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Neuroscience

चूहे में रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia के अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना

Published: January 22, 2017 doi: 10.3791/55226
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग करने के साथ ही 2 की पहचान करने के लिए और, DRGs 1 को अलग-थलग करने के लिए है। रीढ़ की हड्डी के हाइड्रोलिक बाहर निकालना laminectomy से रीढ़ की हड्डी में अलगाव, एक समय में रीढ़ की कशेरुकाओं एक तोड़कर यानी के पारंपरिक तरीके की तुलना में काफी तेजी से विधि है, और इस विधि ऊतकों को नुकसान के जोखिम को विच्छेदन प्रक्रिया 3, 4 की वजह से कम कर देता है । DRGs की पहचान करना मुश्किल हो सकता है। सही पहचान ऊतक विश्लेषण के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है, जैसे sciatic तंत्रिका चोट के बाद। costae करने के लिए उनके रिश्तेदार स्थानीयकरण के अनुसार DRGs नंबर रखकर DRGs लगातार पहचाना जा सकता है।

तकनीक का प्रदर्शन यहां से अलग ऊतक पश्चिमी सोख्ता 5 सहित विश्लेषण का एक व्यापक रेंज के लिए लागू किया जा सकता है,6, 7 और qPCR immunohistochemical धुंधला 8।

जब DRGs की पहचान है, यह खाता है कि रीढ़ की हड्डी में क्षेत्रों की संख्या जानवर प्रकार और तनाव 9, 10, 11 के साथ भिन्न करने के लिए जाना जाता है में लेने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में इस विधि का प्रदर्शन करने में लाभ आनुवंशिक रूप से संशोधित उपलब्ध वेरिएंट और अपेक्षाकृत कम आवास खर्च की उच्च संख्या में हैं। चूहों का उपयोग कर में लाभ अपेक्षाकृत उच्च ऊतक उपज हैं और अगर तंत्रिका चोट से संबंधित, प्रक्रिया के आकार के साथ ढील दी जाएगी।

Protocol

सभी जानवरों को डेनमार्क और यूरोपीय नियमों के साथ पूर्ण अनुपालन में संभाल रहे थे। अनुमति नंबर: 2012-15-2934।

1. स्पाइनल कॉर्ड की हाइड्रोलिक बाहर निकालना के लिए सिरिंज की तैयारी

  1. एक वयस्क चूहे के लिए, एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। एक वयस्क माउस के लिए, 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। पिल्ले के लिए, एक 2.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
  2. सार्वभौमिक विंदुक टिप के बड़े अंत trimming जब तक यह सिरिंज के लिए मजबूती से फिट बैठता द्वारा 2-200 μL pipettes के लिए उपयुक्त एक गैर फिल्टर विंदुक टिप समायोजित करें। सिरिंज पर समायोजित विंदुक टिप रखें। पिल्ले के लिए, एक 23 जी या इसी तरह की सुई एक समायोजित विंदुक टिप के बजाय का उपयोग करें।
  3. महाप्राण ठंडा बाँझ पीबीएस और आगे उपयोग करें जब तक बर्फ पर सिरिंज छोड़ दें।

2. इच्छामृत्यु

  1. ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन नहीं करें क्योंकि यह बाहर निकालना असंभव प्रतिपादन रीढ़ की कशेरुकाओं परेशान नहीं करेगा।
  2. वयस्क चूहे / माउस के लिए, ऐसे सीओ 2 या isoflu के रूप में गैस का उपयोग euthanizeराणे। इन पदार्थों हानिकारक हैं। एक धूआं हुड में इच्छामृत्यु प्रदर्शन और संस्था के दिशा-निर्देशों के अनुसार पदार्थों को संभाल। (चेतावनी: सीओ 2: H280, P410, P403, isoflurane: H361d, P260, P281, P280)
    1. कृंतक मर चुका है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, सुनिश्चित पलटा के अभाव चिमटी के साथ एक पंजा pinching द्वारा। कृंतक बड़ी कैंची का उपयोग कर सिर काटना। पिल्ले के लिए, कत्ल द्वारा euthanize।

