Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה וכן לזהות ולבודד DRGs 1, 2. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה מהירה יותר באופן משמעותי מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, כלומר על ידי שבירת חוליות עמוד השדרה אחת בכל פעם, ושיטה זו מפחיתה את הסיכון של נזק לרקמות שנגרם על ידי תהליך לנתיחה 3, 4 . DRGs עלול להיות קשה לזהות. זיהוי נכון חשוב מאוד עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי.
רקמות המבודדים על ידי הטכניקות הפגינו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של ניתוחים כולל מערבי סופג 5,6, qPCR 7 והכתים 8 immunohistochemical.
כאשר זיהוי DRGs, חשוב לקחת בחשבון כי מספר מגזרי חוט שדרה ידוע להשתנות עם סוג חיה ומתח 9, 10, 11. היתרונות בביצוע שיטה זו בעכברים הם המספר הגבוה של הגירסות זמינות מהונדס גנטיות ואת הוצאות הדיור הנמוכות יחסית. היתרונות בשימוש חולדות הם התשואה גבוהה יחסית רקמות ואם מעורבי פציעות עצבות, ההליך יהיה הקל עם גודל.
Protocol
כל החיות טופלו תוך ציות מלא לתקנות דניות ואירופאיות. רשות מספר: 2012-15-2934.
1. הכנת המזרק הידראולי שהחול של חוט השדרה
- עבור חולדה בוגרת, להשתמש מזרק 10 מ"ל. עבור עכבר מבוגר, להשתמש במזרק 5 מ"ל. עבור גורים, להשתמש במזרק מ"ל 2.5.
- התאם קצה פיפטה הלא פילטר מתאים אוניברסלית עבור 2-200 טפטפות μL ידי זמירה סוף גדול של קצה פיפטה עד שהוא משתלב היטב את המזרק. הנח את קצה פיפטה המתואם על המזרק. עבור גורים, השתמש 23 G או מחט דומה במקום קצה פיפטה מתואם.
- לשאוב קר כקרח סטרילי PBS ולהשאיר את המזרק על הקרח עד לשימוש נוסף.
2. המתת חסד
- אל תבצע נקע בצוואר הרחם, כמו זה יהיה להפריע את חוליות עמוד השדרה טיוח שחול בלתי אפשרי.
- עבור עכברוש / עכבר בוגר, להרדים באמצעות גז כגון CO 2 או isofluRANE. חומרים אלו הם מזיקים. בצע המתת חסד במנדף ולטפל החומרים על פי הנחיות המוסד. (זהירות: CO 2: H280, P410, P403; isoflurane: H361d, P260, P281, P280)
- כדי להבטיח כי המכרסם מת, להבטיח היעדר רפלקס ידי צובט כפה עם פינצטה. לערוף את המכרסם באמצעות מספריים גדולים. עבור גורים, להרדים על ידי עריפת ראש.
3. בידוד של עמוד השדרה
- מפזרי מים על הפרווה לשלוט השיער.
- בעזרת זוג מספריים, לחתוך את הפרווה לאורך עמוד השדרה לכיוון דיסטלי ולבודד את עמוד השדרה על ידי חיתוך משני הצדדים לאורך עמוד השדרה בעבר עצם האגן. חותכים את חוט השדרה distally עד העצם האגן עם זוג מספריים.
הערה: הציר מקורי, הזנב הוא כונה כציר הפרוקסימלי-דיסטלי ברחבי הפרוטוקול.- חתוך את עמוד השדרה בעזרת זוג מספריים כדי למנוע את proximal-רוב ואזורים דיסטלי ביותר מכיוון שהן עשויות להפוך את עמוד השדרה מדי בצורת האות S לשחול חוט השדרה מוצלח. ודא כי חוט השדרה גלוי בשני קצותיו. אם חוט השדרה אינו גלוי, חתוך את עמוד השדרה במספריים עד חוט השדרה הופך לגלוי.
4. שחול הידראולי של חוט השדרה
- מניחים צלחת פטרי (100 מ"מ קוטר) מלא PBS סטרילית על הקרח.
- יישר את עמוד השדרה על ידי יישום אצבע מצד המכופף (הקצה הפרוקסימלי ביותר) של עמוד השדרה, ובכך ליישר את עמוד השדרה ככל האפשר.
- עבור גורים, למנוע כיפוף עמוד השדרה, כמו החוליות תיפגענה טיוח שחול חוט שדרה בלתי אפשרית.
- הכנס את קצה פיפטה (23 G מחט עבור גורים, לחילופין 18 G מחט עבור עכברים בוגרים) בקצה הדיסטלי ביותר של עמוד השדרה. אם מוכנס כראוי, הקצה הוא התייצב בחלל השדרה.
