Introduction
Pattedyr Notch signalveien er homolog med den samme bane i Drosophila melanogaster og består av fire transmembran-Notch-reseptorer (Notch1-4) og fem membranbundne ligander med taggete (JAG1 & JAG2) og Delta-lignende (DLL1, 3, & 4) familier 1. Hakk signalering blir initiert når Notch-reseptor på en mottagercelle er bundet av ligand på en sender celle to. I løpet av denne trans-aktivering, produserer den membranbundne Notch ligand en strekkraft på den membranbundne Notch-reseptor-3, 4. Strekkraften av ligand binding induserer konformasjonsendringer i Notch-reseptor som muliggjør ekstracellulær spalting av reseptoren ved TNFa konverterende enzym (TACE) etterfulgt av en intracellulær spalting hendelse mediert av et presenilin-inneholdende gamma-secretase kompleks (γ-sekretase). γ-Secretase slipper Notch intracellular domene (NiCd) som translocates inn i kjernen hvor den danner en transkripsjonen aktivering kompleks med CBF-en-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-lignende (MAML), og celletypespesifikke faktorer for å drive uttrykk av målgener 5.
De mekaniske elementer av Notch signale aktivering resulterer i behovet for unike fremgangsmåter for Notch pathway aktivering in vitro. Løselige Notch-ligandene kan binde seg til Notch-reseptorer, men mislykkes i å produsere strekkrefter som er nødvendige for NICD frigivelse, mens på samme tid kompetitivt å inhibere bindingen av celle-assosiert Notch ligander. Således kan tilsetningen av oppløselige Notch ligander til kulturmediet dempe normal Notch signale 6, 7. Heldigvis kan Notch ligander indusere NICD frigivelse hvis de er festet til en passende stivt substrat 5, 8, 9,10. Såing av cellene på ligand-belagte kultur substrater eller påføring av ligand-belagte perler til celler kan aktivere begge hakk signalering, og valget mellom dem avhenger først og fremst av den ønskede tidspunktet for Notch stimulering. For umiddelbar, midlertidig Notch signale aktivering, slik det ville være ønskelig under midtpunktet av en funksjonell eller differensiering assay, Notch ligand kan være bundet til agarosekuler, anvendt på dyrkede celler, og vasket ut til enhver tid. For mer varig hakk signalering fra begynnelsen av en dyrkningsperiode kan vevskulturplater være belagt med ligand før såing celle.
Ved anvendelse av denne protokollen, fremgangsmåter utføres under anvendelse av mus osteoklast forløpere, men de metoder og variasjoner av fremgangsmåtene beskrevet her kan anvendes på et bredt spekter av celletyper 6, 11, 12, 13, 14. Osteoklaster er terminalt differensierte blodkreft linage celler som er ansvarlig for resorpsjon av benvev, og de er innblandet i flere forstyrrelser i bentap 15. Således in vitro-studier av differensieringen av osteoklaster fra sine monocytt / makrofag-avstamning forløpere og de molekylære mekanismer som kontrollerer deres funksjon er viktig for å bedre forståelse av osteoklaster og utvikling av nye ben-regenererende behandling. Mens det er nå generelt akseptert at Notch signalering spiller en positiv rolle ved differensiering og funksjon av osteoklaster, variasjoner i både Notch signale stimulering og osteoclast forløper kultur og differensiering førte til innledningsvis sprikende funn 16, 17, 18, 19. Nærmere undersøkelse av forskjellene i fremgangsmåter og anvendelse av genetiskmodeller har i stor grad avklart rolle hakk signalering i osteoclastogenesis, men anvendelse av standardiserte Notch stimulerings og dyrkningsfremgangsmåter kan forhindre slike strids i fremtidige studier av Notch signalisering i andre celletyper 20, 21, 22, 23.
Det finnes flere metoder for dyrkning og differensiering av mus osteoklast-forløpere, og som med varierende fremgangsmåter for stimulering av Notch-signalering, vil den beste metoden avhenger av eksperimentelle spørsmål. Heri, vil vår foretrukne metode for dyrking heft og ikke-heftende fraksjoner av marg cellene ble jaget fra mus lange bein bli presentert. Denne fremgangsmåten har den fordel at den krever i det vesentlige ingen spesialutstyr og produserende celler som er anvendelig til en rekke differensierings metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som involverer virveldyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of Pennsylvania Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Culture Media Forberedelse
- Fremstille α-MEM ved oppløsning av minimum essensielt medium (MEM) pulver og 1,9 g natriumbikarbonat i 900 ml H2O og supplere med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 100 ml varme- inaktivert føtalt bovint serum. Steriliser ved hjelp av en 0,22 mikrometer polyetersulfon (PES) filter.
