎弓根スクリューに関する多くの研究が9,10,11で行われているが、インビボブタ腰椎を用いた経椎骨ネジの評価のための詳細なプロトコールは提供されていないパインモデル。
人間の背骨の理想的なモデルは存在しませんが、ブタの背骨モデルは、この実験の性質、および背骨の解剖学的サイズおよび機械的特性のために代替物です。さらに、それは比較的安価である。 McLain et al。ヒト、ブタ、ヒツジ、ヒツジ、およびイヌの標本から4番目の腰椎の形態計測を比較し、ブタの標本はヒトの背骨の代替として他の動物モデルに比べていくつかの利点を示すと結論づけた。さらに、ブタモデルの四足脊椎は、本質的にヒトの背骨8と同じ方法で装填される。したがって、ブタの背骨は、脊椎固定および計測技術を伴う実験のために、人間の背骨の代替モデルとして使用される。
この研究では、麻酔、手術、収穫の詳細な方法を茎ねじ固定の評価のためのブタL3-L5腰椎。多くの研究では、多段階背骨手術の後に椎弓根スクリューを評価している7,13,14。ヒトの変性疾患の多くの場合において、背骨手術は、1つまたは2つの背骨融合によって行われる。これは、2つまたは3つの背骨レベルの茎ネジが固定15に使用されることを意味する。茎ネジの周りの骨形成の評価のためのマイクロCTは、限られた測定範囲を有する。この場合、L3椎弓根には2本の制御ねじ、L4椎弓根には2本のHA被覆ねじ、L5椎弓根用には2本のチタン被覆ねじを使用しました。 L3-L5腰椎の解剖学的寸法はほぼ同じであるため、L3-L5ねじの比較は複数のレベルのねじの比較よりも信頼性が高い。その結果、縫い目内の茎ネジの2つまたは3つのレベルの固定複数レベルの固定と比較してより適切である。
経皮スクリューを正確に評価して比較するには、1つの重要な点に留意する必要があります。各スクリューは、椎体の同様の位置に配置する必要があります。しかし、動物モデルでは、経椎骨ネジを移植するためのプロトコルの大部分は、椎弓根スクリュー5,13,14を挿入する前に、脊柱の茎を露出させ、あらかじめ穿孔する必要がある。一方、Upasani らは、脊柱2のコンピュータ断層撮影画像を使用することにより手術前に椎弓根スクリューの位置およびサイズを決定することを含む外科的プロトコルを提案した。このプロトコルは、腰椎の椎弓根スクリューの入口点にガイドピンを挿入することを示唆している。 CアームまたはポータブルX線を使用して茎ねじの位置を定義することも、このプロトコル。さらに、椎弓鳴装置を使用することにより、完全な骨内軌道を確認することができる。このプロトコルは、椎弓根の誤配置が防止されるように、茎ねじの適切な位置決めを決定するために使用することができる。このプロトコルは、私たちの病院で使用されている人間の背骨の手術技術に基づいています。
この方法にはいくつかの制限があります。まず、健常なブタモデルを用いて手術を行った。椎弓根スクリューを評価する目的は、骨粗鬆症患者の合併症を軽減することであるため、椎弓根スクリューの有効性を実証するために、このプロトコルを骨粗鬆症ブタ背骨モデルに適用する必要があります。第2に、ブタ背骨モデルは、ブタのための外科器具と同様に、購入および収容を必要とする。これはコストを増加させ、各研究グループで使用できる動物の数を制限する可能性があります。第三に、この研究では、12ヶ月齢の小型豚が含まれていたのは、e取得し、処理するasy。さらに、背骨固定のためのいくつかのタイプの装置があるが、脊椎手術で最も一般的に使用されるので、剛性固定システムを使用するプロトコルのみがここで使用された。
結論として、椎弓根スクリュー固定のブタモデルは、骨粗鬆症患者の合併症をより少なくする効率的な固定技術を調査するための重要な臨床プラットフォームを提供します。このプロトコルは、麻酔、手術、およびブタの腰椎モデルにおける収穫に関する技術的詳細を提供する。これにより、このモデルを用いた経椎骨固定の評価が容易になる。
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Disclosures
著者らは、この論文に関連するものは何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、韓国の全北大学病院生物医学研究所（CNUH-BRI）の資金提供による助成金（CNUH-BRI-2012-02-005）によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miniature pig | OrientBio | ||
| Atropine | Jeil pharmaceutical | A04900241 | Anesthesia |
| Over-the needle plastic catheter | BD | REF382412 | Maintenance of IV line |
| Ketamine | Yuhan | A04502441 | Anesthesia |
| Xylazine | Bayer Korea | A00800071 | Anesthesia |
| Laryngoscope | Karl storz | Intubation | |
| Endotracheal tube | Covidien | Intubation | |
| Isoflurane | JW pharmaceutical Co | A02104781 | Anesthesia |
| Eye ointment | Hanlim pharma | A37851721 | Protection of pig's eye |
| Cefazolin | Donga pharma | A01503951 | Antibiotics |
| Saline | JW pharmaceutical Co | A02151392 | Maintenance of fluid homeostasis |
| Fentanyl | Hana pharm | C03200032 | Pain control |
| Enrofloxacin | Bayer | 93106-60-6 | Antibiotics |
| Morphine | Myungmoon pharma | C03700091 | Pain control |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | A07600711 | Antibiotics |
| Povidone-iodine | Hyundai pharma | Wound dressing | |
| Scalpel blade size 15 | Braun | I1 BB515 | Skin incision |
| Cobb elevator | Codman | 65-2546 | Dissection of muscle |
| Burr | Medtronic | Making of starting point of screw | |
| Rongeur | Aesculap | FO515R | Making of starting point of screw |
| Guide pin (K-wire) | CE | 01067803 | Guidance of screw trajectory |
| C-arm | GE | OEC 9800 plus | Guidance of screw trajectory |
| Portable X-ray | Siemens | Mobile XP hybrid | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle probe | OtisBiotech | SPI-02-01 | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle sounding device | OtisBiotech | SPI-03-01 | Guidance of screw trajectory |
| Pedicle screw | OtisBiotech | MS-40025 | |
| Posterior fixator systems | OtisBiotech | ||
| Rod | OtisBiotech | ROD-60140 | Rigid fixation between screws |
| Universal handle | OtisBiotech | SPI-08-01 | To fix the screws to the rod |
| Straight socket wrench | OtisBiotech | SPI-06-01 | To fix the screws to the rod |
| counter torque wrench | OtisBiotech | SPI-07-01 | To fix the screws to the rod |
| Bulb irrigation syringe | Hyupsug medical | HS-IR-140 | Irrigation |
| Silicone drain | Sewon medical | 2205-006 | To drain the fluid at the surgical site |
| 3.0 metric absorbable suture | Ethicon | BA1673H | Muscle suture |
| 2.0 metric nonabsorbable nylon suture | Ethicon | W1626T | Skin suture |
| Gauze | Kingphar Korea | KP120-06 | |
| Pentobarbital | Hanlim pharma | 645301221 | Euthanasia |
| Oscillating saw | Zimmer | Harvest spine | |
| Tower forceps | Aesculap | BF461R | Harvest spine |
References
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