Introduction
O objectivo geral do presente método é isolar a medula espinal, bem como para identificar e isolar DRGs 1, 2. Extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, ou seja, quebrar as vértebras da coluna vertebral, um de cada vez, e este método reduz o risco de dano tecidual causado pelo processo de dissecção 3, 4 . DRGs podem ser difíceis de identificar. A correta identificação é muito importante para a análise do tecido, por exemplo, após a lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente.
Tecido isolado pelas técnicas demonstradas aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de análises incluindo Western blotting 5,6, 7 e qPCR coloração imuno-histoquímica 8.
Ao identificar DRGs, é importante ter em conta que o número de segmentos da medula espinhal é conhecida a variar com o tipo e estirpe de animais 9, 10, 11. As vantagens de executar este método em ratinhos são o elevado número de variantes geneticamente modificados disponíveis e as despesas relativamente baixas de habitação. As vantagens em utilizar os ratos são o rendimento do tecido relativamente alta e se envolvendo lesões nervosas, o procedimento será facilitado com o tamanho.
Protocol
Todos os animais foram manipulados em plena conformidade com os regulamentos dinamarqueses e europeus. permissão número: 2012-15-2934.
1. Preparação da Seringa por hidráulico Extrusão da Medula Espinhal
- Para um rato adulto, use uma seringa de 10 ml. Para um rato adulto, use uma seringa de 5 mL. Para filhotes, use uma seringa mL 2.5.
- Ajuste uma ponteira sem filtro universalmente adequado para 2-200 pipetas ul por aparar a extremidade da ponta da pipeta até que ele se encaixa com firmeza na seringa. Colocar a ponta da pipeta ajustado na seringa. Para filhotes, use um 23 G ou agulha similar ao invés de uma ponteira ajustado.
- Aspirar gelada PBS estéril e deixar a seringa no gelo até à sua utilização.
2. eutanásia
- Não execute deslocamento cervical, como isso vai perturbar a coluna vertebral tornando extrusão impossível.
- Para o adulto rat / mouse, eutanásia usando gás como o CO 2 ou isofluRane. Estas substâncias são prejudiciais. Executar a eutanásia em um exaustor e lidar com as substâncias de acordo com as diretrizes da instituição. (ATENÇÃO: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280)
- Para garantir que o roedor está morto, garantir a ausência de reflexo por beliscar uma pata com uma pinça. Decapitar o roedor usando tesoura grande. Para filhotes, eutanásia por decapitação.
3. Isolamento da coluna vertebral
- Borrifar água sobre a pele para controlar o cabelo.
- Utilizando um par de tesouras, o corte aberto da pele ao longo da coluna vertebral num sentido distal e isolar a coluna vertebral através do corte em ambos os lados ao longo da coluna vertebral além do osso pélvico. Cortar a medula espinhal distal ao osso pélvico com um par de tesouras.
NOTA: O eixo rostral-caudal é denotado como o eixo proximal-distal ao longo do protocolo.- Aparar a coluna vertebral utilizando um par de tesouras para evitar o proximal-mais e distais-maioria das áreas que estes podem tornar a coluna vertebral também em forma de S para o sucesso de extrusão medula espinhal. Certifique-se de que a medula espinhal é visível em ambas as extremidades. Se a medula espinhal não é visível, a guarnição da coluna vertebral com uma tesoura até a medula espinhal se torna visível.
4. hidráulico Extrusão da Medula Espinhal
- Coloque uma placa de Petri (100 mm de diâmetro) cheio com PBS estéril em gelo.
- Endireitar a coluna vertebral através da aplicação de um dedo indicador na parte dobrada (proximal a maior parte final) da coluna vertebral, endireitando assim a coluna espinal, tanto quanto possível.
- Para filhotes, evitar a flexão da coluna vertebral, as vértebras como será interrompido render extrusão medula espinal impossível.
- Insira a ponta da pipeta (23 G agulha para filhotes, alternativamente, 18 G agulha para ratos adultos) na distal-most final de coluna vertebral. Se inserido correctamente, a ponta é estabilizada na cavidade medular.
