Summary
Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.
Abstract
Functionaliteit van de motorische eindplaat (NMJ) speelt een cruciale rol bij de studie van de ziekten waar de communicatie tussen motor neuron en spier met gezichtsstoornissen, zoals veroudering en Amyotrofische laterale sclerose (ALS is). Hier beschrijven we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt voor het meten van NMJ functionaliteit door het combineren van twee soorten elektrische stimulatie: directe spierstimulatie membraan en de stimulatie door middel van de zenuw. De vergelijking van de spier reactie op deze twee verschillende stimulaties kunnen worden gedefinieerd, op het functionele niveau, mogelijke veranderingen in de NMJ die tot daling van de functionele in spier leiden.
Ex vivo preparaten zijn geschikt voor goed gecontroleerde studies. Hier beschrijven we een intensieve protocol voor het meten van verschillende parameters van spier- en NMJ functionaliteit voor de soleus-ischialgie zenuw voorbereiding alsmede voor de bereiding van de membraan-phrenic zenuw. Het protocol duurt ongeveer 60 minuten en onafgebroken wordt uitgevoerd door middel van een op maat gemaakte software die de kramp kinetiek eigenschappen, de relatie van de kracht-frequentie voor zowel spieren en zenuw stimulaties en twee parameters specifiek voor NMJ functionaliteit, d.w.z. transmissie storing en intratetanic vermoeidheid meet. Deze methode werd gebruikt voor het detecteren van schade in de soleus en het middenrif spier-zenuw preparaten met behulp van SOD1G93A transgene muis, een experimenteel model van ALS dat overal overexpresses de mutant anti-oxidant enzym superoxide dismutase 1 (SOD1).
Introduction
De motorische eindplaat (NMJ) is een chemische synapse gevormd door de verbinding tussen de motorische eindplaat van de spiervezel en de motor neuron axon terminal. De NMJ heeft aangetoond dat een cruciale rol spelen bij communicatie tussen spieren en zenuwen aangetast is, zoals gebeurt in veroudering of Amyotrofische laterale sclerose (ALS). Zoals spieren en zenuwen in een bidirectionele manier1,2 communiceren, zijnde kundig voor meten NMJ gebreken los van spier gebreken kunnen nieuwe inzichten in hun pathofysiologische samenspel. Inderdaad, deze functionele evaluatie kan helpen om te beoordelen of morfologische of biochemische veranderingen verminderen transmissie signalering van functionaliteit.
De vergelijking van spier contractiele reactie ontlokte door zenuwstimulatie en de reactie van de dezelfde spier opgeroepen door directe stimulatie van het membraan is voorgesteld als een indirecte meting van NMJ functionaliteit. Inderdaad, sinds membraan stimulatie door-pasjes transmissie signalering, eventuele verschillen in de twee contractiele reacties kunnen worden toegeschreven aan veranderingen in de NMJ. Deze aanpak is uitgebreid voorgesteld voor ratten3,4,5,6,7, en ook gebruikt om informatie te verzamelen over muis modellen8,9,10,11,12.