3. स्पाइनल कॉलम के अलगाव

  1. फर पर पानी छिड़क बालों को नियंत्रित करने के लिए।
  2. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, एक बाहर का दिशा में स्पाइनल कॉलम के साथ फर खुले में कटौती और अतीत श्रोणि अस्थि स्पाइनल कॉलम के साथ दोनों पक्षों पर काटने से स्पाइनल कॉलम अलग। कैंची की एक जोड़ी के साथ श्रोणि अस्थि को distally रीढ़ की हड्डी में कटौती।
    नोट: व्याख्यान चबूतरे वाला दुम अक्ष प्रोटोकॉल भर समीपस्थ-बाहर का धुरी के रूप में चिह्नित है।
    1. proximal- से बचने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग स्पाइनल कॉलम ट्रिमसबसे अधिक है और इन के रूप में बाहर का सबसे क्षेत्रों स्पाइनल कॉलम सफल रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना के लिए भी एस के आकार प्रदान कर सकते हैं। सुनिश्चित करें कि रीढ़ की हड्डी के दोनों सिरों पर दिख रहा है। रीढ़ की हड्डी दिखाई नहीं है, तो कैंची से स्पाइनल कॉलम ट्रिम जब तक रीढ़ की हड्डी दिखाई हो जाता है।

4. स्पाइनल कॉर्ड की हाइड्रोलिक बाहर निकालना

  1. एक पेट्री डिश (व्यास में 100 मिमी) बर्फ पर बाँझ पीबीएस के साथ भरा रखें।
  2. स्पाइनल कॉलम के मुड़े हिस्सा (समीपस्थ-सबसे अंत) पर एक तर्जनी को लागू करने के लिए, जिससे जितना संभव हो उतना स्पाइनल कॉलम सीधे द्वारा स्पाइनल कॉलम सीधे हो जाएँ।
    1. पिल्ले के लिए, स्पाइनल कॉलम झुकने से बचने के रूप में कशेरुकाओं रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना असंभव प्रतिपादन बाधित हो जाएगा।
  3. विंदुक टिप स्पाइनल कॉलम के बाहर का सबसे अंत में (पिल्ले के लिए 23 जी सुई, वैकल्पिक रूप से 18 वयस्क चूहों के लिए जी सुई) डालें। यदि सही ढंग से डाला, टिप रीढ़ की गुहा में स्थिर है।
  4. सुनिश्चित करें कि स्पाइनल कॉलम जितना संभव हो उतना सीधा है। स्थिर दबाव लागू करें, और बर्फ पर पेट्री डिश में रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना। सुनिश्चित करें कि रीढ़ की हड्डी के आगे से निपटने के लिए जब तक पीबीएस में इसे रखने से बर्फ पर नम रखा जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि रीढ़ की हड्डी डोरियों। हाइड्रॉलिक रीढ़ की हड्डी डोरियों निकाला। वयस्क चूहे, वयस्क माउस, माउस पिल्ला: सही करने के लिए छोड़ दिया है। काठ enlargements बॉक्स द्वारा चिह्नित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. पृष्ठीय रूट ganglia की पहचान (DRGs)

  1. कैंची का उपयोग दो बराबर भागों में अनुदैर्ध्य स्पाइनल कॉलम विभाजित है और माइक्रोस्कोप के अंतर्गत विभाजित स्पाइनल कॉलम जगह है।
  2. द्वारा T13 बांस खंड को पहचानें स्पाइनल कॉलम ध्यान दे पर बाहर का सबसे costae की कुर्की साइट का पता लगाने पास पसलियों के बीच नसों के साथ costae भ्रमित करने के लिए नहीं। बाहर का सबसे costae T13 बांस खंड के समीपस्थ हिस्सा है और T13 डीआरजी बांस T13 के लिए distally और proximally स्थित है एल 1 बांस से जुड़े होते हैं।
  3. बाहर दिशा में सहवर्ती DRGs को पहचानें। एक वयस्क चूहे के लिए, सहवर्ती DRGs स्पष्ट रूप से दिखाई पृष्ठीय और उदर जड़ों के साथ सफेद दिखाई देते हैं। एक वयस्क माउस के लिए, सहवर्ती DRGs स्पष्ट रूप से दिखाई पृष्ठीय और उदर जड़ों के साथ सफेद दिखाई देते हैं। पिल्ले के लिए, सहवर्ती DRGs के रूप में स्पष्ट क्षेत्रों दिखाई देते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी के बाहर निकालना के बाद स्पाइनल कॉलम में DRGs की पहचान। स्पाइनल कॉलम के रूप में तीर द्वारा संकेत DRGs के दृश्य की अनुमति विभाजित किया गया है। वयस्क चूहे और माउस पिल्ला द्वारा उदाहरण। रेफरी = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. DRGs का अलगाव

