Summary
En funktionel vurdering af den neuromuskulære junction (NMJ) kan give vigtige oplysninger om kommunikation mellem muskel og nerve. Her beskriver vi en protokol for at omfattende evaluere både NMJ og muskel funktionalitet ved hjælp af to forskellige muskel-nerve præparater, dvs soleus-ischiadicus og membran-phrenic.
Abstract
Neuromuskulære junction (NMJ) funktionalitet spiller en central rolle, når man studerer sygdomme, hvor kommunikationen mellem motorneuron og muskel er svækket, såsom aldring og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Her beskriver vi en forsøgsplan, der kan bruges til at måle NMJ funktionalitet ved at kombinere to typer af elektrisk stimulation: direkte membran muskelstimulation og stimulering gennem nerve. Sammenligning af muskel svar på disse to forskellige stimulering kan bidrage til at definere, på funktionsniveau, potentielle ændringer i NMJ, der fører til funktionelle nedgang i muskelmasse.
Ex vivo præparater er velegnede til velkontrollerede undersøgelser. Her beskriver vi en intensiv protokol for at måle flere parametre af muskel og NMJ funktionalitet for soleus-ischiadicus nerve forberedelse og membran-phrenic nerve forberedelse. Protokollen varer ca. 60 min. og foregår uafbrudt ved hjælp af en skræddersyet software, der måler spjæt kinetik egenskaber, kraft-frekvens-forholdet for både muskel og nerve stimulering og to parametre specifikt for NMJ funktionalitet, i.e. neurotransmission fiasko og intratetanic træthed. Denne metode blev brugt til at opdage skader i soleus og mellemgulv muskel-nerve præparater ved hjælp af SOD1G93A Transgene mus, en eksperimentel model af ALS, allestedsnærværende overexpresses mutant antioxidant enzymet superoxiddismutase 1 (SOD1).
Introduction
Den neuromuskulære junction (NMJ) er en kemisk synapse dannet af forbindelsen mellem den motor endplate af muskelfiber og motoriske neuron axon terminal. NMJ har vist sig at spille en afgørende rolle, når kommunikationen mellem muskel og nerve er nedsat, som opstår i aldring eller Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Som muskel og nerve kommunikere i en tovejs måde1,2, kan være i stand til at måle NMJ defekter adskilt fra muskel defekter give ny indsigt i deres physiopathological samspil. Ja, denne funktionelle evaluering kan bidrage til at vurdere, om morfologiske eller biokemiske ændringer reducere neurotransmission signalering funktionalitet.
Sammenligning af muskel kontraktile reaktion fremkaldt af nervestimulation og svar af den samme muskel fremkaldt af direkte stimulering af sin membran er blevet foreslået som en indirekte måling af NMJ funktionalitet. Faktisk, siden membran stimulation af passerer neurotransmission signalering, eventuelle forskelle i de to kontraktile svar kan tilskrives ændringer i NMJ. Denne tilgang har været flittigt foreslået for rotter3,4,5,6,7, og også brugt til at indsamle oplysninger om mus modeller8,9,10,11,12.
Her, beskriver vi i detaljer en procedure for punktafgifter og teste to muskel-nerve præparater, i. e. soleus-ischiadicus og membran-phrenic forberedelserne. Ved hjælp af en skræddersyet software, vi designet en kontinuerlig prøvningsprotokol, der kombinerer måling af flere parametre, der karakteriserer både NMJ og muskel funktioner, derved giver en omfattende vurdering af NMJ skader separat fra de muskel. Navnlig måler protokollen spjæt kraft, muskel kinetik, kraft-frekvens kurve for direkte og nerve stimulering, neurotransmission fiasko13 for både en fyring og de tetanic frekvenser og intratetanic træthed7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrev vi giver oplysninger om funktionelle denervering i flere neuromuskulære sygdomme eller aldring-sarcopenia. Denne protokol kan bruges til at afgøre, om (og, i bekræftende fald, på hvilket niveau) muskel ændringer skyldes selektiv forandringer, der sker i musklen selv eller i neuromuskulære transmission. De data, der er vist nedenfor er resultaterne af et tidligere værk af vores gruppe18, udført på SOD1G93A transgene musemodel af amyotrofisk lateral sklerose i slutstadiet af sygdom20. SOD1G93A Transgene mus overexpresses allestedsnærværende mutant antioxidant enzymet superoxiddismutase 1 (SOD1). Figur 3 og 4 viser dF/dt og tetanic kraft værdier for den soleus-ischiadicus nerve (venstre) og membran-phrenic nerve (højre) præparater. Disse resultater viser evne til den teknik, der foreslås her at opdage de funktionelle defekter i transgene muskler, der er relateret til NMJ i modsætning til dem strengt relateret til musklen selv. Faktisk, for både dF/dt og tetanic kraft, SOD1G93A soleus muskler vises en reduceret kontraktile svar, sammenlignet med kontrol muskel, når direkte stimuleret, og vises en yderligere reduktion når stimuleret gennem nerve. Derimod blev mild ændringer observeret i disse to parametre når mellemgulvet muskel strimler blev stimuleret gennem membranen, der henviser til, at væsentlige ændringer blev opdaget Når mellemgulvet muskel blev stimuleret gennem nerve.