- Certifique-se de que a coluna vertebral é endireitada, tanto quanto possível. Aplicar pressão constante, e expulsar a medula espinhal na placa de Petri sobre gelo. Certifique-se que a medula espinhal é mantido úmido no gelo, mantendo-o em PBS até novo tratamento.
Figura 1: medulas espinhais representativos. Hidraulicamente extrudados medulas espinhais. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse. alargamentos lombares marcada pela box. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Identificação de gânglios das raízes dorsais (DRG)
- Dividir a coluna vertebral em duas partes longitudinais iguais, utilizando tesouras e colocar a coluna vertebral dividida sob o microscópio.
- Identificar o segmento T13 vértebra por localizar o local de ligação do distal-mais costae na coluna vertebral prestando atenção para não confundir o costae com os nervos intercostais nas proximidades. Os distal maioria costae estão ligados à parte proximal do segmento vértebra T13 eo T13 DRG está localizado distalmente ao T13 vértebra e proximal ao da vértebra L1.
- Identificar DRGs concomitantes no sentido distal. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para filhotes, DRGs concomitantes aparecem como esferas claras.
Figura 2: Identificação de DRG na coluna vertebral após a extrusão da medula espinhal. A coluna vertebral foi dividido permitindo a visualização de DRGs como indicado pelas setas. Exemplificado pelo rato adulto e filhote de cachorro mouse. ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Isolamento de DRGs
- Número pratos de Petri (30 mm de diâmetro) de acordo com as DRGs específicos a ser isolado, por exemplo, L3, L4, L5. Encha as placas de Petri com PBS gelado estéril e colocá-los em gelo.
- Usando micro tesouras, dorsal cortar e raízes ventrais tão perto dos DRGs quanto possível para libertá-los, evitando danificar os DRGs.
- Com a ponta da pinça fechadas, gentilmente retire DRGs e transferi-los para os correspondentes placas de Petri numeradas.
Figura 3: Representante isolado DRGs. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse."_blank"> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
7. processamento de tecidos para análise posterior
- western blotting
- Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral. Se necessário, separe a medula espinhal em lados ipsi e contralateral e mais para dorsal e ventral chifres.
- Colocar o tecido em tampão de lise, tais como lise tampão TNE (10 mM de base Tris, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de NP40 em dupla H2O destilada) contendo inibidores de enzimas apropriados em gelo.
- Homogeneizar o tecido durante aproximadamente 30 s sobre gelo utilizando um pilão de trituração mecânica.
- Centrifugar durante 15 minutos a 16000 xg, a 4 ° C e utilizar o sobrenadante para processamento adicional de acordo com protocolos padrão 5, 6 ou manter o sobrenadante a -20 ° C até à sua utilização.
- ARN-análise
- Isolar o tecido de interesse.
- Colocar imediatamente o tecido em solução de estabilização para estabilizar o ARN ARN para armazenamento.
- Isolar o ARN de acordo com protocolos convencionais 7.
- Converter o ARN em ADNc e executar qPCR de acordo com protocolos convencionais 7.
- A imuno-histoquímica
- Para o tecido fresco congelado (aplicável a medula espinhal):
- Prepare pó de gelo seco por pulverização cubos de gelo seco a um valor correspondente a duas colheres de sopa de pó. Cobrir cubos de gelo seco em um pano e pulverizar os cubos usando um martelo. Coloque a folha de prata (cerca de 5 cm x 5 cm) sobre uma camada de cubos de gelo seco e cobrir a folha de prata com pó de gelo seco.
- Coloque a área da medula espinhal seleccionado para posteriores análises sobre o pó de gelo seco, usando uma pinça, deixe-o snap-congelamento, e transferir a medula espinhal a um tubo de crio. Mantenha-o em gelo seco em todos os momentos ou armazená-lo a -80 ° C até mais USe.
- Transferir a medula espinal de um criostato (-20 ° C). Se necessário, cortar a medula espinhal dentro do criostato. Coloque a medula espinhal em material de incorporação dentro do criostato, a fim de anexá-lo ao disco de amostra.