  1. संख्या पेट्री डिश (व्यास में 30 मिमी) विशिष्ट DRGs के अनुसार अलग किया जा करने के लिए, जैसे L3, L4, L5। ठंडा बाँझ पीबीएस के साथ पेट्री डिश भरें और बर्फ पर उन्हें जगह है।
  2. संभव के रूप में DRGs के करीब के रूप सूक्ष्म कैंची, कट पृष्ठीय और उदर जड़ों का उपयोग करते हुए उन्हें रिहा करने के लिए, जबकि DRGs को नुकसान पहुँचाए से बचने।
  3. बंद चिमटी की नोक के साथ, धीरे DRGs बाहर निकालना और उन्हें इसी गिने पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिनिधि DRGs अलग। वयस्क चूहे, वयस्क माउस, माउस पिल्ला: सही करने के लिए छोड़ दिया है।"_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आगे के विश्लेषण के ऊतकों की 7. प्रसंस्करण

  1. पश्चिमी सोख्ता
    1. ब्याज के ऊतकों क्षेत्र को अलग, रीढ़ की हड्डी काठ का इज़ाफ़ा जैसे। यदि आवश्यक हो, ipsilateral और contralateral पक्ष में है और आगे पृष्ठीय और उदर सींग में रीढ़ की हड्डी अलग।
    2. Lysis बफर में ऊतक ऐसे TNE lysis बफर (10 मिमी Tris आधार, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% NP40 में दोहरा आसुत एच 2 ओ) बर्फ पर उचित एंजाइम inhibitors युक्त के रूप में रखें।
    3. एक यांत्रिक पीस मूसल का उपयोग कर बर्फ पर लगभग 30 एस के लिए ऊतक homogenize।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और मानक प्रोटोकॉल 5, 6 के अनुसार आगे की प्रक्रिया के लिए सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें या आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला रहते हैं।
  2. शाही सेना विश्लेषण
    1. ब्याज की ऊतक अलग।
    2. इसके तत्काल बाद भंडारण के लिए शाही सेना को स्थिर करने के लिए आरएनए स्थिरीकरण समाधान में ऊतक जगह है।
    3. मानक प्रोटोकॉल 7 के अनुसार पृथक आरएनए।
    4. सीडीएनए कन्वर्ट करने के लिए शाही सेना और मानक प्रोटोकॉल 7 के अनुसार qPCR प्रदर्शन करते हैं।
  3. immunohistochemistry
    1. ताजा जमी ऊतक (रीढ़ की हड्डी को लागू) के लिए:
      1. एक राशि पाउडर के दो बड़े चम्मच करने के लिए इसी के लिए सूखी बर्फ घन pulverizing से सूखी बर्फ पाउडर तैयार करें। एक कपड़े में सूखी बर्फ घन कवर और एक हथौड़ा का उपयोग क्यूब्स घोटना। चांदी चमकी (लगभग 5 सेमी एक्स 5 सेमी) सूखी बर्फ घन की एक परत पर रखें और सूखी बर्फ पाउडर के साथ चांदी चमकी कवर।
      2. चिमटी का उपयोग कर सूखी बर्फ पाउडर पर आगे के विश्लेषण के लिए चुना रीढ़ की हड्डी क्षेत्र रखें, यह तस्वीर फ्रीज, और एक क्रायो ट्यूब के लिए रीढ़ की हड्डी का स्थानांतरण करते हैं। हर समय सूखी बर्फ पर रखें या डिग्री सेल्सियस -80 पर दुकान जब तक हमें आगेई।
      3. एक cryostat करने के लिए रीढ़ की हड्डी स्थानांतरण (-20 डिग्री सेल्सियस)। यदि आवश्यक हो, cryostat अंदर रीढ़ की हड्डी ट्रिम। आदेश नमूना डिस्क को संलग्न करने में cryostat के अंदर सामग्री embedding में रीढ़ की हड्डी रखें।
      4. इच्छित मोटाई में रीढ़ की हड्डी में कटौती, जैसे 5 माइक्रोन, और गिलास प्लेट पर इकट्ठा। बेहतर कुर्की के लिए ऊतक संग्रह करने के तुरंत पहले एक उंगली से गिलास प्लेट हीट। -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर क्रायो ट्यूबों में किसी भी बचे हुए ऊतक रखें।
      5. पोस्ट-फिक्सिंग के लिए तैयार है जब तक cryostat अंदर गिलास प्लेट पर वर्गों छोड़ दें।
      6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​में विसर्जन से वर्गों के बाद तय कर लो।
      7. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 8 धुंधला हो जाना प्रदर्शन करना।
    2. क्रायो सेक्शनिंग के लिए तय ऊतक (रीढ़ की हड्डी और DRGs के लिए लागू)