- Forbered makrofag medium ved å supplere α-MEM med 35 ng / ml rekombinant mus Makrofagindusert Colony Stimulating Factor (M-CSF)
- Forbered osteoclast medium ved å supplere makrofag medium med 100 ng / ml RANKL
2. Bone Marrow Cell Isolation
- Fyll en 10 ml sprøyte med en 25⅝ gauge nål per mus med 10 ml α-MEM. Avlive mus via 10 min eksponering til CO 2 ved en strømningshastighet på 1,3 l / min. Sørg for dyr død ved å følge CO 2 eksponering med halshugging før du fortsetter med disseksjon.
- Ved hjelp av ren teknikk, dissekere ut og skille skinneben og lårben. Desinfisere hud mus med 70% etanol før å gjøre et snitt langs den fremre overflate av hvert bakben for å eksponere tibia og femur.
- Skjære gjennom kneleddet for å frigjøre den distale enden av femur, og skjære gjennom femur så nær til bekkenet som mulig. Ta av femur og rengjør så mye mykt vev som mulig. For å fjerne tibia, skjære gjennom ankelen og fjerne så mye mykt vev som mulig.
- Hold beinet med tang og flush marg i en 15 ml konisk rør med 2,5 ml romtemperatur α-MEM kombinere marg spyler fra et enkelt muse inn et enkelt rør.
MERK: En vellykket marg flush vil endre fargen på than bein fra rødt til beige. - Tillat rusk fikk sette seg på bunnen av røret og supernatanten overføres til et rent 15 ml konisk rør ta vare for å unngå å overføre eventuelle rester.
MERK: Noen celler kan også betale med marg rusk. Hvis et større antall celler som er nødvendig, kan marg spyler bli filtrert gjennom et 70 mikrometer celle sil inn i en ren 15 ml tube. - Sentrifugerør (e) ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
- Vacuum aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 0,5 ml Ammonium-klorid-Kalium (ACK) lysebuffer og inkuber ved 37 ° C i 3 minutter for å lysere røde blodceller.
- Tilsett 10 ml PBS direkte til ACK-celleløsning, og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter.
MERK: Den tidligere røde cellepelleten skal nå være beige. - Vakuum aspirer supernatanten og resuspender pellet i 10 ml α-MEM, og plate i en 100 mm vev kultur behandlet parabolen. Inkuber cellene over natten ved 37 ° C i en fuktetvevsdyrkningsinkubator.
MERK: Telle-celler er ikke nødvendig for dette trinn. I løpet av denne tiden, vil adherente celler fra benmargen feste til kulturoverflaten; ikke-adherente benmargscellepopulasjoner vil forbli i suspensjon. MCSF er ikke til stede i kulturmediet i løpet av denne første inkubering.
3. Anriking av osteoclast Forløpere
- Etter natten inkubasjon av marg flush, overføring kultursupernatant inneholder ikke-heftende celler til en 50 ml konisk tube.
MERK: Kultur retter med heftende celler, som er benmargs mesenchymale stamceller, kan kastes eller matet med fersk α-MEM, hvis ønskelig for andre eksperimenter.
MERK: Osteoklaster kan skilles direkte fra disse ikke-adherente benmargsceller ved å plate dem inn i vevskultur-behandlede retter ved en tetthet på 4 x 10 5 celler / cm2 i osteoclast medium og forfriskende medium annenhver dag i 5 dager. Legg α-MEM til ikke-klebende celleløsning til et endelig volum på 18 ml og tilsett M-CSF til en sluttkonsentrasjon på 35 ng / ml. - Tilsett 3 ml av hver cellesuspensjon til 6 60 mm suspensjon kulturskåler.
- Inkuber skålene over natten ved 37 ° C i en fuktet vevskulturinkubator. I løpet av denne tiden, vil M-CSF stimulerer differensiering av makrofager, som kan forholde seg selv til ikke-vevskultur-behandlede flater.