- Cortar o cordão espinal na espessura desejada, por exemplo, 5 um, e recolher em placas de vidro. Aqueça as placas de vidro com um dedo imediatamente anteriores à colheita de tecidos para melhor fixação. Manter qualquer tecido restante em tubos de crio a -80 ° C até à sua utilização.
- Deixar as seções sobre placas de vidro dentro do criostato até estar pronto para pós-fixação.
- Pós-fixar as secções por imersão em PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente.
- Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8.
- tecido fixado para o seccionamento crio (aplicável a medula espinhal e DRGs)
- Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) em4 ° C (local de medula espinal em posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada).
- Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior. Se necessário, a guarnição da medula espinal para compensar o alargamento lombar, apenas em uma placa de silicone ou semelhante.
- Com a ponta de uma toalha de papel, aspirar a solução de sacarose em excesso a partir do tecido.
- Encher um meio caminho molde crio com material de incorporação. Empurre todas as bolhas para os lados do molde crio com ferramentas tais como pinças fechadas.
- Coloque o tecido sobre o material de incorporação, usando uma pinça e assegurar a orientação tecido desejado.
- Encher o molde com material de crio completamente a incorporação e empurrar quaisquer bolhas tão longe do tecido quanto possível (por exemplo, utilizando pinças fechadas).
- Encha uma placa de Petri (100 mmem diâmetro) com 2-metilbutano. Esta substância é prejudicial. Execute esta etapa em um exaustor e lidar com a substância, de acordo com as diretrizes da instituição (CUIDADO: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
- Colocar a placa de Petri sobre uma camada de gelo seco e adicionar dois cubos de gelo seco para a placa de Petri. Coloque o molde de crio na placa de Petri e permitir que o material de embutir para congelar completamente.
- Manter o tecido embebido em gelo seco em todos os momentos, ou a -80 ° C envolvido em Parafilm até ulterior processamento.
- Cortar o tecido num crióstato (-20 ° C) na espessura desejada, por exemplo, 5 | im.
- Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8.
- tecido fixo para parafina-incorporação (aplicável a medula espinhal e DRGs)
- Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) a 4 ° C (medula espinhal lugarem posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada).
- Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior.
- Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral.
- Preencher um meio caminho molde a incorporação com parafina.
- Arrefecer o molde brevemente a incorporação, colocando-o sobre a área de refrigeração da máquina incorporação para endurecer a parafina ligeiramente. Isto permite um melhor posicionamento do tecido.
- Colocar o tecido na orientação desejada no molde incorporação. Encha o molde de incorporação com parafina e se refrescar imediatamente.
- Coloque o molde contendo a incorporação de parafina, a 4 ° C durante a noite para deixar endurecer completamente e remover o bloco de parafina contendo o tecido a partir do molde de incorporação.
- seções de corte Snd micrótomo na espessura desejada, por exemplo, 5 | im.
- Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8.
- Para o tecido fresco congelado (aplicável a medula espinhal):
Representative Results
Medulas espinhais hidraulicamente extrudido apresentar uma superfície lisa sem danos mostrado na Figura 1. O alargamento lombar pode ser facilmente identificadas como a área mais espessa da medula espinal, encaixotado na Figura 1. Os lados dorsais e ventrais da espinal medula pode ser identificada a olho nu de acordo com a morfologia. Na Figura 1, o lado ventral está voltada para o observador, identificável por uma linha média clara ao longo de toda a medula espinhal. Duas linhas mais amplas ao longo da medula espinal permitir a identificação do lado dorsal. No distal mais-end, a cauda eqüina pode, por vezes permanecem ligados em ratos adultos e ratos adultos.