      1. 4% पीएफए ​​(रीढ़ की हड्डी के लिए 2 घंटे, माउस DRGs के लिए 1.5 घंटे और चूहे DRGs के लिए 4 ज) में रीढ़ की हड्डी और DRGs फिक्स4 डिग्री सेल्सियस (क्षैतिज स्थिति में जगह रीढ़ की हड्डी एक तुला स्थिति में फिक्सिंग से इसे रोकने के लिए)।
      2. ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर w / वी सुक्रोज 25% करने के लिए स्थानांतरण। ऊतक w / वी सुक्रोज आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए 10% सोडियम azide के कुछ बूंदों के साथ पूरक 25% में संग्रहित किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, केवल एक सिलिकॉन बोर्ड या इसी पर काठ का इज़ाफ़ा को बनाने के लिए रीढ़ की हड्डी ट्रिम।
      3. एक कागज तौलिया के टिप का उपयोग करना, ऊतक से अतिरिक्त sucrose के समाधान aspirate।
      4. सामग्री embedding के साथ एक क्रायो ढालना आधे रास्ते में भरें। इस तरह बंद कर दिया चिमटी के रूप में उपकरण के साथ क्रायो मोल्ड के पक्षों के लिए किसी भी बुलबुले पुश।
      5. एम्बेडिंग सामग्री पर ऊतक चिमटी का उपयोग जगह और वांछित ऊतक की ओर रुख किया जाता है।
      6. सामग्री embedding के साथ पूरी तरह से क्रायो ढालना भरें और किसी भी बुलबुले धक्का के रूप में दूर संभव के रूप में ऊतक (बंद चिमटी का उपयोग करके जैसे) से दूर।
      7. एक पेट्री डिश 100 मिमी भरें (2-methylbutane के साथ व्यास) में। इस पदार्थ हानिकारक है। एक धूआं हुड में इस कदम प्रदर्शन और संस्था के दिशा-निर्देशों के अनुसार पदार्थ संभाल (चेतावनी: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310)।
      8. सूखी बर्फ की एक परत पर पेट्री डिश में रखें और पेट्री डिश के लिए दो सूखी बर्फ घन जोड़ें। पेट्री डिश में क्रायो ढालना रखें और एम्बेडिंग सामग्री पूरी तरह से फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं।
      9. या हर समय सूखी बर्फ पर एम्बेडेड ऊतक रखें -80 डिग्री सेल्सियस आगे की प्रक्रिया जब तक Parafilm में लिपटे पर।
      10. एक cryostat (-20 डिग्री सेल्सियस) में वांछित मोटाई पर ऊतक, जैसे 5 माइक्रोन कट।
      11. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 8 धुंधला हो जाना प्रदर्शन करना।
    3. आयल embedding के लिए तय ऊतक (रीढ़ की हड्डी और DRGs के लिए लागू)
      1. 4 डिग्री सेल्सियस (जगह रीढ़ की हड्डी में 4% पीएफए ​​(रीढ़ की हड्डी के लिए 2 घंटे, माउस DRGs के लिए 1.5 घंटे और चूहे DRGs के लिए 4 ज) में रीढ़ की हड्डी और DRGs फिक्सक्षैतिज स्थिति में यह एक तुला स्थिति में फिक्सिंग) से रोकने के लिए।
      2. ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर w / वी सुक्रोज 25% करने के लिए स्थानांतरण। ऊतक w / वी सुक्रोज आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए 10% सोडियम azide के कुछ बूंदों के साथ पूरक 25% में संग्रहित किया जा सकता है।
      3. ब्याज के ऊतकों क्षेत्र को अलग, रीढ़ की हड्डी काठ का इज़ाफ़ा जैसे।
      4. तेल के साथ एक embedding मोल्ड आधे रास्ते में भरें।
      5. एम्बेडिंग मशीन का ठंडा क्षेत्र पर रखकर आयल थोड़ा कड़ा करने से embedding मोल्ड संक्षेप में शांत हो जाओ। यह बेहतर ऊतक स्थिति के लिए अनुमति देता है।
      6. एम्बेडिंग मोल्ड में वांछित अभिविन्यास में ऊतक रखें। तेल के साथ embedding मोल्ड भरें और तुरंत शांत।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस रात भर आयल युक्त embedding मोल्ड की जगह यह पूरी तरह से कठोर और आयल embedding मोल्ड से ऊतक युक्त ब्लॉक को दूर जाने के लिए।
      8. वर्गों में कटौती ओइच्छित मोटाई में Na microtome, जैसे 5 माइक्रोन।
      9. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 8 धुंधला हो जाना प्रदर्शन करना।

