Summary
एक कार्यात्मक आकलन neuromuscular जंक्शन (NMJ) की मांसपेशियों और तंत्रिका के बीच संचार पर आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यहाँ हम व्यापक NMJ और मांसपेशी दोनों दो अलग पेशी तंत्रिका तैयारी, अर्थात् soleus-कटिस्नायुशूल और डायाफ्राम phrenic का उपयोग कर कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
Neuromuscular जंक्शन (NMJ) कार्यक्षमता जब मोटर न्यूरॉन और मांसपेशियों के बीच संचार, जैसे उम्र बढ़ने और amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) बिगड़ा हुआ है, जिसमें रोगों का अध्ययन एक निर्णायक भूमिका निभाता है। यहाँ हम बिजली की उत्तेजना के दो प्रकार के संयोजन के द्वारा NMJ कार्यक्षमता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन: प्रत्यक्ष मांसपेशियों झिल्ली उत्तेजना और उत्तेजना तंत्रिका के माध्यम से। मांसपेशी प्रतिक्रिया इन दो भिन्न stimulations की तुलना, कार्यात्मक स्तर, जो मांसपेशियों में कार्यात्मक गिरावट के लिए नेतृत्व NMJ में संभावित बदलाव पर निर्धारित करने के लिए मदद कर सकते हैं।
Ex vivo तैयारी अच्छी तरह से नियंत्रित अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। यहाँ हम मांसपेशियों और soleus-कटिस्नायुशूल तंत्रिका तैयार करने के लिए और डायाफ्राम phrenic तंत्रिका की तैयारी के लिए NMJ कार्यक्षमता के कई मापदंडों को मापने के लिए एक गहन प्रोटोकॉल का वर्णन। प्रोटोकॉल लगभग 60 मिनट के लिए रहता है और वसुधा एक कस्टम बनाया के माध्यम से आयोजित किया जाता है सॉफ्टवेयर है कि चिकोटी कैनेटीक्स गुण, मांसपेशियों और तंत्रिका stimulations के लिए बल-आवृत्ति संबंध और दो पैरामीटर NMJ कार्यक्षमता के लिए, विशिष्ट यानी neurotransmission विफलता और intratetanic थकान के उपाय। यह पद्धति SOD1G93A ट्रांसजेनिक मूषक, खासे उत्परिवर्ती एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses ALS के एक प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग कर soleus और डायाफ्राम स्नायु तंत्रिका तैयारी में क्षति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
Introduction
Neuromuscular जंक्शन (NMJ) एक रासायनिक अन् तर्ग्रथन मांसपेशी फाइबर के मोटर endplate और मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु टर्मिनल के बीच कनेक्शन द्वारा गठित है। NMJ मांसपेशियों और तंत्रिका के बीच संचार, उम्र बढ़ने या amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) में उत्पन्न होते ही बिगड़ा हुआ है, जब एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाया गया है। मांसपेशियों और तंत्रिका एक द्विदिश तरीका1,2में संवाद के रूप में, मांसपेशियों दोषों से अलग NMJ दोष के उपाय करने में सक्षम होने के नाते उनके physiopathological परस्पर क्रिया में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। वास्तव में, यह कार्यात्मक मूल्यांकन आकलन है कि गुणों या जैव रासायनिक परिवर्तन कार्यक्षमता संकेत दे neurotransmission को कम करने के लिए मदद कर सकते हैं।
मांसपेशी सिकुड़ा प्रतिक्रिया द्वारा तंत्रिका उत्तेजना और एक ही पेशी द्वारा अपनी झिल्ली की प्रत्यक्ष उत्तेजना पैदा की प्रतिक्रिया हासिल की तुलना एक अप्रत्यक्ष माप NMJ कार्यक्षमता के रूप में प्रस्तावित किया गया है। दरअसल, संकेतन झिल्ली उत्तेजना से गुजरता neurotransmission के बाद से, दो सिकुड़ा उत्तर में किसी भी अंतर माना जा सकता NMJ में परिवर्तन करने के लिए। इस दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर चूहों3,4,5,6,7के लिए प्रस्तावित है, और भी माउस मॉडल8पर,9,10,11,12जानकारी इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया।