DRGs individuais só podem ser identificados, enquanto localizado na coluna vertebral, a Figura 2. A seguir ao isolamento, A Figura 3, os DRGs individuais não podem ser identificados pela aparência. Se necessário, é, por conseguinte,importante mantê-los claramente separados no isolamento. Após o isolamento, a medula espinal e DRGs podem ser processados e corados tal como descrito no passo 7.3 e representada na Figura 4. Figura 4a mostra uma coloração imuno-histoquímica de uma seção DRG onde os neurônios e suas células gliais satélite envolvente são claramente visíveis. Pela identificação correta do DRG é possível analisar o efeito de lesões do nervo ciático na soma do neurônio ferido, bem como sobre as suas células gliais por satélite circundantes. A Figura 4b mostra uma coloração de Nissl de uma medula espinal hidraulicamente extrudido em que o tecido está intacta tal como reflectido pelas extremidades lisas da secção.
Figura 4: cortes de tecido representativo. Uma. coloração imuno-histoquímica da secção DRG. B. Nissl manchado sectioN de medula espinal hidraulicamente extrudida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Se a coluna vertebral é perturbado, por exemplo, por deslocamento cervical, da medula espinhal vai dividir durante a extrusão. Se a medula espinal não pode ser extrudido, a coluna vertebral pode ser ligeiramente cortadas em ambas as extremidades e a tentativa de extrusão pode ser repetida. No caso de ser necessária toda a medula espinal para análise posterior, isto é, que consiste no alargamento do colo do útero, bem como o alargamento lombar, a coluna vertebral só deve ser ligeiramente cortadas. Se apenas o alargamento lombar é necessário para uma análise mais aprofundada, a medula espinhal deve ser aparado de acordo com o presente protocolo. A coluna vertebral deve ser esticado usando a ponta dos dedos para facilitar a extrusão.
O protocolo é aplicável para roedores de todas as idades e é aqui exemplificada por um rato adulto (8 semanas), um cachorro rato (5 dias) e um rato adulto (10 semanas). Dependendo do tipo de animal e tensão, o número de seções torácica e lombar pode variar 9, 10, 11. Dependendo das proteínas a ser analisada, roedores adultos pode ser perfundido com soluções inibidoras da enzima antes da eutanásia. Se realizar um experimento envolvendo a lesão do nervo unilateral, a medula espinhal podem ser divididos em lados ipsi e contralaterais, usando uma pinça ultra-finas imediatamente após a extrusão. Além disso, cada um dos lados pode ser dividida em lados dorsal e ventral. O tecido pode então ser processada para análises posteriores, por exemplo, transferência de Western.
Transcardial perfusão-fixação com PFA antes da extrusão da medula espinal deve ser evitada, já que isto torna a medula espinal não-flexível e impede medula espinal extrusão hidráulico. Hidráulica extrusão medula espinhal vai arrancar as raízes dorsais. Para experiências em que são necessários raízes dorsais em anexo, laminectomia é recomendado. Além disso, as meninges espinais são perdidas por extrusão hidráulico, o que pode ser evitado por laminectomia padrão extrusão hidráulico da medula espinal e do isolamento de DRG também poderia ser realizada utilizando oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF) em vez de PBS gelado. O uso de ACSF permite a preservação do tecido isolado em um melhor ambiente fisiológico, o que é particularmente importante no caso de gravações electrofisiológicos subsequentes 12, 13. Uma alternativa para ACSF poderia ser PBS contendo 1 g / l de glicose para a produção de culturas de DRG primário 14. extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, reduzindo o tempo de tratamento de tecido e, portanto, diminuindo o risco de danos proteína. A perfusão com um fixador, antes de se isolar a medula espinal por laminectomia pode reduzir o risco de danos no tecido durante a dissecção e durante a remoção final dada medula espinal a partir da coluna vertebral. No entanto, a fixação do tecido impede a sua aplicabilidade a análises, tais como transferência de Western. Rendimentos de extrusão hidráulicos estruturalmente tecido danificado 3 adequado para uma ampla gama de análises. identificação consistente de DRGs pode ser difícil. No entanto, isso é essencial para a análise de tecido, por exemplo, após lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Coloração de tecidos da medula espinal, bem como de DRGs podem ser optimizadas efectuando as variações de tratamento de tecido ilustradas descritas no protocolo de passo 7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100% | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μL, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1X and eyepiece 10X | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
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