Introduction
Het zoogdier Notch signaling pathway homoloog dezelfde route in Drosophila melanogaster en bestaat uit vier transmembraan Notch receptoren (Notch1-4) en vijf membraangebonden liganden van de Jagged (JAG1 & JAG2) en Delta-achtige (DLL1, 3, en 4) gezinnen 1. Notch signalering wordt gestart wanneer Notch receptor op een ontvangende cel door ligand is gebonden aan een zendende cel 2. Tijdens deze trans-activatie, de membraangebonden Notch ligand produceert een rekkracht op de membraangebonden Notch receptor 3, 4. De rekkracht van ligand binding induceert conformatieveranderingen in de Notch receptor die extracellulaire splitsing van de receptor vergemakkelijken door TNFa omzettend enzym (TACE), gevolgd door een intracellulaire splitsing gebeurtenis gemedieerd door een preseniline bevattende gamma-secretase complex (γ-secretase). γ-secretase releases de Notch intracellular domein (NiCd) die transloceert naar de kern waar het een complex met transcriptionele activatie CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), brein-achtige (MAML) en celtype-specifieke factoren heeft expressie van target genen 5.
De mechanische elementen van Notch activatie leiden tot de noodzaak van unieke methoden Notch pathway activatie in vitro. Oplosbare Notch liganden binden aan receptoren Notch, maar niet de productie strekkrachten noodzakelijk NiCd afgifte terwijl tegelijkertijd de competitieve inhibitie van binding van cel-geassocieerd Notch ligands. Zo, de toevoeging van oplosbare Notch liganden aan kweekmedium kunnen normale Notch signalering 6, 7 verzwakken. Gelukkig kunnen Notch ligands NiCd afgifte veroorzaken als ze worden bevestigd aan een geschikt stijf substraat 5, 8, 9,10. Zaaien cellen op kweek-ligand gecoate substraten of toepassing-ligand gecoate kralen om cellen kunnen activeren zowel Notch signalering, en de keuze daartussen vooral afhankelijk van de gewenste timing van Notch stimulatie. Voor onmiddellijke, tijdelijke Notch activatie als gewenst zou zijn in het midden van een functionele assay of differentiatie, Notch ligand kan gebonden worden aan kralen, toegepast op gekweekte cellen agarose en uitgewassen op elk moment. Langduriger Notch signalering vanaf het begin van de kweekperiode, kan weefselkweekplaten worden bekleed met ligand voorafgaand aan zaaien van cellen.
Voor de toepassing van dit protocol, worden werkwijzen uitgevoerd met muis osteoclastvoorlopers, maar de werkwijzen en variaties op de hier beschreven werkwijzen zijn toepasbaar op een breed scala aan celtypen 6, 11, 12, 13, 14. Osteoclasten terminaal gedifferentieerde hematopoëtische afstamming, cellen die verantwoordelijk zijn voor de resorptie van botweefsel zijn, en ze zijn betrokken bij verschillende aandoeningen van botverlies 15. Dus in vitro onderzoek van de differentiatie van osteoclasten uit hun monocyt / macrofaag-lijn precursoren en de moleculaire mechanismen die de functie moet beter begrip van osteoclasten en de ontwikkeling van nieuw bot regenereren therapieën. Hoewel wordt nu algemeen aanvaard dat Notch een positieve rol bij de differentiatie en functie van osteoclasten speelt, variaties in zowel Notch stimulatie en osteoclast precursor cultuur en differentiatie tot oorspronkelijk tegenstrijdige bevindingen 16, 17, 18, 19. Nadere bestudering van de verschillen in methoden en het gebruik van genetischemodellen zijn sterk verduidelijkt de rol van Notch in osteoclasten, maar toepassing van gestandaardiseerde Notch stimulatie en kweekwerkwijzen kunnen dergelijke controversen in toekomstige studies van Notch in andere celtypes 20, 21, 22, 23 te voorkomen.
Er zijn meerdere werkwijzen voor het kweken en differentiëren muis osteoclastvoorlopers, en zoals met uiteenlopende werkwijzen voor het stimuleren Notch signalering, de beste methode afhangen van de wetenschappelijke vraag. Hierin zal onze manier van kweken van hechtende en niet-hechtende fracties van beenmerg cellen gespoeld uit muizen lange beenderen voorkeur worden gepresenteerd. Deze werkwijze heeft het voordeel van in wezen waarvoor geen gespecialiseerde uitrusting en cellen die van toepassing zijn op verschillende differentiatiemethoden zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het onderzoek met gewervelde dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd.