Representative Results

हाइड्रॉलिक निकाला रीढ़ की हड्डी डोरियों एक चिकनी सतह क्षतिग्रस्त चित्र 1 में दिखाया प्रदर्शित करते हैं। काठ का इज़ाफ़ा आसानी से रीढ़ की हड्डी के गाढ़ा क्षेत्र, चित्रा 1 में बॉक्सिंग के रूप में पहचाना जा सकता है। रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय और उदर पक्षों आकृति विज्ञान के अनुसार आंखों से पहचाना जा सकता है। चित्रा 1 में, उदर की ओर दर्शक, पूरे रीढ़ की हड्डी के साथ एक स्पष्ट midline से पहचाने का सामना करना पड़ रहा है। रीढ़ की हड्डी के साथ दो व्यापक लाइनों पृष्ठीय पक्ष की पहचान की अनुमति। बाहर का सबसे अंत में, पुच्छ equina कभी कभी वयस्क चूहों और वयस्क चूहों में संलग्न रहते हो सकती है।

जबकि स्पाइनल कॉलम, चित्रा 2 में स्थित व्यक्तिगत DRGs ही पहचाना जा सकता है। अलगाव, चित्रा 3 के बाद, व्यक्तिगत DRGs उपस्थिति से नहीं पहचाना जा सकता। यदि आवश्यक हो, इसलिए यह हैउन्हें रखने के लिए महत्वपूर्ण स्पष्ट रूप से अलगाव पर अलग कर दिया। अलगाव के बाद, रीढ़ की हड्डी और DRGs कार्रवाई की जा सकती है और दाग के रूप में कदम 7.3 में उल्लिखित और चित्रा 4 में प्रतिनिधित्व किया। चित्रा -4 ए एक डीआरजी अनुभाग जहां न्यूरॉन्स और उनके आसपास के उपग्रह glial कोशिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं की एक immunohistochemical धुंधला पता चलता है। डीआरजी की सही पहचान करके यह घायल न्यूरॉन की सोमा पर और साथ ही अपने आसपास उपग्रह glial कोशिकाओं पर sciatic तंत्रिका चोटों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए संभव है। चित्रा 4 बी एक हाइड्रॉलिक निकाला रीढ़ की हड्डी के ऊतकों जहां बरकरार धारा की चिकनी किनारों से परिलक्षित होता है की एक Nissl धुंधला से पता चलता।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि ऊतक वर्गों। एक। डीआरजी खंड के Immunohistochemical धुंधला हो जाना। बी। Nissl दाग धाराहाइड्रॉलिक निकाला रीढ़ की हड्डी के एन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

