Summary
Функциональной оценки нервно-Джанкшен (NMJ) может обеспечить важную информацию о связи между мышц и нервов. Здесь мы описываем протокол всесторонне оценить функциональность NMJ и мышц, с использованием двух различных мышц нерва препаратов, т.е. камбаловидной седалищного нерва и диафрагма диафрагмального.
Abstract
Функциональность нервно-Джанкшен (NMJ) играет решающую роль при изучении заболеваний, в которых связь между двигательного нейрона и мышечные нарушения, такие, как старение и боковой амиотрофический склероз (ALS). Здесь мы описываем экспериментальный протокол, который может использоваться для измерения NMJ функциональность путем объединения двух видов электрической стимуляции: прямой стимуляции мышц мембраны и стимуляции через нерв. Сравнение мышцы реакции на эти два разных стимуляцию могут помочь определить, на функциональном уровне, потенциальные изменения в NMJ, которые приводят к функциональной сокращение мышц.
Ex vivo препараты подходят для хорошо контролируемых исследований. Здесь мы описываем интенсивного протокол измерения несколько параметров мышц и NMJ функциональность для подготовки камбаловидной седалищного нерва и для подготовки диафрагма диафрагмального нерва. Протокол длится около 60 минут и проводится непрерывно с помощью заказной программного обеспечения, который измеряет дергаться кинетики свойства, отношения силы частоты для стимуляции мышц и нервов и двух параметров, специфичных для NMJ функциональность, т.е. отказ синапсах и intratetanic усталость. Эта методология была использована для выявления повреждений в подготовке нерва мышц камбаловидной и диафрагмы с помощью SOD1G93A трансгенные мыши, Экспериментальная модель ALS, что повсеместно overexpresses мутант антиоксидант фермента супероксиддисмутаза 1 (SOD1).
Introduction
Нервно-Джанкшен (NMJ) является химический СИНАПС формируется связь между мотор концевую мышечные волокна и аксон мотонейрона терминала. Было показано, что NMJ играть решающую роль, когда связь между мышц и нервов нарушается, как происходит старение или боковой амиотрофический склероз (ALS). Как мышцы и нервные общаться в двунаправленный путь1,2, возможность измерения дефектов NMJ отдельно от мышечные дефекты может обеспечить новое понимание их взаимосвязи выкидышей. Действительно эта функциональная оценка может помочь оценить ли Морфологические и биохимические изменения уменьшить синапсах, сигнализации функциональности.
Сравнение мышц сократительной ответ вызвал стимуляции нерва и ответ же мышцы, вызываемые прямой стимуляции ее мембраны было предложено как косвенное измерение NMJ функциональности. Действительно начиная с мембраны стимуляции путем пропуска синапсах сигнализации, любые различия в двух сократительных реакций можно объяснить изменения в NMJ. Такой подход широко предложил для крыс3,4,5,6,7и также используется для сбора информации о мыши модели8,9,10,,1112.
Здесь мы подробно описать процедуру акцизный и протестировать две мышцы нерва препараты, т. е. камбаловидной седалищного нерва и диафрагма диафрагмального препаратов. С помощью заказной программного обеспечения, мы разработали непрерывного тестирования протокол, который сочетает в себе измерение нескольких параметров, которые характеризуют NMJ и мышц функциональность, тем самым давая всеобъемлющую оценку ущерба NMJ отдельно от этого мышцы. В частности Протокол измеряет силу дергаться, кинетики мышц, кривая силы частот для прямого и нерва стимуляции, отказ синапсах13 для стрельбы и столбнячной частот и intratetanic усталость7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, который мы описали содержит информацию о функциональных денервации в несколько нервно-мышечных заболеваний или старения саркопения. Этот протокол может использоваться для определения (и, если да, то на каком уровне) мышечные изменения, из-за избирательного изменения, которые происходят в мышцах, сам или в нервно-мышечной передачи. Данные, показанные ниже приведены результаты предыдущей работы нашей группы18, проведенных на SOD1G93A трансгенные мыши модели боковой амиотрофический склероз в терминальной стадии болезни20. SOD1G93A трансгенные мыши повсеместно overexpresses мутант антиоксидант фермента супероксиддисмутаза 1 (SOD1). Рисунки 3 и 4 Показать dF/dt и столбнячной силы значения для камбаловидной седалищного нерва (слева) и для подготовки диафрагма диафрагмального нерва (справа). Эти результаты демонстрируют способность техники, предлагаемые здесь для выявления функциональных дефектов в трансгенных мышц, которые связаны с NMJ в отличие от тех, строго относящиеся к мышце само. Действительно SOD1G93A мышц камбаловидной отображается для dF/dt и столбнячной силы, снижение сократительной ответ, по сравнению с контролем мышц, когда непосредственно стимулирует и дальнейшее сокращение при стимуляции через нерв. Напротив мягкий изменения наблюдались в этих двух параметров при полоски мышцы диафрагмы были стимуляции через мембрану, тогда как значительные изменения были обнаружены, когда мышца диафрагмы была простимулирована через нерв.