1. Cultuur Mediavoorbereiding
- Bereid α-MEM door oplossen minimaal essentieel medium (MEM) poeder en 1,9 g natriumbicarbonaat in 900 ml H2O en aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 100 ml warmte- geïnactiveerd foetaal runderserum. Steriliseren met behulp van een 0,22 pm polyethersulfon (PES) filter.
- Bereid macrofaag medium door aanvulling α-MEM met 35 ng / ml recombinant muis macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF)
- Bereid osteoclast medium door aanvulling macrofagen medium met 100 ng / ml RANKL
2. Bone Marrow Cell Isolation
- Vul een 10 ml spuit met een 25⅝ naald per muis met 10 ml α-MEM. Euthanaseren muizen via 10 min blootstelling aan CO 2 bij een stroomsnelheid van 1,3 l / min. Zorg ervoor dat dier dood door volgende CO 2 blootstelling met cervicale dislocatie alvorens met dissectie.
- Met behulp van schone techniek, ontleden en scheiden de tibiae en dijbenen. Desinfecteren muizenhuid met 70% ethanol alvorens een snede langs het voorste oppervlak van elke achterpoot van de tibia en femur bloot.
- Knip het kniegewricht vrij het distale einde van de femur en dwars door de femur zo dicht mogelijk bij het bekken mogelijk. Dijbeen verwijderen en reinigen zoveel zacht weefsel mogelijk. Om de tibia, dwars door de enkel te verwijderen en verwijder zoveel zacht weefsel mogelijk te maken.
- Houd het been met een tang en spoel merg in een 15 ml conische buis met 2,5 ml kamertemperatuur α-MEM combineren merg flushes van een enkele muis in een enkele buis.
LET OP: Een succesvolle merg flush zal de kleur van t te veranderenHij bot van rood tot beige. - Laat puin om zich te vestigen op de bodem van de buis en overdragen supernatant naar een schone 15 ml conische buis verzorgen om te voorkomen dat de overdracht van alle vuil.
OPMERKING: Sommige cellen kunnen zich ook af met het merg puin. Als een groter aantal cellen vereist, kan beenmerg flushes worden gefiltreerd door een 70 um cel zeef in een schone 15 ml buis. - Centrifugebuis (s) bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Vacuüm zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 0,5 ml ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten om rode bloedcellen te lyseren.
- Voeg 10 ml PBS direct ACK-celoplossing en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
NB: De eerder rode celpellet moet nu beige zijn. - Vacuüm aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml α-MEM, en de plaat in een 100 mm weefselkweek behandelde schotel. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C in een bevochtigdeweefselkweek incubator.
OPMERKING: Tellen cellen is niet noodzakelijk deze stap. Gedurende deze tijd zullen hechtende cellen uit het beenmerg hechten aan het cultuur oppervlak; niet-hechtende beenmerg celpopulaties zullen blijven zweven. MCSF niet in het kweekmedium gedurende deze eerste incubatie.
3. Verrijking van osteoclastvoorlopers
- Na overnacht incubatie van merg flushes, overdracht kweeksupernatant met niet-hechtende cellen aan een 50 ml conische buis.
OPMERKING: kweekschalen met hechtende cellen, die beenmerg mesenchymale stamcellen omvatten, kunnen worden weggegooid of gevoed met verse α-MEM desgewenst andere experimenten.
OPMERKING: Osteoclasten kunnen direct door deze niet-hechtende beenmergcellen worden onderscheiden door uitplaten ze in weefselkweek behandelde gerechten in een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / cm2 in osteoclast medium en verfrissende medium om de dag gedurende 5 dagen. Add α-MEM niet-hechtende cellen oplossing tot een eindvolume van 18 ml en voeg M-CSF tot een eindconcentratie van 35 ng / ml. - Voeg 3 ml celsuspensie elk 6 60 mm kweekschalen suspensie.
- Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C in een bevochtigde weefselcultuur incubator. Gedurende deze tijd zullen M-CSF differentiatie van macrofagen, die zich ook door een niet-weefselkweek behandelde oppervlakken stimuleren.
