Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at isolere rygmarven samt at identificere og isolere DRG 1, 2. Hydraulisk ekstrudering af rygmarven er en betydeligt hurtigere metode end den traditionelle måde at rygmarven isolering ved laminektomi, dvs ved at bryde ryghvirvlerne en ad gangen, og denne fremgangsmåde reducerer risikoen for vævsskader forårsaget af dissektion proces 3, 4 . DRG kan være vanskelige at identificere. Korrekt identifikation er meget vigtigt for væv analyse, fx efter iskiasnerven skade. Ved nummerering af DRG efter deres lokalisering i forhold til costae, kan DRG identificeres konsekvent.
Væv isoleret ved de teknikker påvist her, kan anvendes til en bred vifte af analyser herunder Western blotting 5,6, qPCR 7 og immunhistokemisk farvning 8.
Ved identificeringen DRG, er det vigtigt at tage hensyn til, at antallet af rygmarv segmenter vides at variere med dyrets art og stamme 9, 10, 11. Fordelene i udøvelse af denne fremgangsmåde i mus er det store antal genetisk modificerede varianter til rådighed, og de relativt lave boligudgifter. Fordelene ved at anvende rotter er den relativt høje væv udbytte og hvis der involverer nerveskader, vil proceduren blive lempet med størrelse.
Protocol
Alle dyr blev håndteret i fuld overensstemmelse med danske og europæiske regler. Tilladelse nummer: 2012-15-2934.
1. Forberedelse af Sprøjte til Hydraulisk Ekstrudering af rygmarven
- For en voksen rotte, bruge en 10 ml sprøjte. For en voksen mus, brug en 5 ml sprøjte. For hvalpe, bruge en 2,5 ml sprøjte.
- Juster en ikke-filter pipettespids universelt egnet til 2-200 pi pipetter ved at trimme den store ende af pipettespidsen, indtil den sidder fast på sprøjten. Placer den justerede pipettespidsen på sprøjten. For hvalpe, bruge en 23 G eller lignende nål i stedet for en justeret pipettespids.
- Aspirer iskold sterilt PBS og efterlade sprøjten på is indtil videre anvendelse.
2. Eutanasi
- Udfør ikke cervikal dislokation, da dette vil forstyrre spinal ryghvirvler umuliggør ekstrudering.
- For voksne rotter / mus, aflive bruge gas, såsom CO2 eller isofluRane. Disse stoffer er skadelige. Udfør eutanasi i et stinkskab og håndtere stoffer i henhold til institutionens retningslinjer. (ADVARSEL: CO 2: H280, P410, P403, isofluran: H361d, P260, P281, P280)
- For at sikre at gnaveren er død, sikre fravær af refleks ved at klemme en pote med en pincet. Halshugge gnaveren hjælp af store saks. For hvalpe, aflive ved halshugning.
3. Isolering af rygsøjlen
- Drys vand på pelsen at styre håret.
- Ved hjælp af en saks, skåret åben pelsen langs rygraden i en distal retning og isolere rygsøjlen ved at skære på begge sider langs rygraden forbi skinkeben. Skær rygmarven distalt til skinkeben med en saks.
BEMÆRK: rostralt-caudale akse betegnes som den proksimale-distale akse hele protokollen.- Trim rygsøjlen ved anvendelse af en saks for at undgå proximal-fleste og mest distale områder, da disse kan gøre rygsøjlen for S-formet for vellykket rygmarv ekstrudering. Sikre, at rygmarven er synlig i begge ender. Hvis rygmarven er ikke synlig, trim rygsøjlen med en saks indtil rygmarven bliver synlig.
4. Hydraulisk Ekstrudering af rygmarven
- Placer en petriskål (100 mm i diameter) fyldt med sterilt PBS på is.
- Ret rygsøjlen ved anvendelse af et indeks finger på den bøjede del (mest proksimal ende) af rygsøjlen, hvorved glatning rygsøjlen så meget som muligt.
- For hvalpe, undgå at bøje rygsøjlen, som hvirvlerne vil blive forstyrret umuliggør rygmarv ekstrudering.
- Sæt pipettespidsen (23 G nål til hvalpe, alternativt 18 G nål til voksne mus) på mest distale ende af rygsøjlen. Hvis indsat korrekt, er spidsen stabiliseret i spinal hulrum.