Figur 3 - Kontraktile kinetik. Betyde ± SEM af dF/dt for soleus (A) og mellemgulv b præparaterne. Soleus enheder vises en signifikant opbremsning ned når direkte stimuleret (-27%), og et yderligere fald når stimuleret gennem nerve (-58%). Mellemgulvet enheder vises en bremse ned, når stimuleret gennem nerve (-30%). Tilpasset fra Rizzuto et al. 18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 - Tetanic force. Betyde ± SEM tetanic specifikke styrke for soleus (A) og mellemgulv b præparaterne. Soleus enheder vises en signifikant opbremsning ned når direkte stimuleret (-26%), og et yderligere fald når stimuleret gennem nerve (-50%). Mellemgulvet enheder vises en kraft fald kun når stimuleret gennem nerve (-44%). Tilpasset fra Rizzuto et al. 18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Evaluering af intratetanic træthed og neurotransmission fejl tilladt NMJ specifikke parametre måles. Figur 5 viser de gennemsnitlige værdier for intratetanic træthed (hvis) målt under tetanic træthed paradigme for soleus muskler (figur 5A) og mellemgulv strimler (figur 5B). Som rapporteret i afsnittet protokol, blev træthed paradigme vi anvendte udviklet på en sådan måde at understrege NMJ dog ikke muskel. Som et resultat, hvis målt for direkte muskelstimulation blev aldrig ændret. Faktisk, hvis beregnet for nervestimulation er den parameter, der skal overvejes for sammenligninger mellem forskellige mus stammer. Vores resultater viser IF var væsentligt lavere i både transgene soleus og mellemgulvet muskler end i kontrol modstykker. Denne forskel var større i mellemgulvet, hvor en lille muskel defekten blev opdaget, og mindre i soleus, hvor betydelig muskelskader havde allerede måles. Det bør erindres, at da den transgene soleus muskel var væsentligt beskadiget, NMJ evaluering var kun korrekt for op til 8 min af stimulation, som er den tid det tager for transgene muskel til at returnere null-værdien af kraft når stimuleret. Transgene soleus hvis værdier efter 8 min af stimulation dybest set udtryk for støj.
Figur 5 - Intratetanic træthed. Intratetanic træthed for soleus (A) og mellemgulv b musklerne vises en betydelig nedgang i transgene NMJ funktionalitet. Værdier er gennemsnit ± SEM. Adapted fra Rizzuto et al. 18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 viser neurotransmission fiasko med tetanic frekvens, målt i den soleus (figur 6A) og mellemgulvet (fig. 6B) enheder. I overensstemmelse med resultatet hvis blev nogen fejl i neurotransmission fundet i soleus muskel, mens mellemgulvet muskel enheder vises en betydelig stigning i neuromuskulære junction trætbarhed.
Figur 6 -Neurotransmission fejl. Neurotransmission fiasko vise ikke nogen ændringer i soleus muskler (A), mens fremhævet et betydeligt fald i NMJ funktionalitet i transgene mellemgulvet strimler (B). Værdier er gennemsnit ± SEM. Adapted fra Rizzuto et al. 18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forsøgsplan beskrevet ovenfor giver en ideel måde at måle og diskriminere nogen funktionelle ændringer, der er opstået direkte i musklen eller indirekte neuromuskulære junction plan. Da denne teknik er baseret på en indirekte måling af NMJ funktionalitet, kan det bruges til at etablere hvis nogen defekt er relateret til morfologiske ændringer eller biokemiske ændringer. Derimod giver det en effektiv metode til at afgøre, om morfologiske eller biokemiske ændringer har reduceret neurotransmission signalering funktionalitet. Dog efter kraft målinger er afsluttet, kan musklen være fjernet fra badet, renset, fastgjort på optimal længde, omgivet af indlejring sammensatte og hurtigt frosset i smeltende isopentane. Musklerne kan opbevares ved-80 ° C for efterfølgende evaluering, som for immunhistokemiske og morfologisk analyse.
Den teknik, vi foreslår her er baseret på en eksperimentel test-protokol, der kombinerer, for første gang, måling af flere parametre kendetegner NMJ og muskel funktioner. Tre afgørende punkter sikrer, at denne teknik giver pålidelige resultater.
Først, selvom skeletmuskulatur excision er nu en forholdsvis almindelig teknik, ekstra pleje skal tages ved udførelse af den kirurgiske procedure for at holde nerven intakt med musklen. Operatørens evne skal således være testet på kontrol mus før nogen andre eksperimentel model er forsøgt. I control mus forventes muskel kontraktile svar til direkte og indirekte stimulering at være det samme, hvilket giver en kontrol til operatørens kirurgisk evne.
Et andet afgørende punkt er behovet for at sikre, at direkte pulser ikke aktivere musklen ved stimulerende intramuskulaer grene af nerve og at pulser anvendes til nerven ikke aktivere musklen på en artefactual måde ved at sprede nuværende i badet. Det første punkt kan testes ved at udføre et separat sæt af forsøg, hvor musklen er stimuleret direkte på membranen, både før og efter D-tubocurarin (25 µM) er blevet tilføjet til den fysiologiske bad. Når den supramaximal aktuelle værdi er fastsat, bør muskel reaktionen ikke ændres ved tilsætning af D-tubocurarin. Det andet punkt er relateret til længden af den skåret nerve, og er dermed mere modtagelige for variation. Nuværende på suge elektroden skal evalueres inden begyndelsen af hver prøve, som beskrevet i afsnittet protokol.
Endelig, da NMJ funktionalitet er beregnet ved at sammenligne muskel reaktionen på direkte og indirekte stimulering, de elektriske impulser skal synkroniseres meget præcist. Dette punkt er særlig vigtigt for to træthed paradigmerne i slutningen af den protokol, hvor musklen er stimuleret når på membranen og 14 gange gennem nerve. Da både stimulation faser og resten gange er meget lav (0,33 s og 0,67 s til mellemgulvet), endda en meget lav forsinkelse ville føre til en ubalanceret stimulering af en af de to rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejde i forfatternes laboratorium blev støttet af Fondazione Roma og Telethon (give nr. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