- Na incubatie gedurende de nacht, re-voeding osteoclastvoorlopers met 3 ml vers macrofaag medium. Dit biedt niet-hechtende cellen die geen gedifferentieerd tot macrofagen verwijderen.
- Blijf cultuur osteoclastvoorlopers bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 dagen of totdat kweken bereikt ongeveer 70% confluentie.
4. differentiatie van osteoclasten
- Was osteoclastvoorlopers met 5 ml PBS en behandelen cellen met 1 ml marine-oorsprong proteolytische / collagenolytische enzym bij kamertemperatuur totdat de cells kan worden losgemaakt door zachtjes te tikken van de plaat.
OPMERKING: osteoclastvoorlopers kan alleen worden opgeheven indien ze worden gekweekt in suspensie schotels; precursors hechten ook stevig aan weefselkweek behandelde oppervlakken worden opgeheven. Trypsine kan osteoclastvoorlopers activeren en moet worden vermeden. - Voeg 4 ml α-MEM elk gerecht en overdracht cellen om een 50 ml conische buis. Aantal cellen met een hemocytometer en verdun cellen tot een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml en voeg M-CSF tot een eindconcentratie van 35 ng / ml en RANKL tot een eindconcentratie van 100 ng / ml.
- Zaadcellen bij een dichtheid van 2,6 x 10 4 cellen / cm2 in weefselkweek behandelde platen en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 2 dagen. Differentiatie wordt kenmerkend uitgevoerd in 24-well platen, waarbij 5 x 10 4 cellen gezaaid in elk putje uitgevoerd.
- 2 dagen na het begin van de differentiatie, opnieuw voer cellen door vervangen medium met 1 ml verse osteocvorig medium.
OPMERKING: osteoclastdifferentiatie gewoonlijk voltooid binnen 3 dagen. Resulterende osteoclasten kan TRAP-gekleurd voor eenvoudige kwantificering en morfologische analyse.
5. Continu Stimulatie van Notch Signalering met Jagged1-gecoate oppervlak
- Suspendeer geit anti-humaan IgG Fc antilichaam in PBS bij een concentratie van 10 ug / ml (1: 1000 verdunning van 10 mg / ml voorraad). Voeg antilichaamoplossing aan kweekoppervlak in een dichtheid van 1,3 gg / cm 2 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bij 24-well platen, voeg 250 pl (2,5 pg) per putje.
- Vacuüm aspireren putten en opnieuw vullen met 1 ml PBS. Herhaal deze stap 2 keer.
- Suspendeer recombinant Jagged1-Fc fusie-eiwit in PBS bij een concentratie van 10 ug / ml. Add Jagged1 FC-oplossing voor de met antilichaam beklede kweekoppervlak met een dichtheid van 1,3 gg / cm 2 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Cultuur oppervlakken bekleed met antilichaam only kan worden gebruikt als controles.
- Vacuüm aspireren putten en opnieuw vullen met 1 ml PBS. Herhaal deze stap 2 keer. Houd PBS in putten tot vlak voor het zaaien cel om te voorkomen dat ze uitdrogen.
- Seed 2,6 x 10 4 osteoclastvoorlopers / cm2 op gecoate oppervlakken. Notch signalering continu gestimuleerd minstens 3 dagen.
6. Tijdelijke Stimulatie van Notch Signalering met Jagged1-gecoate Beads
- Combineer de volgende in een geschikt formaat buis: 0,5 gg / cm 2 Jagged1-Fc, 21 gl / cm 2 proteïne G agarose korrels en PBS tot een eindvolume van 1,5 ml. Om een voldoende aantal Jagged1 korrels bereiden 1 putje van een 24 putjesplaat Combineer 1 ug Fc-Jagged1, 40 ul proteïne G agarose korrels en PBS tot 1,5 ml.
- Incubeer buis met rotatie bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugebuis bij 300 xg gedurende 1 min tot pellet kralen. Resuspendeer kralen in 1,5 ml PBS. Herhaal deze wash2 keer.
- Resuspendeer Jagged1 kralen in 130 ul / cm2 kweekmedium en gelden voor gekweekte cellen.
- Incubeer cellen met kralen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de gewenste periode. Verwijder kralen met verschillende wasbeurten van PBS of het kweekmedium.