यहाँ, हम विस्तार में उत् पाद क और दो मांसपेशियों तंत्रिका तैयारी, i. e. soleus-कटिस्नायुशूल और डायाफ्राम phrenic तैयारी का परीक्षण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। एक कस्टम बनाया का उपयोग सॉफ्टवेयर, हम डिजाइन NMJ और मांसपेशियों की कार्यक्षमता, विशेषताएँ कई मानकों के माप को जोड़ती है एक सतत परीक्षण प्रोटोकॉल जिससे NMJ नुकसान का एक व्यापक मूल्यांकन अलग-अलग कि मांसपेशियों से उपज। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल चिकोटी ताकत, मांसपेशियों कैनेटीक्स, प्रत्यक्ष के लिए बल-आवृत्ति वक्र और तंत्रिका stimulations, neurotransmission विफलता13 दोनों एक फायरिंग और tetanic आवृत्तियों, और7intratetanic थकान के लिए उपाय।
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Representative Results
कई neuromuscular बीमारी या उम्र बढ़ने-sarcopenia में कार्यात्मक denervation पर हम वर्णित इस प्रोटोकॉल जानकारी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल चाहे (और, यदि हां, तो किस स्तर पर) निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा कर सकते हैं मांसपेशियों परिवर्तन कर रहे हैं चयनात्मक परिवर्तन या neuromuscular संचरण ही मांसपेशियों में होने वाली के कारण। नीचे दिखाए गए डेटा amyotrophic पार्श्व काठिन्य रोग20का अंतिम-चरण में का SOD1G93A ट्रांसजेनिक मूषक मॉडल पर किए गए हमारे समूह18, द्वारा एक पिछले काम के परिणाम हैं। SOD1G93A ट्रांसजेनिक मूषक को उत्परिवर्ती एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम superoxide dismutase 1 (SOD1) overexpresses. आंकड़े 3 और 4 में dF/डीटी और tetanic बल मान soleus कटिस्नायुशूल तंत्रिका (बाएं) और डायाफ्राम phrenic तंत्रिका (सही) की तैयारी के लिए दिखा। ये परिणाम यहाँ NMJ करने के लिए सख्ती से संबंधित मांसपेशियों को ही उन लोगों को विरोध से संबंधित हैं ट्रांसजेनिक मांसपेशियों में कार्यात्मक दोषों का पता लगाने के लिए प्रस्तावित तकनीक की क्षमता प्रदर्शित करता है। दरअसल, दोनों dF/डीटी और tetanic बल के लिए, एक कम सिकुड़ा प्रतिक्रिया, जब सीधे को प्रेरित किया, और एक और कटौती जब प्रेरित तंत्रिका के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता मांसपेशी नियंत्रण, के साथ तुलना में SOD1G93A soleus मांसपेशियों प्रदर्शित। जब झिल्ली के माध्यम से, डायाफ्राम मांसपेशी स्ट्रिप्स प्रेरित थे जब डायाफ्राम पेशी तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित किया गया महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाया गया, जबकि इसके विपरीत, हल्के परिवर्तन इन दो मापदंडों में मनाया गया।
आंकड़ा 3 - सिकुड़ा कैनेटीक्स. Soleus (A) और डायाफ्राम (B) की तैयारी के लिए ± SEM dF/डीटी का मतलब है। जब सीधे प्रेरित soleus नमूने नीचे प्रदर्शित एक महत्वपूर्ण धीमा (-27%), और जब तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित एक और कमी (-58%)। डायाफ्राम नमूने प्रदर्शित एक जब केवल तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित धीमा (-30%)। Rizzuto एट अल. 18से रूपांतरित किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4 - Tetanic बल. ± SEM tetanic विशिष्ट