- ודא כי עמוד השדרה הוא יישר ככל האפשר. החל לחץ יציב, ו extrude חוט השדרה לתוך צלחת פטרי על קרח. ודא כי חוט השדרה נשמר לחות על קרח על ידי שמירה על אותה ב PBS עד לטיפולה.
איור 1: מיתרי השדרה נציג. הידראולית הנמתח מיתרי השדרה. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר. גדלות מותנהיות בסימן תיבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
זיהוי 5. של שורש הגבה גרעינים (DRGs)
- פיצול עמוד השדרה בשני חלקים אורכים שווים באמצעות מספריים ולמקם את עמוד שדרת הפיצול תחת מיקרוסקופ.
- זהה את פלח חולית T13 ידי איתור באתר המצורף של costae דיסטלי ביותר על שם לב עמוד השדרה לא לבלבל את costae עם עצבי צלע הסמוכים. Costae דיסטלי ביותר מחוברים החלק הפרוקסימלי של קטע T13 חוליה ואת T13 DRG ממוקם distally כדי T13 החוליה proximally לחוליה L1.
- זהה DRGs במקביל לכיוון דיסטלי. עבור חולדה בוגרת, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור עכבר מבוגר, DRGs במקביל מופיע לבן עם גב נראה בבירור ושורשי גחון. עבור גורים, DRGs במקביל מופיע בתחומים ברורים.
איור 2: זיהוי של DRGs בעמוד השדרה לאחר שחול של חוט השדרה. עמוד השדרה פוצל המאפשר הדמיה של DRGs כפי שצוין על ידי חיצים. שהודגם גור חולדה ועכבר מבוגרים. נ"צ = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידוד 6. DRGs
- מנות מספר פטרי (30 מ"מ קוטר) על פי DRGs הספציפי להיות מבודדות, למשל L3, L4, L5. מלא את צלחות פטרי עם PBS סטרילי קר כקרח ומניח אותם על קרח.
- בעזרת מספריים מיקרו, הגבי לחתוך ושורשים הגחון קרוב DRGs ככל האפשר כדי לשחרר אותם תוך הימנעות מפגיעה DRGs.
- עם הקצה של פינצטה הסגור, בעדינות לגרוף את DRGs ולהעבירם צלחות פטר ממוספרים המקבילות.
איור 3: נציג מבודד DRGs. משמאל לימין: עכברוש מבוגר, עכבר בוגר, גור עכבר."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיבוד 7. של רקמות לצורך ניתוח נוסף
- מערבי סופג
- מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה. במידת הצורך, להפריד את חוט השדרה לתוך צדדי ipsilateral ו נגדיים ויותר לתוך הגבי וקרנות גחון.
- הנח את רקמת חיץ תמוגה כגון חיץ תמוגה TNE (10 מ"מ טריס-בסיס, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 ב O כפול מזוקקים H 2) המכיל מעכבי האנזים המתאים על הקרח.
- Homogenize רקמת כ 30 שניות על הקרח באמצעות העלי שחיקה מכנית.
- צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 16,000 ב 4 ° C ולהשתמש supernatant לעיבוד נוסף על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 5, 6 או לשמור את supernatant ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
- RNA-אנליזה
- לבודד את הרקמה של עניין.
- מיד למקום הרקמה בתמיסה ייצוב RNA כדי לייצב את RNA לאחסון.
- לבודד RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7.
- המרת RNA ל cDNA ולבצע qPCR פי פרוטוקולים סטנדרטיים 7.
- אימונוהיסטוכימיה
- עבור רקמה טרי קפוא (תחולה על חוט השדרה):
- כן אבקת קרח יבש על ידי כתישת קוביות קרח יבשות עד לסכום המתאים שתי כפות של אבקה. מכסה קוביות קרח יבשות עטופים בבד לכתוש את הקוביות באמצעות פטיש. מניחים נייר כסף (כ 5 ס"מ x 5 ס"מ) על שכבה של קוביות קרח יבש ולכסות את בנייר כסף עם אבקת קרח יבש.
- מניחים את חוט השדרה באזור שנבחר עבור ניתוחים נוספים על אבקת קרח יבש באמצעות פינצטה, ולתת לו snap-הקפאה, ולהעביר את חוט השדרה לצינור קריו. שמור את זה על קרח יבש בכל עת או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד לקדם אותנודואר.
- מעבירים את חוט השדרה על cryostat (-20 ° C). במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה בתוך cryostat. מניחים את חוט השדרה בהטמעת החומר בתוך cryostat כדי לצרף אותו לדיסק הדגימה.