Hier beschrijven we in detail een procedure voor accijnzen en testen van twee spier-zenuw preparaten, d. w. z. de soleus-ischialgie en membraan-phrenic voorbereidingen. Met behulp van een op maat gemaakte software, we ontwierpen een continu testen protocol dat combineert de meting van de verschillende parameters die kenmerkend zijn voor zowel NMJ en spier-functionaliteit, waardoor opbrengst een uitgebreide evaluatie van NMJ schade apart van die van de spier. Met name meet het protocol de twitch force, de kinetiek van de spier, de kracht-frequentie curve voor directe en zenuw stimulaties, de transmissie storing13 voor zowel een afvuren en de tetanic frequenties en de intratetanic vermoeidheid7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol we beschreven informatie over functionele denervation in verschillende neuromusculaire ziekten of veroudering-sarcopenie. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of (en zo ja, op welk niveau) spier veranderingen zijn te wijten aan selectief veranderingen die zich in de spier zelf of in de neuromusculaire transmissie voordoen. De gegevens hieronder zijn de resultaten van een eerdere werk van onze groep18, uitgevoerd op het SOD1G93A transgeen muismodel van Amyotrofische laterale sclerose in het einde-stadium van de ziekte-20. De transgene muis SOD1G93A overexpresses overal de mutant anti-oxidant enzym superoxide dismutase 1 (SOD1). Figuren 3 en 4 tonen de dF/dt en tetanic geldende waarden voor de soleus-ischialgie zenuw (links) en de voorbereidingen van de membraan-phrenic zenuw (rechts). Deze resultaten bewijzen dat de staat van de techniek hier voorgesteld voor de opsporing van de functionele defecten in transgene spieren die gerelateerd zijn aan NMJ in tegenstelling tot die strikt verband houden met de spier zelf. Inderdaad, voor zowel dF/dt en tetanic kracht, de spieren van de soleus SOD1G93A weergegeven een verminderde contractiele reactie, in vergelijking met controle spier, wanneer rechtstreeks gestimuleerd, en een verdere verlaging wanneer gestimuleerd door de zenuw weergegeven. Daarentegen, werden milde veranderingen waargenomen in deze twee parameters als het middenrif spieren strips werden gestimuleerd door het membraan, overwegende dat belangrijke wijzigingen werden ontdekt als het middenrif spieren werd gestimuleerd door de zenuw.
Figuur 3 - Contractiele kinetiek. ± SEM van dF/dt betekenen voor de soleus (A) en het middenrif (B) voorbereidingen. Soleus exemplaren weergegeven een aanzienlijke vertraging neer wanneer rechtstreeks gestimuleerd (-27%), en een verdere daling wanneer gestimuleerd door de zenuw (-58%). Middenrif exemplaren weergegeven een vertragende alleen wanneer gestimuleerd door de zenuw (-30%). Aangepast van Rizzuto et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 - Tetanic kracht. ± SEM van tetanic specifieke kracht voor de soleus (A) en het middenrif (B) voorbereidingen betekenen. Soleus exemplaren weergegeven een aanzienlijke vertraging neer wanneer rechtstreeks gestimuleerd (-26%), en een verdere daling wanneer gestimuleerd door de zenuw (-50%). Middenrif exemplaren weergegeven een daling van de kracht slechts wanneer gestimuleerd door de zenuw (-44%). Aangepast van Rizzuto et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De evaluatie van intratetanic vermoeidheid en transmissie storing toegestaan NMJ specifieke parameters te meten. Figuur 5 toont de gemiddelde waarden van intratetanic vermoeidheid (IF) gemeten tijdens de tetanic vermoeidheid paradigma voor soleus spieren (figuur 5A) en middenrif strips (figuur 5B). Zoals gemeld in de sectie Protocol, werd het paradigma van de vermoeidheid dat we toegepast ontwikkeld op zodanige wijze te benadrukken de NMJ wel niet de spier. Dientengevolge, gemeten als voor de directe spierstimulatie is nooit gewijzigd. Inderdaad, als berekend voor de zenuwstimulatie is de parameter die moet worden beschouwd als voor vergelijkingen tussen verschillende muis stammen. Onze resultaten tonen dat de IF was beduidend lager in zowel transgene soleus en middenrif spieren dan in de controle-tegenhangers. Dit verschil werd groter in het middenrif, waarbij een kleine spier defect was gevonden, en kleiner in de soleus, waarin belangrijke spier schade al had gemeten. Het moet niet vergeten dat sinds de transgene Musculus soleus was aanzienlijk beschadigd, de NMJ evaluatie alleen correct voor maximaal 8 min van stimulatie, oftewel de tijd die nodig is voor transgene spier om terug te keren de null-waarde van kracht was wanneer gestimuleerd. Transgene soleus als waarden na 8 min van stimulatie in principe express lawaai.