बल के soleus (A) और डायाफ्राम (B) की तैयारी के लिए मतलब। जब सीधे प्रेरित soleus नमूने नीचे प्रदर्शित एक महत्वपूर्ण धीमा (-26%), और जब तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित एक और कमी (-50%)। डायाफ्राम नमूने प्रदर्शित जब केवल तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित बल कमी (-44%)। Rizzuto एट अल. 18से रूपांतरित किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Neurotransmission विफलता और intratetanic थकान का मूल्यांकन मापा जा करने के लिए विशिष्ट पैरामीटर NMJ की अनुमति दी। चित्रा 5 (यदि tetanic थकान प्रतिमान soleus मांसपेशियों (चित्रा 5A) के दौरान मापा) intratetanic थकान के औसत मान से पता चलता है और डायाफ्राम (चित्रा 5B) स्ट्रिप्स। प्रोटोकॉल अनुभाग में रिपोर्ट की गई के रूप में, हम लागू थकान प्रतिमान नहीं पेशी NMJ हालांकि तनाव करने के लिए ऐसी एक तरह में विकसित किया गया था। प्रत्यक्ष मांसपेशियों उत्तेजना कभी नहीं बदल दिया गया था के लिए एक परिणाम के रूप में, अगर मापा। वास्तव में, यदि अभिकलन तंत्रिका उत्तेजना है कि अलग अलग माउस उपभेदों के बीच तुलना के लिए विचार किया जाना चाहिए पैरामीटर के लिए। हमारे परिणाम दिखाएँ IF ट्रांसजेनिक soleus और नियंत्रण समकक्षों में डायाफ्राम मांसपेशियों की तुलना में काफी कम था। इस अंतर डायाफ्राम, जो में एक छोटे मांसपेशियों दोष का पता लगाया गया था, में अधिक से अधिक और छोटे soleus में जो महत्वपूर्ण मांसपेशी क्षति पहले से ही मापा था, में था। यह ट्रांसजेनिक soleus पेशी काफी क्षतिग्रस्त हो गया था के बाद से, NMJ मूल्यांकन केवल उत्तेजना, जो यह नल मान जब प्रेरित बल देने के लिए ट्रांसजेनिक मांसपेशियों के लिए लेता है समय की अप करने के लिए 8 मिनट के लिए सही था कि मन में वहन किया जाना चाहिए। ट्रांसजेनिक soleus यदि मान उत्तेजना के 8 मिनट बाद शोर मूल रूप से व्यक्त करते हैं।
चित्रा 5 - Intratetanic थकान. Intratetanic थकान soleus (A) और डायाफ्राम (B) मांसपेशियों के लिए ट्रांसजेनिक NMJ कार्यक्षमता में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित। मान Rizzuto एट अल. 18से मतलब ± SEM. अनुकूलित कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Tetanic आवृत्ति (चित्रा 6A) soleus और डायाफ्राम (आंकड़ा 6B) नमूनों में मापा पर आंकड़ा 6 neurotransmission की विफलता से पता चलता है। जबकि डायाफ्राम मांसपेशी नमूने neuromuscular जंक्शन fatigability में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित अगर परिणाम ध्यान में रखते हुए, soleus मांसपेशी में, neurotransmission में कोई दोष पाया गया।
आरेख 6 -Neurotransmission विफलता. Neurotransmission विफलता किसी भी परिवर्तन soleus मांसपेशियों (A) में प्रदर्शित किया था नहीं, डायाफ्राम स्ट्रिप्स (ख) जबकि ट्रांसजेनिक में NMJ कार्यक्षमता में एक महत्वपूर्ण कमी को उजागर। मान Rizzuto एट अल. 18से मतलब ± SEM. अनुकूलित कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को मापने और मांसपेशियों में सीधे या हुई है कोई कार्यशील परिवर्तन भेदभाव परोक्ष रूप से neuromuscular जंक्शन के स्तर पर एक आदर्श तरीका प्रदान करता है। चूंकि इस तकनीक NMJ कार्यक्षमता के एक अप्रत्यक्ष माप पर आधारित है, यह तो किसी भी दोष गुणों में परिवर्तन या जैव रासायनिक परिवर्तन करने के लिए से संबंधित है स्थापित करने के लिए किया जा सकता। इसके विपरीत, यह चाहे किसी भी गुणों या जैव