- חותכים את חוט השדרה בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר, ולאסוף על צלחות זכוכית. מחמם את לוחות הזכוכית באצבע ערב לאוסף רקמה מצורפת טוב יותר. שמור את כל רקמת שאריות צינורות קריו ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- השאר את הסעיפים על צלחות זכוכית בתוך cryostat עד מוכן תיאום פוסט.
- פוסט לתקן את הסעיפים על ידי טבילה לתוך 4% PFA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8.
- רקמות קבועות עבור חתך קריו (תחולה על חוט שדרה ו DRGs)
- תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) ב4 ° C (חוט שדרה במקום במצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה).
- העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. במידת הצורך, חתוך את חוט השדרה כדי לפצות את ההרחבה המותני רק על לוח סיליקון או דומה.
- משתמש הקצה של מגבת נייר, לשאוב תמיסת סוכרוז עודפת מן הרקמה.
- ממלאים חצי עובש קריו עם הטבעת חומר. לדחוף את כל בועות לצדדים של עובש קריו עם כלים כגון פינצטה סגור.
- הנח את הרקמה על חומר ההטבעה באמצעות פינצטה ולהבטיח את הכיוון לרקמה הרצויה.
- ממלא את תבנית קריו לחלוטין עם הטבעת חומר ולדחוף כל בועות הכי רחוק מן הרקמה ככל האפשר (למשל באמצעות פינצטה סגור).
- למלא צלחת פטרי (100 מ"מקוטר) עם 2-methylbutane. חומר זה מזיק. בצע פעולה זו במנדף ולטפל החומר על פי הנחיות המוסד (זהירות: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- מניחים את צלחת פטרי על שכבה של קרח יבש ולהוסיף שתי קוביות קרח יבש כדי בצלחת פטרי. מניחים את התבנית קריו בצלחת פטרי לאפשר את החומר הטבעה להקפיא לחלוטין.
- שמור על הרקמות המוטבעות על קרח יבש בכל העת או ב -80 ° C עטופים Parafilm עד לעיבוד נוסף.
- חותך את הרקמה על cryostat (-20 ° C) בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר.
- לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8.
- רקמות קבועות עבור הטבעת פרפין (תחולה על חוט שדרה ו DRGs)
- תקן חוט השדרה DRGs ב 4% PFA (2 h עבור חוט השדרה, 1.5 שעות עבור DRGs העכבר 4 שעות עבור DRGs עכברוש) בשעה 4 ° C (חוט השדרה מקוםבמצב אופקי כדי למנוע ממנה לתקן בעמדה כפופה).
- העברת הרקמה עד 25% w / v סוכרוז הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הרקמה ניתן לאחסן 25% w / v סוכרוז השלים עם כמה טיפות של אזיד הנתרן 10% על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
- מבודד את אזור הרקמה של עניין, למשל הרחבת המותני חוט השדרה.
- למלא חצי עובש הטבעה עם פרפין.
- לצנן את בקצרה עובש ההטבעה ידי הצבתו על אזור הקירור של מכונה ההטבעה להקשיח את פרפין מעט. זה מאפשר מיצוב רקמה טוב יותר.
- הנח את הרקמה בכיוון הרצוי עובש ההטבעה. ממלאים את התבנית הטבעה עם פרפין לקרר מיד.
- מניח את תבנית הטבעה המכיל פרפין ב 4 ° C למשך הלילה כדי לתת לה להתקשות לחלוטין ולהסיר את בלוק פרפין המכיל את הרקמות מתבנית ההטבעה.
- Cut סעיפים oנה microtome בעובי הרצוי, למשל 5 מיקרומטר.
- לבצע מכתים פי פרוטוקולים סטנדרטיים 8.
- עבור רקמה טרי קפוא (תחולה על חוט השדרה):
Representative Results
הידראולי נמתח מייתרי שדרה להציג משטח ניזוק חלק שמוצג באיור 1. ההגדלה המותני ניתן לזהות בקלות כאזור המעובה של חוט השדרה, התאגרף באיור 1. הגבו ו גחון הצדדים של חוט השדרה יכולים להיות מזוהים על ידי עין על פי המורפולוגיה. באיור 1, בצד הגחון עומד בפני הצופה, המזוהים על ידי קו האמצע אחת ברורה לאורך חוט השדרה כולו. שני קווים רחבים לאורך חוט השדרה לאפשר זיהוי של הצד הגבה. בקצה הדיסטלי-ביותר, equina cauda עשוי לעתים נשאר צמוד חולדות מבוגרי עכברים בוגרים.
