Abstract
De zuivering van actief eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur-complexen is cruciaal voor de karakterisering van enzymatische activiteiten en de novo identificatie van nieuwe subeenheden en post-translationele modificaties. Bacteriële systemen zorgen voor de expressie en zuivering van diverse interne polypeptiden en eiwitcomplexen. Echter, dit systeem de zuivering van eiwit subeenheden die post-translationele modificaties (bijvoorbeeld fosforylatie en acetylatie) bevatten, en de identificatie van nieuwe regulerende subeenheden die alleen aanwezig zijn / expressie in eukaryote systeem mogelijk. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van een nieuw, robuuste en efficiënte werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) middels Strep- en FLAG-gemerkte eiwitten die de zuivering van eiwitcomplexen maakt met transiënt of stabiel tot expressie epitoop-gemerkte eiwitten van eukaryote cellen. Dit protocol kan worden toegepast op prot karakteriserenein complexe functionaliteit, post-translationele modificaties op complexe subeenheden ontdekken en op nieuwe regulerende complexe componenten identificeren met massaspectrometrie. Met name kan dit TAP toegelicht voor eiwitcomplexen gevormd door eukaryote of pathogene (viraal en bacterieel) componenten bestuderen, hetgeen aldus een breed scala aan downstream experimentele mogelijkheden. Wij stellen onderzoekers met eiwitcomplexen deze benadering op verschillende manieren kunnen gebruiken.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn cruciaal voor de nauwkeurige regeling van biologische processen 1, en bestudeerd deze IPP kan informeren over de functie 2. Verscheidene benaderingen zijn ontwikkeld voor het karakteriseren van protonpompremmers en voor de de novo identificatie van nieuwe regulerende eiwitcomponenten. In 1989, Stanley Velden en collega's meldde de gist-twee-hybride (Y2H) test 3. Deze aanpak maakt het mogelijk om onpartijdige en uitgebreide identificatie van interactoren (prooien) voor een bepaald eiwit van belang (aas) in Saccharomyces cerevisiae. Naast de opmerkelijke bruikbaarheid voor het ontdekken PPI kan de Y2H assay worden gebruikt voor het karakteriseren van eiwitten paren in gistcellen, definiëren minimale interactie domeinen en identificeren van mutaties die dergelijke interacties te heffen. Door wijziging van de Y2H assay kan IPP eveneens bestudeerd in zoogdiercellenclass = "xref"> 4. Variaties van de Y2H assay (bijvoorbeeld gist drie-hybride systeem) kan ook worden toegepast om te bestuderen eiwit-RNA en eiwit-kleine organische ligand interacties in cellen.
Een andere veel gebruikte hulpmiddel PPI studeren in een homoloog systeem is de co-immunoprecipitatie (co-IP) test 5. Door een antilichaam tegen een eiwit van belang immunoprecipitatie, co-IP assay kunnen onderzoekers PPI in cellen van verschillende omgevingsomstandigheden en experimentele het oog. Het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten (bijvoorbeeld FLAG, Myc, STREP en HA oa) in affiniteitszuivering (AP) methoden is de isolatie van eiwitten uit complexe eiwitmengsels meerdere downstream assays, zoals Western blot vergemakkelijkt zilverkleuring en enzymatische analyses. Geen van deze eerdere benaderingen maken de isolatie van grote hoeveelheden eiwitcomplexen voor verdere karakterisering zoals in vitro eenssays, ontdekking van regulatorische subeenheden door massaspectrometrie en identificatie van post-translationele modificaties. Een verbeterde versie van de AP methode heet Tandem AP (TAP), een zuiveringstechniek voor het bestuderen PPI door een fusie-eiwit met twee epitopen die wordt gezuiverd door middel van twee opeenvolgende APs 6, 7. In dit artikel presenteren we een variant TAP methode voor het zuiveren van eiwit complexen waarin twee subeenheden worden gelabeld met verschillende epitopen en vervolgens door middel van twee opeenvolgende APs (STREP AP gevolgd door FLAG IP). Eerst geven we een minimalistische overzicht van TAP (figuur 1) en vervolgens een gedetailleerde beschrijving van de experimentele stappen (figuur 2), zodat onderzoekers ze kunnen toepassen op hun eiwitcomplex plaats.