रासायनिक परिवर्तन कार्यक्षमता संकेतन neurotransmission कम है का निर्धारण करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। हालांकि, बल माप पूरा कर रहे हैं के बाद, पेशी कर सकते हैं हो स्नान से निकाल दिया, blotted, अधिकतम लंबाई पर टिकी, एम्बेडिंग यौगिक द्वारा घेर लिया और तेजी से isopentane के पिघलने में जमे हुए। मांसपेशियों के लिए मूल्यांकन के बाद,-80 ° C पर जैसे immunohistochemical और मोर्फोलिजिकल विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जा सकता।
हम यहाँ का प्रस्ताव तकनीक, पहली बार के लिए, कई निस्र्पक NMJ और मांसपेशियों की कार्यक्षमता मानकों के माप को जोड़ती है एक प्रयोगात्मक परीक्षण प्रोटोकॉल पर आधारित है। तीन महत्वपूर्ण अंक सुनिश्चित करें कि यह तकनीक विश्वसनीय परिणाम अर्जित करता।
कंकाल की मांसपेशी छांटना अब एक अपेक्षाकृत आम तकनीक है, हालांकि पहले, अतिरिक्त देखभाल जब शल्य प्रक्रिया करने के लिए तंत्रिका पेशी के साथ बरकरार रखने के लिए लिया जाना चाहिए। किसी भी अन्य प्रयोगात्मक मॉडल का प्रयास किया गया है इससे पहले कि संचालक की क्षमता इस प्रकार नियंत्रण चूहों पर परीक्षण किया जा चाहिए। नियंत्रण चूहों में, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष stimulations मांसपेशी सिकुड़ा जवाब एक ही है, इस प्रकार एक नियंत्रित करने के लिए ऑपरेटर की शल्य चिकित्सा करने की क्षमता प्रदान होने की उम्मीद कर रहे हैं।
एक और महत्वपूर्ण बात कि प्रत्यक्ष दालों पेशी तंत्रिका के उत्तेजक अंतर पेशी शाखाओं द्वारा सक्रिय नहीं करते हैं और तंत्रिका करने के लिए लागू की गई दालों पेशी के प्रसार द्वारा एक artefactual तरह से स्नान में वर्तमान में सक्रिय नहीं करते हैं कि यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है। पहली बात है जिसमें पेशी उत्तेजित प्रयोगों का एक अलग सेट सीधे झिल्ली पर दोनों से पहले और D-tubocurarine के बाद प्रदर्शन द्वारा परीक्षण किया जा सकता (25 माइक्रोन) शारीरिक स्नान के लिए जोड़ा गया है। Supramaximal वर्तमान मान निर्धारित किया गया है एक बार, मांसपेशी प्रतिक्रिया के अलावा D-tubocurarine के द्वारा बदल दिया जाना चाहिए नहीं। दूसरी बात excised तंत्रिका की लंबाई करने के लिए संबंधित है, और इस प्रकार परिवर्तन करने के लिए और अधिक संभावना है। वर्तमान चूषण इलेक्ट्रोड में प्रत्येक टेस्ट की शुरुआत से पहले प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
चूंकि NMJ कार्यक्षमता मांसपेशी प्रतिक्रिया करने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष उत्तेजना की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, अंत में, बिजली दालों बहुत ठीक सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। इस बिंदु जिस दौरान पेशी एक बार झिल्ली पर और 14 बार तंत्रिका के माध्यम से प्रेरित है प्रोटोकॉल के अंत में दो थकान मानदंड के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। चूंकि दोनों उत्तेजना चरणों और बाकी समय बहुत कम हैं (0.33 s और 0.67 s डायाफ्राम के लिए), यहां तक कि एक बहुत कम अंतराल एक असंतुलित उत्तेजना दो डिब्बों में से एक के लिए नेतृत्व करेंगे।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक प्रयोगशाला में काम Fondazione रोमा और Telethon द्वारा (कोई अनुदान. समर्थित किया गया था GGP14066)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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