- Sikre, at rygraden rettes ud så meget som muligt. Påfør jævnt tryk, og ekstrudere rygmarven i petriskålen på is. Sørg for, at rygmarven holdes fugtig på is ved at holde det i PBS indtil videre håndtering.
Figur 1: Repræsentative rygmarv. Hydraulisk ekstruderet rygmarv. Fra venstre mod højre: voksne rotter, voksen mus, mus hvalp. Lumbale udvidelser præget af kassen. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Identifikation af dorsalrodsganglier (DRG)
- Split rygsøjlen i to lige langsgående dele med en saks og placere split rygsøjlen under mikroskopet.
- Identificer T13 ryghvirvel segment ved lokalisering fastgørelsesstedet af mest distale costae på rygsøjlen opmærksom på ikke at forveksle costae med de nærliggende interkostale nerver. De mest distale costae er fastgjort til den proximale del af T13 ryghvirvel segment og det T13 DRG ligger distalt til ryghvirvel T13 og proximalt til hvirvel L1.
- Identificer samtidige DRG i den distale retning. For en voksen rotte, samtidig DRG synes hvid med klart synlige dorsale og ventrale rødder. For en voksen mus, samtidig DRG synes hvid med klart synlige dorsale og ventrale rødder. For hvalpe, samtidig DRG vises som klare kugler.
Figur 2: Identifikation af DRG i rygsøjlen efter ekstrudering af rygmarven. Rygsøjlen er blevet delt tillader visualisering af DRG som angivet ved pile. Eksemplificeret ved voksne rotter og mus hvalp. ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Isolering af DRG
- Antal petriskåle (30 mm i diameter) i henhold til de specifikke DRG skal isoleres, f.eks L3, L4, L5. Fyld petriskåle med iskoldt sterilt PBS og placere dem på is.
- Brug mikro saks, skære dorsale og ventrale rødder så tæt på DRG som muligt for at frigive dem samtidig undgå at beskadige DRG.
- Med spidsen af lukkede pincet, forsigtigt øse ud DRG og overføre dem til de tilsvarende nummererede petriskåle.
Figur 3: Repræsentant isoleret DRG. Fra venstre mod højre: voksne rotter, voksen mus, mus hvalp."_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
7. Behandling af væv til yderligere analyse
- Western blotting
- Isolere væv interesseområde, fx rygmarv lumbale udvidelsen. Hvis det er nødvendigt, adskille rygmarven i ipsilaterale og kontralaterale sider og videre ind dorsale og ventrale horn.
- Placer vævet i lysepuffer såsom TNE lysepuffer (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 i dobbelt destilleret H2O) indeholdende passende enzyminhibitorer på is.
- Homogenisere vævet i ca. 30 s på is under anvendelse af en mekanisk slibning støder.
- Centrifuger i 15 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C og anvende supernatanten til videre behandling i overensstemmelse med standardprotokoller 5, 6 eller beholde supernatanten ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
- RNA-analyse
- Isolere vævet af interesse.
- Anbring straks væv i RNA stabilisering løsning til at stabilisere RNA til opbevaring.
- Isolere RNA i overensstemmelse med standardprotokoller 7.
- Konvertere RNA til cDNA og udføre qPCR overensstemmelse med standardprotokoller 7.
- immunhistokemi
- For frisk frosset væv (gælder for rygmarven):
- Forbered tøris pulver ved pulverisering tørre isterninger til et beløb svarende til to spiseskefulde pulver. Dæk tørre isterninger i en klud og pulverisere kuberne ved hjælp af en hammer. Placer sølvfolie (ca. 5 cm x 5 cm) på et lag af tørre isterninger og dække sølv folie med tøris pulver.
- Placer rygmarven område udvalgt til yderligere analyser på tøris pulver med en pincet, lad det snap-freeze, og overføre rygmarven til en Cryo rør. Hold det på tøris på alle tidspunkter eller gemme det ved -80 ° C indtil yderligere ose.
- Overfør rygmarven til en kryostat (-20 ° C). Hvis det er nødvendigt, trim rygmarven inde i kryostaten. Placer rygmarven i indlejring materiale inde i kryostat for at vedhæfte den til modellen disken.
- Skær rygmarven i den ønskede tykkelse, f.eks 5 um, og indsamle på glasplader. Varm glaspladerne med en finger umiddelbart før væv kollektion for bedre vedhæftning. Hold alle rester væv i cryo rør ved -80 ° C indtil videre anvendelse.