Om de toepasbaarheid van de TAP methode te tonen, kozen we voor een goed gekarakteriseerd cycline-CDK complex (aangeduid als PTEFB kinase), dat uit de regulerende subeenheid cycline T1 (CycT1) en een kinase (CDK9) en is betrokken bij de regulatie van de transcriptie door RNA polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforyleert het C-terminale domein van Pol II en de bijbehorende negatieve verlengingsfactoren, die transcriptionele pauzeren verlicht de promotor en vergemakkelijkt daardoor transcriptie elongatie 11, 12, 13. Bij deze bekende interactie in het achterhoofd, STREP-tag CycT1 en-FLAG tag CDK9 waren meer dan uitgedrukt in HEK293T cellen. Een wederzijdse TAP experiment werd uitgevoerd met STREP tag CDK9 en FLAG-tag CycT1 verder bevestigen dat het eiwit interactie is onafhankelijk van het gebruikte epitopen. Cellen werden verzameld en gelyseerd 48 uur na transfectie. Het oplosbare lysaat werd gezuiverd door middel van TAP (STREP AP gevolgd door FLAGIK P). Input en gezuiverde eiwitten werden geanalyseerd met western blot en zilverkleuring (Figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating Cellen
- Eén dag voor transfectie, plaat 3,5 x 10 6 HEK293T-cellen in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) penicilline / streptomycine (10.000 U / ml voorraad) per 100 mm schaal. Plate 3-5 schalen van 100 mm per experiment / voorwaarde om voldoende eiwit herstel te bewerkstelligen.
Opmerking: Het aantal platen moet worden bepaald voor elk experiment / conditie, die zal afhangen van de expressieniveaus en de oplosbaarheid van het eiwitcomplex plaats. Als alternatief, als grootschalige zuivering nodig, cellijnen kunnen worden aangepast aan groei in suspensie in spinner flessen 2, maar deze methode werkt niet voor transiënte transfecties.
2. cellen te transfecteren of induceren stabiele cellijnen
- Op de volgende dag, controleer dan de cellen onder de microscoop. 80% confluent voordat proce - cellen moeten 70 zijnEding.
- Transfecteren van de cellen met een totaal mengsel van 7 ug plasmide DNA en 21 pl transfectiereagens per 100 mm schaal. Transfecteren van cellen met een vector die GFP (Tabel 1) als controle voor transfectie-efficiëntie.
OPMERKING: Bij gebruik van een HEK293-T-Rex en dergelijke stabiele cellijn die de expressie van twee of meer complexe subeenheden in reactie op doxycycline 14, 15 induceert, zal de inductor moeten de cellen worden toegevoegd en gedurende 48 uur. Evenzo zou een stabiele cellijn die de expressie van GFP na toevoeging van de inductor induceert eveneens vereist voor validatiedoeleinden. Ga verder met stap 2.7. - Bereid de transfectie mengsel per 100 mm schaal. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, meng 500 pi DMEM niet aangevulde met 7 ug totaal plasmide DNA (corresponderend met twee of meer plasmiden). In een aparte microcentrifugebuis, meng 500 pi unsupplemented DMEM wie 21 ui van het transfectiereagens. Herhaal dit voor elke transfectie reactie.
- Pipetteer de transfectiereagens oplossing in de plasmide-DNA-oplossing (niet oplossingen in omgekeerde volgorde door elkaar). Meng door pipetteren minstens 4 keer.
- Incubeer dit mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 - 15 minuten, maar niet langer dan 15 min.
- Kantel de plaat naar een media-reservoir te creëren en voorzichtig pipet de transfectie mengsel druppelsgewijs op de binnenkant van de plaat zonder verstoring van de cellen. Zet de schotel naar zijn oorspronkelijke vlakke stand en schud zachtjes aan het mengsel te verdelen.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde celkweek incubator met 5% CO 2 (deze toestand wordt hierna "weefselkweek incubator"). Vervang de media 5 uur na transfectie (optioneel).
3. Controle Transfectie of Inductie Efficiency
- Op 24 uur na transfectie werden de cellen te visualiseren onder een grieporescent microscoop om te controleren op transfectie-efficiëntie (of inductie van controle HEK293T-Rex stabiele cellijn die GFP). Incubeer nog eens 24 uur.
4. STREP Affinity Purification (STREP AP)
- Verzamelen van de cellen
- Op 48 uur na transfectie, verwijder de kaart en voeg 8 ml koude 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Pipet op en neer om cellen los te maken van de plaat.
- Verzamelen en breng de celsuspensie in een 15 ml buis en spin de cellen neer op 800 xg gedurende 4 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant PBS. Herhaal de spin neer (800 xg gedurende 1 min bij 4 ° C) PBS om resten te elimineren. Bewaar de cel pellet bij -80 ° C voor toekomstig gebruik of volg de onderstaande procedure om eiwitzuivering blijven.
