Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å isolere ryggmargen, samt å identifisere og isolere DRG 1, 2. Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen er en betydelig raskere metode enn den tradisjonelle måten å ryggmarg isolering ved laminektomi, dvs. ved å bryte ryggvirvler en om gangen, og denne fremgangsmåten reduserer risikoen for vevsskade forårsaket av disseksjon prosess 3, 4 . DRG kan være vanskelig å identifisere. Riktig identifisering er svært viktig for vev analyse, for eksempel etter isjiasnerven skade. Ved å nummerere DRG i henhold til deres lokalisering i forhold til costae kan DRG identifiseres konsekvent.
Tissue isolert ved hjelp av teknikkene vist her kan anvendes på et bredt spekter av analyser, inkludert Western blotting 5,6, qPCR 7 og immunhistokjemisk farging 8.
Ved identifisering av DRG, er det viktig å ta hensyn til at antall ryggmargssegmenter er kjent for å variere med dyretype og stamme 9, 10, 11. Fordelene med å utføre denne metoden i mus er det høye antallet av genmodifiserte varianter tilgjengelig og de relativt lave boutgifter. De fordeler ved anvendelse av rotter er den relativt høye vev utbytte og hvis involverer nerveskader, vil prosedyren bli lettet med størrelse.
Protocol
Alle dyrene ble håndtert i full overensstemmelse med danske og europeiske forskrifter. Tillatelse Nummer: 2012-15-2934.
1. Klargjøring av sprøyten for Hydraulisk Ekstrudering av ryggmargen
- For en voksen rotte, kan du bruke en 10 ml sprøyte. For en voksen mus, bruke en 5 ml sprøyte. For valper, bruk en 2,5 ml sprøyte.
- Juster en ikke-filter pipette universelt egnet for 2-200 ul pipetter ved å trimme den store enden av pipetten tips til den passer godt til sprøyten. Plasser den justerte pipettespissen på sprøyten. For valper, bruke en 23 G eller lignende nål i stedet for en justert pipette tips.
- Aspirer iskald steril PBS og forlater sprøyten på is inntil videre anvendelse.
2. Eutanasi
- Ikke utfør halshugging, da dette vil forstyrre ryggvirvler rende ekstrudering umulig.
- For voksen rotte / mus, avlive bruk av gass som CO 2 eller isoflurane. Disse stoffene er skadelige. Utfør dødshjelp i et avtrekksskap og håndtere stoffene i henhold til institusjonens retningslinjer. (OBS: CO 2: H280, P410, P403, isofluran: H361d, P260, P281, P280)
- For å sikre at gnagere er død, sikre fravær av refleks ved å knipe en pote med pinsett. Halshogge gnager bruk av store saks. For unger, avlive ved halshogging.
3. Isolering av ryggsøylen
- Dryss vann på pelsen til å kontrollere håret.
- Ved hjelp av en saks, kuttet opp pelsen langs ryggsøylen i en distal retning og isolere ryggsøylen ved å kutte på begge sider langs ryggsøylen forbi bekken ben. Skjær ryggmargen distalt til bekken bein med en saks.
MERK: rostrokaudale akse er betegnet som den proksimale-distale akse gjennom protokollen.- Trim ryggsøylen ved hjelp av en saks for å unngå proximal-mest og distal-de fleste områder, da disse kan gjøre ryggsøylen for S-formet for vellykket ryggmargen ekstrudering. Forsikre deg om at ryggmargen er synlig i begge ender. Hvis ryggmargen ikke er synlig, trim ryggsøylen med saks inntil ryggmargen blir synlig.
4. Hydraulisk Ekstrudering av ryggmargen
- Plasser en Petri-skål (100 mm i diameter) fylt med steril PBS på is.
- Rett ut ryggsøylen ved å påføre et pekefingeren på den bøyde del (proksimale mest slutten) av ryggsøylen, og derved utretting ryggsøylen så mye som mulig.
- For valper, unngå å bøye ryggsøylen, som ryggvirvlene vil bli forstyrret rende ryggmarg ekstrudering umulig.
- Sett pipettespissen (23 G nål for unger, alternativt 18 G nål for voksen mus) ved distal mest slutten av ryggsøylen. Hvis satt riktig, er spissen stabilisert i rygg hulrom.
- Sørg for at ryggsøylen blir rettet så mye som mulig. Påfør jevnt trykk, og press på ryggmargen i petriskål på is. Forsikre deg om at ryggmargen holdes fuktig på is ved å holde den i PBS inntil videre håndtering.