- Lad afsnittene om glasplader inde i kryostaten indtil den er klar til post-fiksering.
- Post-fix sektionerne ved nedsænkning i 4% PFA i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Udfør farvning ifølge standardprotokoller 8.
- Fast væv til cryo sektionering (gælder for rygmarv og DRG)
- Fix rygmarv og DRG i 4% PFA (2 timer for rygmarven, 1,5 time for mus DRG og 4 timer for rotte DRG) på4 ° C (sted rygmarv i vandret position for at forhindre det i at fastsættelse i en bøjet position).
- Overfør vævet til 25% vægt / volumen sucrose natten over ved 4 ° C. Vævet kan opbevares i 25% vægt / volumen sucrose suppleret med et par dråber af 10% natriumazid for at forhindre mikrobiel kontaminering ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. Hvis det er nødvendigt, trimme rygmarven at gøre op columna udvidelsen kun på en silikone bord eller lignende.
- Brug spidsen af en papirserviet, aspireres overskydende saccharoseopløsning fra vævet.
- Fyld en cryo skimmel halvvejs med indlejring materiale. Skub eventuelle bobler til siderne af kryo formen med værktøjer som lukkede pincet.
- Placer vævet på indkapslet materiale med en pincet og sikre det ønskede væv orientering.
- Fyld kryo formen fuldstændigt med indlejring materiale og skubbe eventuelle bobler så langt væk fra vævet som muligt (fx ved brug lukkede pincet).
- Fyld en petriskål (100 mmi diameter) med 2-methylbutan. Dette stof er skadeligt. Udfør dette trin i et stinkskab og håndtere stoffet i henhold til institutionens retningslinjer (ADVARSEL: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Anbring petriskålen på et lag af tøris, og der tilsættes to tørre isterninger til petriskålen. Placer kryo skimmel i petriskålen og tillade indlejring materiale til at fryse helt.
- Hold indlejrede væv på tøris til enhver tid eller ved -80 ° C indpakket i parafilm afventer yderligere behandling.
- Skær væv på en kryostat (-20 ° C) i den ønskede tykkelse, f.eks 5 um.
- Udfør farvning ifølge standardprotokoller 8.
- Fast væv til paraffin-indlejring (gælder for rygmarv og DRG)
- Fix rygmarv og DRG i 4% PFA (2 timer for rygmarv, 1,5 timer for muse DRG og 4 timer for rotte DRG) ved 4 ° C (sted rygmarvi vandret position for at forhindre det i at fastsættelse i en bøjet position).
- Overfør vævet til 25% vægt / volumen sucrose natten over ved 4 ° C. Vævet kan opbevares i 25% vægt / volumen sucrose suppleret med et par dråber af 10% natriumazid for at forhindre mikrobiel kontaminering ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Isolere væv interesseområde, fx rygmarv lumbale udvidelsen.
- Fyld en indlejring skimmel halvvejs med paraffin.
- Afkøle indlejring kortvarigt formen ved at placere den på afkøling område af indlejring maskine at hærde paraffinen smule. Dette giver mulighed for bedre væv positionering.
- Placer væv i den ønskede orientering i indlejringen formen. Fyld indlejring mug med paraffin og køle det samme.
- Placer paraffin-holdige indlejring støbeform ved 4 ° C natten over for at lade det hærde fuldstændigt og fjern paraffinblokken indeholdende væv fra indlejring skimmel.
- Cut sektioner ona mikrotom i den ønskede tykkelse, f.eks 5 um.
- Udfør farvning ifølge standardprotokoller 8.
- For frisk frosset væv (gælder for rygmarven):
Representative Results
Hydraulisk ekstruderet rygmarv vise en glat ubeskadiget overflade vist i figur 1. Lumbal Udvidelsen kan let identificeres som den fortykkede område af rygmarven, boxed i figur 1. De dorsale og ventrale sider af rygmarven kan identificeres ved øjet ifølge morfologi. I figur 1 er den ventrale side vender mod betragteren, identificerbare ved ét klart midterlinjen langs hele rygmarven. To bredere linjer langs rygmarven tillade identifikation af dorsale side. På det mest distale ende, kan cauda equina undertiden blive siddende i voksne rotter og voksne mus.