- Etter inkubasjon over natten, re-fôr osteoklast forløpere med 3 ml frisk makrofag medium. Dette vil fjerne ikke-adhererende celler som ikke har differensiert til makrofager.
- Fortsett til kultur osteoklast forløpere ved 37 ° C og 5% CO 2 for 2 dager eller inntil kulturer nå omtrent 70% samløpet.
4. osteoclast Differensiering
- Vask osteoklast forløpere med 5 ml PBS og behandle celler med 1 ml marin opprinnelse proteolytisk / kollagenolytisk enzym ved romtemperatur inntil cells kan forskyves ved forsiktig tapping av platen.
MERK: osteoclast forløpere kan bare løftes hvis de dyrkes i henge retter; forløpere for feste godt til vevskultur-behandlede overflater som skal løftes. Trypsin kan aktivere osteoklast-forløpere og bør unngås. - Tilsett 4 ml α-MEM til hver skål og overføre cellene til en 50 ml konisk rør. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og fortynn cellene til en tetthet på 5 x 10 4 celler / ml og tilsett M-CSF til en sluttkonsentrasjon på 35 ng / ml og RANKL til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml.
- Frø-celler ved en tetthet på 2,6 x 10 4 celler / cm2 inn i vevskultur-behandlede plater og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet vevskultur-inkubator i 2 dager. Differensiering blir typisk utført i 24-brønners plater, hvor 5 x 10 4 celler blir sådd i hver brønn.
- 2 dager etter starten av differensieringen, re-mateceller ved å erstatte mediet med 1 ml frisk osteocsiste medium.
MERK: osteoclast differensiering vil vanligvis være fullført i løpet av 3 dager. Dannede osteoklaster kan være TRAP-farget for enkel kvantifisering og morfologisk analyse.
5. Kontinuerlig Stimulering av Notch Signa med Jagged1 belagt Surface
- Suspendere geite-anti-humant IgG Fc-antistoff i PBS ved en konsentrasjon på 10 ug / ml (1: 1000 fortynning av 10 mg / ml stock). Legg antistoffløsning til kulturoverflaten med en tetthet på 1,3 mikrogram / cm 2, og inkuber ved værelsetemperatur i 1 time. I tilfellet med 24-brønners plater, tilsett 250 ul (2,5 ug) per brønn.
- Vakuum aspirer brønner og fylle med 1 ml PBS. Gjenta dette trinnet 2 ganger.
- Suspendere rekombinant Jagged1-Fc-fusjonsprotein i PBS ved en konsentrasjon på 10 ug / ml. Legg Jagged1-FC løsning på antistoff-belagte kulturoverflaten med en tetthet på 1,3 mikrogram / cm 2, og inkuber ved værelsetemperatur i 2 timer. Kultur overflater belagt med antistoff only kan brukes som kontroller.
- Vakuum aspirer brønner og fylle med 1 ml PBS. Gjenta dette trinnet 2 ganger. Hold PBS i brønner før like før såing celle for å hindre dem fra å tørking.
- Seed 2,6 x 10 4 osteoklast forløpere / cm 2 på malte overflater. Notch signalering vil bli kontinuerlig stimulert i minst 3 dager.
6. Midlertidig Stimulering av Notch Signa med Jagged1 kuler
- Kombiner de følgende i et passende dimensjonert rør: 0,5 mikrogram / cm 2 Jagged1-Fc, 21 pl / cm 2-protein G-agarose perler, og PBS til et sluttvolum på 1,5 ml. For å fremstille et tilstrekkelig antall Jagged1 kuler til en brønn i en 24 brønners plate, kombinere en ug Jagged1-Fc, 40 ul protein G-agarosekuler, og PBS til 1,5 ml.
- Inkuber rør med rotasjon ved 4 ° C i 2 timer.
- Sentrifugerør ved 300 xg i 1 min for å pellet perler. Resuspender perler i 1,5 ml PBS. Gjenta denne vaske2 flere ganger.
- Resuspender Jagged1 perler i 130 ul / cm 2 dyrkingsmedium og gjelder for dyrkede celler.