Рисунок 3 - Сократительная кинетика. Означать ± SEM dF/dt для камбаловидной (A) и мембранные (B) препаратов. Образцы камбаловидной отображается значительное замедление вниз когда непосредственно стимулирует (-27%) и дальнейшее снижение при стимуляции через нерв (-58%). Диафрагма образцов отображается замедления только при стимуляции через нерв (-30%). Адаптировано из Риццуто et al. 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 - Столбнячной силы. Означать ± SEM столбнячной конкретных сил для камбаловидной (A) и мембранные (B) препаратов. Образцы камбаловидной отображается значительное замедление вниз когда непосредственно стимулирует (-26%) и дальнейшее снижение при стимуляции через нерв (-50%). Диафрагма образцов отображается уменьшение силы только при стимуляции через нерв (-44%). Адаптировано из Риццуто et al. 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Оценки intratetanic усталость и синапсах отказа допускается NMJ конкретные параметры быть измерены. Рисунок 5 показывает средние значения intratetanic усталость (если) измеряется в ходе парадигмы столбнячной усталости мышц камбаловидной (Рисунок 5A) и диафрагмы полосы (Рисунок 5B). Как сообщалось в разделе протокол, парадигма усталости, которую мы применили был разработан таким образом, чтобы подчеркнуть NMJ хотя не мышцы. В результате если измеренная для прямой мышечной стимуляции никогда не было изменено. Действительно если вычисленное для стимуляции нерва является параметром, который должна рассматриваться для сравнения между различными мыши штаммов. Наши результаты показывают, что если была значительно ниже в трансгенных камбаловидной и мышцы диафрагмы, чем в экземплярах управления. Эта разница была больше в диафрагмы, в котором был обнаружен дефект мелких мышц, и меньше в камбаловидной, в котором уже измерили повреждения значительные мышц. Следует помнить, что поскольку трансгенные камбаловидной мышце был значительно поврежден, NMJ оценки было только правильным до 8 минут стимуляции, которое представляет собой время, необходимое для трансгенных мышцы, чтобы возвратить значение null силы при стимуляции. Трансгенные камбаловидной если значения после 8 минут стимуляции в основном Экспресс шум.
Рисунок 5 - Intratetanic усталость. Intratetanic усталость камбаловидной (A) и мембранные (B) мышцы отображается значительное уменьшение трансгенных NMJ функциональность. Значения среднее ± SEM. адаптировано из Риццуто et al. 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 показывает синапсах провал на столбнячной частота измеряется в камбаловидной (рис. 6A) и мембранные (Рисунок 6B) образцов. В соответствии с если результаты не дефект в синапсах был обнаружен в камбаловидной мышце, в то время как образцы мышц диафрагмы отображается значительное увеличение в нервно-Джанкшн утомляемость.
Рисунок 6 -Сбой синапсах. Синапсах провал в мышц камбаловидной (A) не отображаются какие-либо изменения, в то время, как отметил значительное уменьшение NMJ функциональность в трансгенных полосы диафрагмы (B). Значения среднее ± SEM. адаптировано из Риццуто et al. 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальный протокол, описанные выше обеспечивает идеальный способ измерения и дискриминацию любые функциональные изменения, которые произошли непосредственно в мышцы или косвенно на уровне нервно-Джанкшен. Так как эта техника основана на косвенные измерения NMJ функциональность, не может использоваться для создания, если неисправность связана морфологические изменения или биохимические изменения. Наоборот она предоставляют эффективный способ определения ли Морфологические и биохимические изменения сократили синапсах, сигнализации функциональности. Однако после завершения измерения силы, мышцы могут быть удалены из ванны, смыл, возлагали на оптимальную длину, окружении внедрения комплекса и быстро замороженных в плавления изопентана. Мышцы могут храниться при температуре-80 ° C для последующей оценки, такие как для иммуногистохимии и морфологического анализа.
Техника, которую мы предлагаем здесь основана на экспериментальный протокол тестирования, который сочетает в себе, в первый раз, измерение нескольких параметров, характеризующих NMJ и мышечных функций. Три важнейших точек убедитесь, что этот метод дает надежные результаты.
Во-первых хотя скелетных мышц иссечение теперь относительно распространенную технику, дополнительные необходимо позаботиться при выполнении хирургические процедуры для того, чтобы сохранить нетронутыми с мышцы нерва. Способность оператора таким образом должен быть испытан на мышах управления до попытки любой другой экспериментальной модели. Управления мышей мышцы сократительной ответы на прямые и косвенные стимуляцию, как ожидается, будет той же, обеспечивая тем самым элемент управления для хирургических способности оператора.
Другим важным моментом является необходимость обеспечения что прямые импульсов не активировать мышцы путем стимулирования межмышечная ветви нерва и что применяется к нервные импульсы не активировать мышцы артефакта способом, распространяя тока в ванне. Первая точка может быть проверена путем выполнения отдельный набор экспериментов, в которых стимулируется мышцы непосредственно на мембраны, как до, так и после D-тубокурарин (25 мкм) была добавлена в физиологических ванну. После того, как было зафиксировано текущее значение supramaximal, мышцы ответ не должно быть изменено путем добавления D-тубокурарин. Вторая точка относится к длине подакцизным нерва и таким образом более восприимчивы к колебаниям. Ток в всасывания электродов должны быть оценены до начала каждого теста, как описано в разделе протокол.
И наконец поскольку функциональность NMJ оценивается путем сравнения мышц ответ на прямые и косвенные стимуляции, электрические импульсы должны быть синхронизированы очень точно. Этот момент особенно важен для двух усталость парадигмы в конце протокола, во время которого мышцы стимулируется один раз на мембране и 14 раз через нерв. После стимуляции фазы и в остальные времена являются очень низкими (0,33 s и 0,67 s для диафрагмы), даже очень низкая задержка приведет к несбалансированной стимуляции одной из двух отсеков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа в лаборатории авторов было поддержано Fondazione рома и "Телетон" (Грант нет. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