Individuelle DRG kan kun identificeres mens placeret i rygsøjlen, figur 2. Efter isolering, figur 3, kan de enkelte DRG ikke identificeres ved udseende. Hvis det er nødvendigt, er det derforvigtigt at holde dem klart adskilt ved isolation. Efter isolering kan rygmarv og DRG behandles og farvet som beskrevet i trin 7.3 og vist i figur 4. Figur 4a viser en immunhistokemisk farvning af en DRG sektion, hvor neuronerne og deres omgivende satellit gliaceller er klart synlige. Ved korrekt identifikation af DRG er det muligt at analysere effekten af iskiasnerven skader på soma af den forurettede neuron samt på deres omgivende satellit gliaceller. Figur 4b viser en Nissl farvning af en hydraulisk ekstruderet rygmarv, hvor vævet er intakt som afspejles af de glatte kanter sektionen.
Figur 4: Repræsentative vævssnit. A. Immunhistokemisk farvning af DRG sektion. B. Nissl farvede sektionn af hydraulisk ekstruderet rygmarven. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Hvis rygsøjlen forstyrres, fx ved cervikal dislokation, vil rygmarven split under ekstrudering. Hvis rygmarven ikke kan ekstruderes, kan rygsøjlen trimmes lidt i begge ender og ekstruderingen forsøg kan gentages. Hvis der er behov hele rygmarven til yderligere analyse, dvs. bestående af den cervikale udvidelse samt den lumbale udvidelsen bør rygsøjlen kun beskåret lidt. Hvis der kun er brug columna udvidelsen til yderligere analyse, bør rygmarven trimmes ifølge den foreliggende protokol. Rygraden skal rettes ud ved hjælp fingerspidserne til at lette ekstrudering.
Den protokol for gnavere i alle aldre og er her eksemplificeret af en voksen mus (8 uger), en mus pup (5 dage) og en voksen rotte (10 uger). Afhængigt af dyreart og stamme, kan antallet af thorax og lumbal sektioner variere 9, 10, 11. Afhængigt af de proteiner, som skal analyseres, voksne gnavere kan perfunderet med enzym-inhiberende opløsninger før eutanasi. Hvis der udføres et forsøg med ensidig nerveskade, kan rygmarven opdeles i ipsilaterale og kontralaterale sider ved hjælp ultrafine pincet umiddelbart efter ekstrudering. Endvidere kan hver side opdeles i dorsale og ventrale sider. Vævet kan derefter behandles til yderligere analyser, f.eks Western blotting.
Transcardial perfusion-fiksering med PFA før rygmarv ekstrudering bør undgås, da dette gør rygmarven ikke-fleksibel og forhindrer rygmarv hydrauliske ekstrudering. Hydraulisk rygmarv ekstrudering vil rive de dorsale rødder. For forsøg, hvor vedhæftede dorsale rødder er nødvendige, anbefales laminektomi. Endvidere er spinal meninges tabt ved hydraulisk ekstrudering, som kan undgås ved standard laminektomi Hydraulisk ekstrudering af rygmarven og DRG isolation kunne også udføres ved anvendelse oxygeneret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) i stedet for iskold PBS. Brugen af ACSF tillader bevarelse af det isolerede væv i en bedre fysiologisk miljø, hvilket er særlig vigtigt i tilfælde af efterfølgende elektrofysiologiske optagelser 12, 13. Et alternativ til ACSF kunne være PBS indeholdende 1 g / l glucose til generering af primær DRG-kulturer 14. Hydraulisk ekstrudering af rygmarven er en betydeligt hurtigere metode end den traditionelle måde at rygmarven isolering ved laminektomi, reducere væv-handling tid, og derfor mindske risikoen for skader protein. Perfusion med et fiksativ forud for isolering af rygmarven ved laminektomi kan reducere risikoen for vævsskader under dissektion og under den endelige fjernelse afrygmarv fra rygraden. Men vævsfiksering udelukker dens anvendelse på analyser såsom Western blotting. Hydrauliske ekstrudering udbytter strukturelt ubeskadiget væv 3 egnet til en bredere vifte af analyser. Konsekvent identifikation af DRG kan være vanskelig. Dette er imidlertid væsentligt for væv analysen, f.eks efter iskiasnerven skade. Ved nummerering af DRG efter deres lokalisering i forhold til costae, kan DRG identificeres konsekvent. Farvning af rygmarven væv samt af DRG kan optimeres ved at udføre de illustrerede vævsbehandling variationer skitseret i protokol trin 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
References
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82 (2016).
- Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
- Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
- Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
- Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
- Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
- Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
- Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).