Figuur 5 - Intratetanic vermoeidheid. Intratetanic vermoeidheid voor de soleus (A) en het middenrif (B) spieren weergegeven een significante afname van de transgene NMJ functionaliteit. Waarden zijn gemiddelde ± SEM. aangepast van Rizzuto et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 toont de transmissie mislukking op de tetanic frequentie gemeten in de soleus (figuur 6A) en het middenrif (figuur 6B) exemplaren. In overeenstemming met de resultaten als werd geen defect in transmissie ontdekt in de Musculus soleus, overwegende dat de middenrif spier specimens een aanzienlijke stijging in motorische eindplaat fatigability weergegeven.
Figuur 6 -Transmissie mislukking. Transmissie storing heeft niet alle wijzigingen weergegeven in de soleus spieren (B), terwijl een aanmerkelijke daling in NMJ functionaliteit in transgene belicht middenrif strips (B). Waarden zijn gemiddelde ± SEM. aangepast van Rizzuto et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het experimentele protocol hierboven beschreven biedt een ideale manier van meten en discriminerende functionele wijzigingen die hebben plaatsgevonden in de spier direct of niet indirect op het niveau van de motorische eindplaat. Aangezien deze techniek is gebaseerd op een indirecte meting van NMJ functionaliteit, kan het niet worden gebruikt om vast te stellen als een defect is gerelateerd aan morfologische veranderingen of aan biochemische veranderingen. Daarentegen biedt het een effectieve manier om te bepalen of wijzigingen van morfologische of biochemische transmissie signalering van functionaliteit hebben verminderd. Echter als kracht metingen zijn uitgevoerd, kan de spier worden verwijderd uit het bad, uitgewist, vastgemaakt op optimale lengte, omringd door insluiten compound en snel ingevroren in het smelten van tolueen. Spieren kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor latere evaluatie, zoals voor de immunohistochemische en morfologische analyse.
De techniek die we hier voorstellen is gebaseerd op een experimenteel testen protocol dat combineert, voor de eerste keer, het meten van verschillende parameters karakteriseren NMJ en spier-functionaliteit. Drie cruciale punten zorgen ervoor dat deze techniek betrouwbare resultaten levert.
Eerst, hoewel skeletspieren excisie nu een relatief vaak voor techniek is, extra zorg moet worden genomen bij het uitvoeren van de chirurgische ingreep om te houden van de zenuw met de spier intact. Vermogen van de exploitant moet dus worden getest op muizen controle voordat een ander experimentele model is tot stand gebracht. Bij controle de muizen, de spier contractiele reacties op directe en indirecte stimulaties naar hetzelfde, waardoor een controle van de exploitant chirurgische vermogen verwachting.
Een ander cruciaal punt is de noodzaak om ervoor te zorgen dat directe pulsen de spier niet door stimulerende intra musculaire takken van de zenuw activeert en dat de pulsen toegepast op de zenuw de spier niet op een artefactual manier door het verspreiden van huidige in het bad activeert. Het eerste punt kan worden getest door het uitvoeren van een aparte set van experimenten waarin de spier wordt gestimuleerd rechtstreeks op het membraan, zowel vóór als na D-tubocurarine (25 µM) is toegevoegd aan de fysiologische bad. Zodra de huidige waarde van supramaximal is vastgesteld, moet de spier reactie niet worden gewijzigd door toevoeging van D-tubocurarine. Het tweede punt is gerelateerd aan de lengte van de verwijderde zenuw, en is dus gevoeliger voor variatie. De stroom bij de zuig elektrode moet worden geëvalueerd vóór het begin van elke proef, zoals beschreven in de sectie protocol.
Tot slot, aangezien NMJ functionaliteit is beoordeeld door vergelijking van de spier reactie op directe en indirecte stimulatie, de elektrische pulsen moeten worden gesynchroniseerd zeer nauwkeurig. Dit punt is bijzonder belangrijk voor de twee vermoeidheid paradigma's aan het einde van het protocol waarin wordt de spier eenmaal gestimuleerd op het membraan en 14 keer via de zenuw. Aangezien zowel de fasen van de stimulatie en de rusttijden zeer laag zijn (0,33 s en 0.67 s voor het middenrif), zelfs een geringe vertraging zou leiden tot een onevenwichtige stimulatie van één van de twee compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Werk in de auteurs laboratorium werd gesteund door de Fondazione Roma en Telethon (verlenen neen. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