स्पाइनल कॉलम, परेशान है गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जैसे, रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना के दौरान विभाजित होगा। रीढ़ की हड्डी निकाला नहीं जा सकता है, स्पाइनल कॉलम दोनों सिरों पर थोड़ा छंटनी की जा सकती है और बाहर निकालना प्रयास दोहराया जा सकता है। पूरे मामले में रीढ़ की हड्डी के आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, यानी गर्भाशय ग्रीवा वृद्धि के साथ ही काठ का इज़ाफ़ा से मिलकर, स्पाइनल कॉलम में केवल थोड़ा छंटनी की जानी चाहिए। केवल काठ का इज़ाफ़ा आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, तो रीढ़ की हड्डी वर्तमान प्रोटोकॉल के अनुसार छंटनी की जानी चाहिए। स्पाइनल कॉलम बाहर निकालना कम करने के लिए उंगलियों का उपयोग कर सीधा किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल सभी उम्र के मूषक के लिए लागू है और यहाँ एक वयस्क माउस (8 सप्ताह), एक माउस पिल्ला (5 दिन) और एक वयस्क चूहे (10 सप्ताह) द्वारा उदाहरण है। पशु प्रकार और तनाव के आधार पर, वक्ष और काठ वर्गों की संख्या 9 भिन्न हो सकते हैं, 10, 11। प्रोटीन पर निर्भर करता है कि विश्लेषण किया जाना, वयस्क मूषक इच्छामृत्यु के लिए पहले एंजाइम बाधा समाधान के साथ भरकर रखा जा सकता है। अगर एक प्रयोग एक तरफा तंत्रिका चोट से जुड़े प्रदर्शन, रीढ़ की हड्डी अल्ट्रा ठीक चिमटी का उपयोग कर तुरंत बाहर निकालना के बाद ipsilateral और contralateral पक्षों में विभाजित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक पक्ष पृष्ठीय और उदर पक्षों में विभाजित किया जा सकता है। ऊतक तो आगे के विश्लेषण, जैसे पश्चिमी सोख्ता के लिए कार्रवाई की जा सकती है।

पीएफए ​​रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना से पहले साथ Transcardial छिड़काव निर्धारण, बचा जाना चाहिए के रूप में इस रीढ़ की हड्डी गैर लचीला renders और रीढ़ की हड्डी हाइड्रोलिक बाहर निकालना रोकता है। हाइड्रोलिक रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना पृष्ठीय जड़ों से दूर आंसू जाएगा। प्रयोगों जहां जुड़ी पृष्ठीय जड़ों आवश्यक हैं के लिए, laminectomy की सिफारिश की है। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी तानिका हाइड्रोलिक बाहर निकालना है, जो मानक laminectomy से बचा जा सकता द्वारा खो रहे हैं

रीढ़ की हड्डी और डीआरजी अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना भी ठंडा पीबीएस के बजाय ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) का उपयोग किया जा सकता है। ACSF के उपयोग के लिए एक बेहतर मनोवैज्ञानिक वातावरण, जो बाद में electrophysiological रिकॉर्डिंग 12, 13 के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है में अलग ऊतक के संरक्षण के लिए अनुमति देता है। ACSF के लिए एक वैकल्पिक पीबीएस 1 जी / प्राथमिक डीआरजी संस्कृतियों 14 की पीढ़ी के लिए एल ग्लूकोज युक्त हो सकता है।