- Inkuber cellene med kuler ved 37 ° C og 5% CO2 i ønsket periode. Fjerne perler med flere vaskinger av PBS eller dyrkningsmediet.
- Kontroller Notch signaliserer aktivering via måling av Notch målet genet transkripsjoner 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne metoden er å kultur og stimulere Notch signalering i osteoklast-forløpere. Når riktig kultivert, osteoklast forløpere viser en hovedsakelig langstrakt spindel-formet morfologi med glatt cytoplasma (figur 1A). Forsiktighet bør utvises for å unngå immunologisk aktivering av osteoklast forløpere. Ved aktivering forløpere spre seg og bli flatet med skummende cytoplasma (figur 1B). Disse "stekt egg" cellene er resistente mot RANK signalering og ikke effektivt differensieres til modne osteoklaster. Under riktige kultur og differensiering forhold vil beriket osteoklast forløpere differensiere og sikring i store trap-positive flerkjernede osteoklaster innen tre dager (figur 1C).
Seeding osteoklast forløpere på Jagged1-Fc malte overflater opp-regulerer Notch målgener innen 24 timer(Figur 2). Spesifikke gener oppregulert ved Notch signale varierer etter celletype. I tilfelle av osteoklast-forløpere, er den mest dominerende genet oppregulert ved Jagged1 er Hes1, skjønt hey2 og Myc er moderat oppregulert, så vel. Uttrykk for andre Notch målgener som Hey1 og p21 er ikke vesentlig endret ved Jagged1 stimulering av osteoklast forløpere.
Når osteoklast forløpere blir dyrket i 24-brønners plater, behandling med perler belagt med så lite som 600 ng Jagged1-Fc viser en betydelig økning i Hes1 ekspresjon i løpet av 24 timer (figur 3). Førti-åtte timer behandlinger viser en tilsvarende økning i Hes1 uttrykk, om enn i mindre grad.
Figur 1: Culture og differensiering av osteoklast forløpere. (A)Naive osteoklast forløpere dyrket med 35 ng / ml MCSF og uten aktiverings stimuli har en glatt, spindelformet morfologi. Scale bar = 25 mikrometer. (B) Ved immunologisk aktivering, osteoklast forløpere vedta en flat, skumfylte morfologi og vil ikke differensiere til osteoklaster. For å indusere aktivering, ble osteoklast forløpere behandlet med 10 ng / ml lipopolysakkarid i 16 timer. Scale bar = 25 mikrometer. (C) Immunologisk naive heft osteoklast forløpere dyrket med 35 ng / ml MCSF og 100 ng / ml for 3 dager differensieres til modne osteoklaster. Modne osteoklaster er store, multinukleære, og TRAP-positive. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oppregulering av Notch målgener i osteoklast-forløpere belagt på immobilisert Jagged1-Fc. Osteoklast forløpere ble sådd ut på immobilisert Jagged1-Fc og dyrket i 24 timer. I løpet av dyrkningsperioden, var ekspresjon Hes1, hey2, og Myc mRNA øket. Andre Notch målgener, Hey1 og p21 ble ikke endret. Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet, signifikans ble evaluert ved bruk av studentens en-halet t-test. *, P <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: opp-regulering av Hes1 mRNA i osteoklast-forløpere som ble behandlet med Jagged1-Fc-perler. 600 ng taggete-Fc bundet til protein G-agarose perler opp-regulerer Hes1 ekspresjon i osteoklast-forløpere dyrket i brønnen til en 24-brønns plateinnen 24 timer eksponering. Hes1 induksjon av Jagged1-perler var sammenlignbar Hes1 nivåer indusert av Jagged1-Fc-belagte plater. Andre Notch målgener som ikke var sterkt indusert av Jagged1-Fc-belagte plater ble ikke vurdert. Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet, signifikans ble evaluert ved bruk av studentens en-halet t-test. *, P <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinnene i protokollen
Kultur og in vitro differensiering av osteoklast forløpere gir en nyttig plattform for undersøkelse av molekylære mekanismer for osteoclastogenesis og identifisering av terapeutiske mål for bein regenerering og bevaring av benmasse. Når dyrking mus osteoklast forløpere, er den mest kritiske elementet vedlikehold av forløpere i en naiv tilstand. Som makrofaglignende celler, osteoklast forløpere primet for å svare på bakterielle komponenter og pro-inflammatoriske cytokiner. Ved aktivering vil osteoklast forløpere ikke lenger effektivt differensiere til osteoklaster. Den primære årsaken til forløper aktivering er tilstedeværelsen av inflammatoriske cytokiner slik som TNFa eller feil inaktivert komplement i føtalt bovint serum. Av denne grunn må sera masse bli testet for deres evne til å støtte osteoclastogenesis før anvendelse i forsøkene. I tillegg har alle anvendte sera i osteocsiste forløper kultur må varmeinaktivert å denaturere supplement som kan aktivere osteoklastprotonpumpen forløpere.