Figur 1: Representative ryggmargen. Hydraulisk ekstrudert ryggmargen. Fra venstre: voksen rotte, voksen mus, mus valp. Lumbale forstørrelser preget av boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Identifisering av de dorsale nerveknutene (DRG)
- Splitte ryggsøylen i to like store langsgående deler ved hjelp av saks og plasser delt ryggsøylen under mikroskopet.
- Identifiser T13 vertebra segment av finne festestedet av distal-mest costae på ryggsøylen betaler oppmerksomhet for ikke å forvirre costae med de nærliggende interkostalrom nerver. De distale-mest costae er festet til den proksimale delen av T13 vertebra segmentet og den T13 DRG er plassert distalt til virvel T13 og proksimalt til vertebra L1.
- Identifisere samtidige DRG i distal retning. For en voksen rotte, samtidige DRG vises hvit med klart synlig dorsal og ventral røtter. For en voksen mus, samtidig bruk av DRG vises hvit med klart synlig dorsal og ventral røtter. For valper, samtidig bruk av DRG fremstå som tydelige kuler.
Figur 2: Identifikasjon av DRG i ryggsøylen etter ekstrudering av ryggmargen. Ryggsøylen er delt slik at visualisering av DRG som antydet med piler. Eksemplifisert ved voksen rotte og mus valp. ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Isolering av DRG
- Antall petriskåler (30 mm i diameter) i henhold til de spesifikke DRG som skal isoleres, for eksempel L3, L4, L5. Fyll petriskåler med iskald steril PBS og plassere dem på is.
- Ved hjelp av mikro saks, klippe rygg og ventrale røttene så nær DRG som mulig for å slippe dem samtidig unngå å skade DRG.
- Med tuppen av lukkede pinsett, forsiktig øse ut DRG og overføre dem til tilsvarende nummererte petriskåler.
Figur 3: Representant isolert DRG. Fra venstre: voksen rotte, voksen mus, mus valp."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Behandling av vev for videre analyse
- Western blotting
- Isoler vevet område av interesse, for eksempel ryggmargen lumbar utvidelse. Hvis det er nødvendig, skille ryggmargen til ipsilaterale og kontralaterale sider og videre inn i dorsal og ventral horn.
- Plasser vev i lyseringsbuffer som TNE lyseringsbuffer (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 i dobbelt destillert H2O) inneholdende hensiktsmessige hemmere på is.
- Homogenisere vevet i ca. 30 s på is ved hjelp av en mekanisk maling pistill.
- -Sentrifuge i 15 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C og bruk supernatanten for videre behandling i henhold til standardprotokoller 5, 6 eller holde den overliggende væske ved -20 ° C inntil videre anvendelse.
- RNA-analyse
- Isoler vevet av interesse.
- Umiddelbart vevet i RNA stabilisering løsning for å stabilisere RNA for lagring.
- Isoler RNA i henhold til standard protokoller 7.
- Konverter RNA til cDNA og utføre qPCR i henhold til standard protokoller 7.
- immunhistokjemi
- For fersk frosset vev (gjelder ryggmargen):
- Forbered tørris pulver ved pulverisering tørre isbiter til et beløp tilsvarende to spiseskjeer med pulver. Dekk tørre isbiter i en klut og pulverisere kuber med en hammer. Plasser sølv folie (ca. 5 cm x 5 cm) på et lag av tørr isbiter og dekker sølvfolie med tørris pulver.
- Plasser ryggmargen området valgt for videre analyser på tørris pulver ved hjelp av pinsett, la det snap-fryse, og overføre ryggmargen til en cryo tube. Hold det på tørris til enhver tid eller lagre det ved -80 ° C inntil videre osse.
- Overfør ryggmargen til en kryostat (-20 ° C). Om nødvendig, trim ryggmargen inne kryostaten. Plasser ryggmargen i embedding materiale på innsiden kryostaten for å feste den til prøveplaten.
- Skjær ryggmargen i den ønskede tykkelse, for eksempel 5 um, og samler inn på glassplater. Varm glassplatene med en finger umiddelbart før vev samling for bedre feste. Holde noen left vev i kryo-rør ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
- La avsnittene om glassplater inne kryostaten til alt er klart for post fiksing.
- Post-fix seksjonene ved nedsenking i 4% PFA i 10 minutter ved romtemperatur.
- Utfør flekker i henhold til standard protokoller 8.