DRGs הפרט ניתן לזהות רק בעוד ממוקם עמוד השדרה, איור 2. בעקבות הבידוד, איור 3, DRGs הפרט לא ניתן לזהות לפי המראה. במידת הצורך, ולכןחשוב לשמור אותם מופרדים בבירור על הבידוד. לאחר בידוד, חוט השדרה DRGs ניתן לעבד ומוכתמת כפי שמתואר בשלב 7.3 וייצג באיור 4. איור 4 א מראה מכתים immunohistochemical של קטע DRG שבו נוירונים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם גלויים לעין. על ידי זיהוי נכון של DRG אפשר לנתח את ההשפעה של פציעות גיד הנשה על סומה של נוירון הפצוע וכן על ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם. איור 4 מראה מכתים Nissl של חוט שדרה נמתח הידראולית שבו הרקמה היא תמה כפי שמשתקפים הקצוות החלקים של הסעיף.
איור 4: קטעי רקמה נציג. א. מכתים immunohistochemical של סעיף DRG. B. Nissl מוכתם section של חוט שדרה נמתח הידראולית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
אם עמוד השדרה מופר, למשל על ידי נקע בצוואר הרחם, חוט השדרה יהיה לפצל במהלך שחול. אם חוט השדרה לא ניתן נמתח, עמוד השדרה ניתן גזוז מעט בשני קצותיו וניסיון שהחול ניתן לחזור. במקרה חוט השדרה כולו נדרש לניתוח נוסף, כלומר מורכב של הרחבת צוואר הרחם, כמו גם את ההרחבה המותני, עמוד השדרה צריך להיות מטופח רק במעט. אם רק את ההרחבה המותני נדרשת לניתוח נוסף, חוט השדרה צריך להיות מטופח לפי הפרוטוקול הנוכחי. עמוד השדרה צריך להיות יישר באמצעות קצות האצבעות כדי להקל שחול.
הפרוטוקול הוא ישים מכרסמים מכל הגילים מודגם כאן על ידי עכבר בוגר (8 שבועות), גור עכבר (5 ימים) חולדה בוגרת (10 שבועות). בהתאם לסוג ומתח חיה, מספר סעיפים ובית החזה המותני עשוי להשתנות 9, 10, 11. בהתאם חלבונים להיות מנותח, מכרסמים מבוגרים ניתן perfused עם פתרונות אנזים-עיכוב לפני המתת חסד. אם ביצוע ניסוי מעורבים פגיעה עצבית חד צדדי, חוט השדרה ניתן לפצל הצדדים ipsilateral ו הנגדי באמצעות פינצטה Ultra- בסדר מיד לאחר שחול. יתר על כן, כל צד יכול להיות נחלק גב ועל צדדי גחון. הרקמה אז יכול להיות מעובד על ניתוחים נוספים, המערבי סופג למשל.
זלוף קיבוע transcardial עם PFA לפני שחול חוט שדרה יש להימנע, כמו זה הופך את חוט השדרה שאינו גמיש ומונע שחול הידראולי חוט שדרה. שחול חוט שדרה הידראולי יקרע את השורשים מגבים. בניסויים שבם שורשים הגבו מצורפים נחוצים, laminectomy מומלץ. יתר על כן, קרומי המוח השדרה הם איבדו ידי שחול הידראולי, אשר יכול להימנע על ידי laminectomy תקן שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד DRG יכול גם להתבצע באמצעות מלאכותי הנוזל השדרתי מחומצן (ACSF) במקום קר כקרח PBS. שימוש ACSF מאפשר שימור של הרקמה המבודדת בסביבה פיזיולוגית טוב יותר, וזה חשוב במיוחד במקרה של הקלטות הבאות אלקטרו 12, 13. חלופה ACSF יכול להיות PBS המכיל 1 גרם / גלוקוז L עבור הדור של תרבויות DRG העיקרי 14. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה משמעותית מהר יותר מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, צמצום זמן טיפול רקמות ולכן להקטין את הסיכון לנזק חלבון. זלוף עם מקבע לפני לבודד את חוט השדרה על ידי laminectomy עשויה להפחית את הסיכון של נזק לרקמות במהלך דיסקציה במהלך ההסרה הסופית שלחוט השדרה של עמוד השדרה. עם זאת, קיבעון רקמות מונע ישימותה ניתוחים כגון מערבי סופג. תשואות שחול הידראוליות רקמות ניזוק מבני 3 מתאימות למגוון רחב יותר של ניתוחים. זיהוי עקבי של DRGs עלול להיות קשה. עם זאת, זה חיוני עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. הכתמה של רקמת חוט שדרה וכן של DRGs יכולה להיות מותאמת על ידי ביצוע וריאציות טיפול רקמות המאוירות מפורטות צעד פרוטוקול 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
References
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82 (2016).
- Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
- Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
- Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
- Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
- Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
- Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
- Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).