रीढ़ की हड्डी के हाइड्रोलिक बाहर निकालना laminectomy से रीढ़ की हड्डी अलगाव के पारंपरिक तरीके, ऊतक से निपटने के समय को कम करने और इसलिए प्रोटीन के नुकसान का खतरा कम की तुलना में काफी तेजी से विधि है। एक लगानेवाला के साथ छिड़काव से पहले laminectomy से रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग विच्छेदन के दौरान और के अंतिम हटाने के दौरान ऊतकों को नुकसान का खतरा कम हो सकता करने के लिएस्पाइनल कॉलम से रीढ़ की हड्डी। हालांकि, ऊतक निर्धारण इस तरह के पश्चिमी सोख्ता के रूप में विश्लेषण करने के लिए इसके लागू अलग करता है। हाइड्रोलिक बाहर निकालना पैदावार संरचनात्मक रूप से क्षतिग्रस्त ऊतकों को 3 विश्लेषण की एक व्यापक श्रृंखला के लिए उपयुक्त है।

DRGs की लगातार पहचान मुश्किल हो सकता है। हालांकि, इस जैसे sciatic तंत्रिका चोट के बाद ऊतक विश्लेषण के लिए आवश्यक है। costae करने के लिए उनके रिश्तेदार स्थानीयकरण के अनुसार DRGs नंबर रखकर DRGs लगातार पहचाना जा सकता है। रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का धुंधला DRGs के रूप में रूप में अच्छी तरह प्रोटोकॉल चरण 7 में उल्लिखित सचित्र ऊतक उपचार बदलाव के प्रदर्शन से अनुकूलित किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm F.S.C. (Fine Science Tools) # 14084-08 For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used
Centrifuge Eppendorf # 5427 R For centrifugation of homogenized tissue
Cryostat microtome Leica Biosystems # CM 3050 S For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used
Forceps, Dumont, # 3 F.S.C. (Fine Science Tools) # 11231-30 For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used
Forceps, Dumont, # 5 F.S.C. (Fine Science Tools) # 11252-20 For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% Abbott # 002185 For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic
Iso-pentane GPR rectapur VWR chemicals # 24872.298 For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic
Microtome Leica Biosystems # RM 2155 For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used
Paraffin wax pellets Sigma-Aldrich # 76243 For paraffin embedding; Other manufacturer may be used
Paraffin tissue embedding station Leica Biosystems # EG1160 For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used
Pellet pestel, motor cordless Sigma-Aldrich # Z359971-1EA For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used
Petri dish, 35 mm Thermo Fischer Scientific # 121V For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used
Petri dish, 100 mm Sigma-Aldrich # P7741 For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used
Phosphatase inhibitor, Phosstop Sigma-Aldrich # 04906845001 Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used
Pipette tip, 1-200 μL, no filter Sarstedt # 70.1189.105 For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used
Protease inhibitor, Complete Sigma-Aldrich # 05892791001 Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used
RNAlater solution Sigma-Aldrich # R0901 For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used
Rneasy Protect Mini KiT Qiagen # 74124 For RNA isolation; Other manufacturer may be used
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 Swann-Morton # REF0203 For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge Bochem # 4070 For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used
Scissors, 130 mm cutting edge Hounisen # 1902.0130 For isolation of spinal cord (adult rat)
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge F.S.C. (Fine Science Tools) # 15009-08 For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used
Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL Terumo # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X Leica # 10446370 Other manufacturer/type may be used
Sterile PBS GIBCO # 10010-015 For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm Terumo Neolus # NN-2325R For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm Terumo Neolus # NN-1838S Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used
Tissue-Tek Sakura # 4583 Tssue embedding material for later cryosectionning
TNE-lysis buffer VWR chemicals # 10128-582 For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 119 चूहे माउस हाइड्रोलिक रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना काठ का इज़ाफ़ा पृष्ठीय रूट ganglia
चूहे में रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia के अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना
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Richner, M., Jager, S. B., Siupka,… More

Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. J. Vis. Exp. (119), e55226, doi:10.3791/55226 (2017).

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