- Fast vev for kryo seksjonering (gjelder ryggmargen og DRG)
- Fiks ryggmarg og DRG i 4% PFA (2 h for ryggmarg, 1,5 timer for mus DRG og 4 timer for rotte-DRG) hos4 ° C (sted ryggmarg i horisontal stilling for å hindre den fra å feste i en bøyd stilling).
- Overfør vevet til 25% vekt / volum sukrose over natten ved 4 ° C. Vevet kan lagres i 25% vekt / volum sukrose supplert med noen få dråper av 10% natriumazid for å forhindre mikrobiell forurensning ved 4 ° C inntil videre anvendelse. Om nødvendig, trim ryggmargen å gjøre opp kors utvidelsen bare på en silikon bord eller lignende.
- Hjelp av tuppen på et papirhåndkle, suge overskudd av sukrose-løsning fra vevet.
- Fyll en cryo mold halvveis med embedding materiale. Skyv eventuelle bobler til sidene av cryo formen med verktøy som lukket pinsett.
- Plasser vev på embedding materialet ved hjelp av pinsett og sikre ønsket vev orientering.
- Fyll cryo formen helt med embedding materiale og presse noen bobler så langt borte fra vevet som mulig (for eksempel ved hjelp av lukkede pinsett).
- Fyll en petriskål (100 mmi diameter) med 2-methylbutane. Dette stoffet er skadelig. Utfør dette trinnet i en avtrekkshette og håndtere stoffet i henhold til institusjonens retningslinjer (OBS: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Sett petriskål på et lag av tørr is og tilsett to tørre isbiter til Petri-skålen. Plasser cryo formen i petriskålen og la den innebygging materiale for å fryse helt.
- Hold innleiret vev på tørris til enhver tid eller ved -80 ° C innpakket i Parafilm inntil videre behandling.
- Skjær vevet på en kryostat (-20 ° C) i den ønskede tykkelse, for eksempel 5 um.
- Utfør flekker i henhold til standard protokoller 8.
- Fast vev for parafin-embedding (gjelder ryggmargen og DRG)
- Fiks ryggmarg og DRG i 4% PFA (2 h for ryggmarg, 1,5 timer for mus DRG og 4 timer for rotte-DRG) ved 4 ° C (sted ryggmargi horisontal stilling for å hindre den fra å feste i en bøyd stilling).
- Overfør vevet til 25% vekt / volum sukrose over natten ved 4 ° C. Vevet kan lagres i 25% vekt / volum sukrose supplert med noen få dråper av 10% natriumazid for å forhindre mikrobiell forurensning ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
- Isoler vevet område av interesse, for eksempel ryggmargen lumbar utvidelse.
- Fyll en embedding mold halvveis med parafin.
- Avkjøl embedding mold kort ved å plassere den på kjøle område av embedding maskin for å herde parafin litt. Dette gir bedre vev posisjonering.
- Plasser vevet i ønsket orientering i innebygging formen. Fyll embedding formen med parafin og avkjøles umiddelbart.
- Plasser den parafinholdige innstøping form ved 4 ° C over natten for å la den stivne fullstendig og fjerne parafinblokk inneholdende vev fra forsenkningen formen.
- Cut seksjoner ona mikrotomen i den ønskede tykkelse, for eksempel 5 um.
- Utfør flekker i henhold til standard protokoller 8.
- For fersk frosset vev (gjelder ryggmargen):
Representative Results
Hydraulisk ekstrudert ryggmargen viser en glatt overflate uskadet vist i figur 1. Korsrygg utvidelse kan lett bli identifisert som den fortykkede området av ryggmargen, eske i figur 1. De dorsale og ventrale side av ryggmargen kan identifiseres ved øyet i henhold til morfologi. I figur 1 er det ventral siden som vender mot betrakteren, identifiseres ved en tydelig midtlinjen langs hele ryggmargen. To bredere linjer langs ryggmargen tillate identifikasjon av dorsalsiden. Ved den mest distale ende, kan cauda equina noen ganger være festet i voksne rotter og voksne mus.
Individuelle DRG kan bare identifiseres mens ligger i ryggsøylen, figur 2. Etter isolering, figur 3, kan de enkelte DRG ikke identifiseres ved hjelp av utseende. Hvis nødvendig, er det derforviktig å holde dem klart atskilt på isolasjon. Etter isolering kan ryggmargen og DRG behandles og farget som beskrevet i trinn 7.3 og representert på figur 4. Figur 4a viser en immunhistokjemisk farging av en DRG delen der nevroner og deres omkringliggende satellitt gliaceller er klart synlig. Ved riktig identifikasjon av DRG er det mulig å analysere effekten av sciatic nerve skader på soma av skadde nervecellen, samt på deres omkringliggende satellitt gliaceller. Figur 4b viser en Nissl farging av en hydraulisk ekstrudert ryggmargen der vevet er intakt som reflekteres av den glatte kantene av delen.