- Controleer Notch signalering activering via meting van Notch target-gen transcripties 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze methode is de cultuur en stimuleren Notch signalering bij osteoclastvoorlopers. Wanneer behoorlijk beschaafd, osteoclastvoorlopers vertonen vooral een langgerekte spoelvormige morfologie met gladde cytoplasma (Figuur 1A). Zorg moet worden genomen om immunologische activatie van de osteoclastprecursors voorkomen. Na activering voorlopers verspreiden en afgevlakt met schuimende cytoplasma (Figuur 1B). Deze "gebakken ei" cellen zijn resistent tegen RANK signalering en niet efficiënt differentiëren tot rijpe osteoclasten. Onder de juiste cultuur en differentiatie omstandigheden zal verrijkt osteoclastvoorlopers differentiëren en zekering in grote TRAP-positieve meerkernige osteoclasten binnen drie dagen (figuur 1C).
Zaaien osteoclastvoorlopers op Jagged1-Fc gecoate oppervlakken up-reguleert Notch target genen binnen 24 uur(Figuur 2). Specifieke genen up-gereguleerd door Notch signalering verschillen per cel. Bij osteoclastvoorlopers, de meest overheersende gen up-gereguleerd door Jagged1 is Hes1, maar Hey2 en Myc matig opgereguleerd, ook. Expressie van andere Notch target genen zoals Hey1 en p21 zijn niet significant veranderd door Jagged1 stimulatie van osteoclastprecursors.
Wanneer osteoclastvoorlopers gekweekt in 24-putjesplaten, behandeld met kralen bekleed met slechts 600 ng Jagged1-Fc toont een significante toename van Hes1 expressie binnen 24 uur (figuur 3). Achtenveertig uur behandelingen tonen een vergelijkbare toename in Hes1 expressie, zij het in mindere mate.
Figuur 1: Cultuur en differentiatie van osteoclastvoorlopers. (A)Naïve osteoclastvoorlopers gekweekt met 35 ng / ml MCSF en zonder activering stimuli hebben een gladde, spoelvormige morfologie. Schaal bar = 25 pm. (B) Bij immunologische activering osteoclastvoorlopers nemen een afgeplatte, schuim gevulde morfologie en zal niet differentiëren in osteoclasten. Activatie induceren, werden osteoclastvoorlopers behandeld met 10 ng / ml lipopolysaccharide voor 16 uur. Schaal bar = 25 pm. (C) immunologisch naïeve hechtende osteoclastvoorlopers gekweekt met 35 ng / ml MCSF en 100 ng / ml gedurende 3 dagen differentiëren tot rijpe osteoclasten. Rijpe osteoclasten zijn groot, meerkernige en TRAP-positieve. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Up-regulatie van Notch doelgenen in osteoclastvoorlopers uitgeplaat op geïmmobiliseerd Jagged1-Fc. Osteoclastvoorlopers werden uitgeplaat op geïmmobiliseerd Jagged1-Fc en gedurende 24 uur. Tijdens de kweekperiode, uitdrukking Hes1, Hey2 en Myc mRNA werd verhoogd. Andere Notch target genen, Hey1 en p21 werden niet gewijzigd. Error bars zijn standaard fout van het gemiddelde, significantie werd geëvalueerd met behulp van de student 1-tailed t-test. *, P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Up-regulatie van mRNA in Hes1 osteoclastvoorlopers behandeld met Jagged1-Fc kralen. 600 ng Jagged-Fc gebonden aan proteïne G agarose korrels up-reguleert Hes1 expressie in osteoclastvoorlopers gekweekt in het putje van een 24 putjesplaatbinnen 24 uur van de blootstelling. Hes1 inductie door Jagged1-korrels was vergelijkbaar met Hes1 niveaus geïnduceerd door Jagged1-Fc beklede platen. Andere Notch doelgenen die niet sterk zijn geïnduceerd door Jagged1-Fc beklede platen werden niet onderzocht. Error bars zijn standaard fout van het gemiddelde, significantie werd geëvalueerd met behulp van de student 1-tailed t-test. *, P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Cultuur en in vitro differentiatie van osteoclastprecursors een nuttig platform voor onderzoek naar de moleculaire mechanismen van osteoclastogenese en de identificatie van therapeutische targets voor bot regeneratie en behoud van botmassa. Bij het kweken van muis osteoclastvoorlopers, de meest kritische element is het onderhoud van voorlopers in een naïeve staat. Als macrofaag-achtige cellen zijn osteoclastvoorlopers geprimed reactie op bacteriële bestanddelen en pro-inflammatoire cytokines. Na activering worden osteoclastvoorlopers niet meer efficiënt differentiëren in osteoclasten. De primaire oorzaak van precursor activatie aanwezigheid van inflammatoire cytokines zoals TNFa of onjuist geïnactiveerd complement foetaal runderserum. Daarom moet veel sera worden getest op hun vermogen om osteoclastogenese voor gebruik in experimenten ondersteunen. Bovendien zijn alle sera uit osteoclaatste voorloper cultuur moet warmte worden geïnactiveerd om complement dat de osteoclastvoorlopers kan activeren denatureren.