Modifikasjoner og feilsøking
I denne fremgangsmåten blir Jagged1-Fc brukes til å stimulere Notch signalering i osteoklast-forløpere. Fc fusjon med Jagged1 forenkler både immobilisering på kultur flater med anti-Fc antistoffer og kobling til protein G perler. Andre Notch ligander fusjonert til Fc, som Delta-like1-Fc, kan anvendes på en lignende måte. Det bør bemerkes at ikke alle leverandører gir uttalelser av rekombinant Notch ligand aktivitet. Derfor, mens rekombinante Notch ligander kan fås fra flere leverandører, omsorg bør tas for å oppnå biologisk aktivitet informasjon fra leverandøren eller tester av ligander i kjente Notch ligand-responsive celler skal utføres.
Ved hjelp av de protokoller som er beskrevet i denne fremgangsmåte gjør det mulig for konstitutiv og midlertidig stimulering av Notch skiltaling i dyrkede osteoklast forløpere. Standardmetoden for å detektere aktivering av Notch signalering er kvantifisering av Notch målgener via kvantitativ revers-transkripsjon PCR (RT-qPCR). Målgener oppregulert ved Notch signale variere fra celle, så når Notch stimulering er utført på et tidligere uncharacterized celletype, uttrykk for et panel av kanoniske Notch målgener som medlemmer av Hes og Hey familie av transkripsjonsfaktorer bør bestemmes. I et kortere tidsrom, kan Notch aktivering potensielt bli detektert via Western blot vurdering av Notch intracellulære domenet (NiCd). Forsiktighet bør utvises, men som det er fire hakk reseptorer og NICDs fra de ulike reseptorer i ulike celletyper er ikke utgitt i samme grad følgende ligand stimulering. NICD nivå i Notch-stimulerte celler bør også være i forhold til nivåene i ikke-stimulerte celler å ta høyde for baseline NICD utgivelse.
Begrensninger av teknikken Selv om denne metoden er teoretisk gjelder for alle Notch ligander, hittil har det bare vært konsekvent påføres med Jagged1 og Delta-like1 10, 20, 21. Videre testing vil være nødvendig for å avgjøre hvorvidt ytterligere Notch ligander er mottagelig for denne metoden. Denne metoden er også uspesifikk i sitt hakk reseptoraktivering; Vurderingen av spesifikk Notch-reseptor-aktivering etter stimulering ved hjelp av denne metoden er det nødvendig å tillegge cellulære responser til bestemte Notch-reseptorer.
Betydningen av teknikken med hensyn på eksisterende / alternative metoder
Osteoclast differensiering er avhengig opp på begge osteoclast forløper nummer og osteoclast forløper differensiering potensial. Evaluering av osteoclast differensiering av blandede benmarg bestander kan ikke skille mellom endringer i osteoclast precursor nummer og celle autonom differensiering potensial. Anriking av osteoklast forløpere før differensiering kontroller for forskjeller i forløper tall og gir nærmere avhør av osteoklastprotonpumpen differensiering prosessen. Gitt at Notch signale utøver ulike effekter på ulike punkter under osteoclastogenesis, tidsmessig kontroll av både Notch signalering og osteoclast differensiering er avgjørende for riktig undersøkelse av molekylære stier det styrer.
Fremtidige søknader etter å mestre denne teknikken
Ved hjelp av denne protokollen, kan vurderingen av roller for Notch signalering utføres ikke bare i osteoklast forløpere, men potensielt i andre celletyper, også. Ved å variere lengden av Notch stimulering og tid av Notch signale initiering, kan potensielle multi-fasisk rollene til Notch signalering i en rekke cellulære prosessen defineres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