Figur 4: Representative vevssnitt. A. Immunhistokjemisk farging av DRG-delen. B. Nissl farget section av hydraulisk ekstrudert ryggmargen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Dersom ryggsøylen blir forstyrret, for eksempel ved cervikal dislokasjon, vil ryggmargen splittet under ekstrudering. Hvis ryggmargen ikke kan ekstruderes, kan ryggraden være trimmet litt i begge ender og ekstrudering forsøk kan gjentas. I tilfelle hele ryggmargen er nødvendig for videre analyse, det vil si bestående av nakke utvidelse så vel som den lumbale utvidelse, bør ryggsøylen bare trimmes noe. Hvis det trengs bare den lumbale utvidelse for ytterligere analyse, bør ryggmargen trimmes i henhold til den foreliggende protokoll. Ryggsøylen skal rettes ved hjelp av fingertuppene for å lette ekstrudering.
Protokollen gjelder gnagere i alle aldre, og er her eksemplifisert av en voksen mus (8 uker), en mus valp (5 dager) og en voksen rotte (10 uker). Avhengig av dyr type og belastning, kan antallet thorax og lumbale seksjoner variere 9, 10, 11. Avhengig av proteinene som skal analyseres, voksen gnagere kan bli perfusert med enzymhemmende løsninger før eutanasi. Hvis du utfører et eksperiment som involverer ensidig nerveskade, kan ryggmargen deles i ipsilaterale og kontralaterale sider ved hjelp av ultra-fine pinsett umiddelbart etter ekstrudering. Videre kan hver side være delt inn i dorsal og ventrale sider. Vevet kan deretter bli behandlet for videre analyser, for eksempel Western blotting.
Transcardial perfusjon-fiksering med PFA før ryggmargen ekstrudering bør unngås, da dette gjør det ryggmarg ikke-fleksibel og hindrer ryggmargen hydraulisk ekstrudering. Hydraulisk ryggmarg ekstrudering vil rive av Dorsalrøttene. For forsøk der festet Dorsalrøttene er nødvendig, laminectomy anbefales. Videre er spinale hjernehinnene tapt ved hydraulisk ekstrudering, noe som kan unngås ved hjelp av standard laminektomi Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen og DRG isolasjon kan også utføres ved hjelp av oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) i stedet for iskald PBS. Bruken av ACSF muliggjør bevaring av det isolerte vev i en bedre fysiologisk miljø, noe som er særlig viktig i tilfelle av etterfølgende elektrofysiologiske opptak 12, 13. Et alternativ til ACSF kan være PBS inneholdende 1 g / l glukose for generering av primær DRG-kulturer 14. Hydraulisk ekstrudering av ryggmargen er en betydelig raskere metode enn den tradisjonelle måten å ryggmarg isolering ved laminektomi, redusere vev-håndteringstiden og dermed redusere risikoen for skade på proteinet. Perfusjon med et fikseringsmiddel før isolering av ryggmargen etter laminektomi kan redusere risikoen for vevsskade i løpet av disseksjon og under den endelige fjerning avryggmarg fra ryggsøylen. Men utelukker vev fiksering sin anvendbarhet til analyser som Western blotting. Hydrauliske press gir strukturelt uskadet vev 3 passer for et bredere spekter av analyser. Konsistent identifikasjon av DRG kan være vanskelig. Men dette er viktig for vev analyse, for eksempel etter isjiasnerven skade. Ved å nummerere DRG i henhold til deres lokalisering i forhold til costae kan DRG identifiseres konsekvent. Farging av ryggmargen vev samt av DRG kan optimaliseres ved å utføre de illustrerte vev behandling som omtalt i protokollen trinn 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
References
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9, 82 (2016).
- Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Meikle, A. D., Martin, A. H. A rapid method for removal of the spinal cord. Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay. J Vis Exp. (40), (2010).
- Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections (2014).
- Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).
- Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
- Green, E. L. Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice. Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (35), (2010).
- Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia. Ann Anat. , 62-67 (2016).
- Peeraer, E., et al. Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy. J Pain Res. 4, 55-65 (2011).