Wijzigingen en het oplossen van problemen
In deze werkwijze wordt Jagged1 Fc gebruikt om Notch stimuleren osteoclastvoorlopers. Het Fc fusie met Jagged1 vergemakkelijkt zowel immobilisatie cultuur oppervlakken met anti-Fc-antilichamen en koppeling aan proteïne G kralen. Andere Notch ligands gefuseerd aan Fc, zoals Delta-like1-Fc kunnen worden gebruikt op een soortgelijke manier. Opgemerkt zij dat niet alle leveranciers memories recombinant Notch ligand activiteit. Daarom, terwijl recombinant Notch liganden kan worden verkregen van meerdere leveranciers, zorg moeten worden genomen om de biologische activiteit informatie van de leverancier of de tests van de liganden in bekende Notch ligand-responsieve cellen te verkrijgen moet worden uitgevoerd.
Met de in deze methode beschreven protocollen maakt constitutieve en tijdelijke stimulatie van Notch tekenaling in gekweekte osteoclastvoorlopers. De standaardmethode voor het detecteren van activatie van Notch signalering is kwantificatie van Notch target genen via kwantitatieve reverse-transcriptie PCR (RT-qPCR). Target genen opgereguleerd door Notch signalering verschillen per cel, dus als Notch stimulatie wordt uitgevoerd op een eerder uncharacterized celtype, de expressie van een panel van canonieke Notch target genen zoals leden van de Hes Hey familie van transcriptiefactoren moeten worden bepaald. In een korter tijdsbestek kan Notch activatie mogelijk gedetecteerd via Western blot beoordeling van Notch intracellulaire domein (NiCd). Men dient echter als er vier Notch receptoren en NICDs de verschillende receptoren in verschillende celtypen niet vrijkomen in dezelfde mate volgende ligand stimulatie. NICD niveau Notch-gestimuleerde cellen moet worden vergeleken met niveaus in niet-gestimuleerde cellen verantwoordelijk voor baseline NiCd release.
Beperkingen van de techniek Hoewel deze werkwijze in principe toepasbaar op alle Notch ligands, het tot op heden slechts consequent aangebracht met Jagged1 en Delta-like1 10, 20, 21. Verdere proeven overbodig om te bepalen of aanvullende Notch ligands zijn vatbaar voor deze methode. Deze methode is ook niet specifiek in zijn Notch receptor activering; beoordeling van specifieke Notch receptoractivering na stimulatie met deze methode nodig om cellulaire reacties op bepaalde Notch receptoren toeschrijven.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Differentiatie van osteoclasten is afhankelijk op zowel osteoclasten voorloper aantal en de osteoclasten voorloper differentiatie potentieel. Evaluatie van osteoclast differentiatie van beenmerg gemengde populaties kan geen onderscheid maken tussen veranderingen in osteoclast precursor nummer en mobiele autonome differentiatie potentieel. Verrijking van osteoclast voorlopers voorafgaand aan differentiatie controles voor verschillen in aantallen precursor en maakt beter ondervraging van de osteoclast differentiatieproces. Gezien het feit dat Notch signalering oefent verschillende effecten op verschillende punten tijdens osteoclastogenesis, tijdelijke controle van zowel Notch signalering en de differentiatie van osteoclasten zijn essentieel voor een goede onderzoek naar de moleculaire pathways regeert.
Toekomstige toepassingen na het beheersen van deze techniek
Met dit protocol, kan beoordeling van de rollen voor Notch signalering worden uitgevoerd niet alleen osteoclastvoorlopers, maar mogelijk in andere celtypes, ook. Door het variëren van de lengte van Notch stimulatie en begintijd van Notch signalering inleiding kunnen mogelijke multifasische rol van Notch signalering in verschillende cellulaire proces gedefinieerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