- Lyseren van de cellen
- Resuspendeer de cel pellets met behulp van 5 x het volume celpellet (~ 250 ul per plaat) van Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, proteaseremmer cocktail tablet, 5% v / v glycerol en 1,0% NP-40) en breng de celsuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Kort vortex de suspensie en nutate gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Spin down de celsuspensie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Breng de oplosbare lysaten in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de celpellets. 10% van het eindvolume van het oplosbare lysaat als "STREP AP Input". Bewaren bij 4 ° C.
- In evenwicht brengen van de STREP kralen
LET OP: Gebruik STREP parels voor de eerste AP stap! Complexen naar beneden getrokken met STREP kralen te herstellen aanzienlijk meer eiwitten dan die naar beneden getrokken met FLAG kralen.- Zetten (n × 40 pl) + n gl van 50% STREP kraal slurry (n = aantal monsters) en spin neer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
OPMERKING: Gebruik wide-mouthed tips om pipet kralen. - Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van PLB aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen. Resuspendeer de kralen in PLB tot een eindvolume van 40 pi n x.
- Voeg 40 ul van 50% STREP kraal suspensie aan elk cellysaat monster en nutate gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Zetten (n × 40 pl) + n gl van 50% STREP kraal slurry (n = aantal monsters) en spin neer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- STREP AP
- Spin down oplossing bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Verwijder de supernatant en opslaan als "STREP AP doorstroming (FT)" bij 4 ° C.
- Voeg 500 gl STREP AP wasbuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol en 0,2% NP-40) aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Herhaal dit voor een totaal van 4 wasbeurten.
- Herhaal dit voor een totaal van 4 wasbeurten.
- Voeg 500 ul wasbuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl en 1 mM EDTA) en equilibreren de kralen door het omkeren van de buizen. Spin down op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant.
- Elueer het eiwit van interesse met 50 ui STREP elutiebuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 2,5 mM desthiobiotine). Vortex bij 800 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Spin down de kralen aan 1500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof. Dit gedeelte komt overeen met de "AP STREP elutie" sample.
- Sparen de fractie kralen bij 4 ° C voor een tweede elutie, die zou kunnen opleveren om de helft van de hoeveelheid eiwit verkregen met de eerste elutie. Aliquot 10% van de STREP AP Elution voor zilverkleuring en / of Western blotting16.
- In evenwicht brengen van de FLAG kralen
- Neem (nx 16 ul) + n ul van FLAG kralen oplossing (n = aantal monsters) en spin neer op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C.
OPMERKING: Gebruik brede mond tips om pipet kralen. - Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van FLAG wasbuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% NP-40) aan de korrels. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen.
- Resuspendeer de kralen in FLAG wasbuffer tot een eindvolume van 16 pl nx.
- Voeg 16 ul van de FLAG kraal slurry de resterende STREP AP elutie nutate en overnacht bij 4 ° C.
- Neem (nx 16 ul) + n ul van FLAG kralen oplossing (n = aantal monsters) en spin neer op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C.
5. FLAG IP
- Spin down de FLAG parels suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Bewaar het supernatant en opslaan als "FLAG IP flow-through" (FT) bij 4 ° C.
- Voeg 50081, l van FLAG wasbuffer aan de oplossing. Nutate gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 4 wast en verwijder het supernatant na elke wasbeurt.
Opmerking: Voor de vierde spoeling, overdracht van de proteïne-kralenoplossing een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis om de achtergrond te verminderen. Deze stap is essentieel. - Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de laatste spin en voeg 30 ul van FLAG wasbuffer die 200 ng / ul van FLAG-peptide in de kralen. Vortex bij 800 rpm gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Spin down de suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Oogst de supernatant en bewaar bij 4 ° C als de "FLAG IP Elution."
OPMERKING: De elutie monsters kunnen worden bevestigd door zilverkleuring en / of Western blot met behulp van standaard protocollen 16 en zijn klaar voor verdere eiwitassays. Bij het opzetten van een western blot, draaien alle van de volgende monsters: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiop, (4) FLAG IP FT, en (5) FLAG IP Elutie. Volumes geladen moeten worden bepaald voor elk experiment. Alle verzamelde monsters en korrels kunnen voor kortstondige opslag en bij -80 ° C voor langdurige opslag worden bewaard bij 4 ° C. TAP monsters kunnen worden geanalyseerd met massaspectrometrie om de identiteit van de onderdelen controleren op nieuwe post-translationele modificaties (PTM) identificeren en / of voor een nieuw eiwit interactie met het gezuiverde complex 2, 17 ontdekken. Daartoe na het uitvoeren van een Coomassie gel of zilverkleuring, banden kan worden uitgesneden uit de gel met een schone scalpel. Diverse uitstekende recensies die massaspectrometrie methoden te bespreken werden eerder gepubliceerd 18, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel tonen we de toepassing van de TAP methode om de goed gekarakteriseerde CycT1 CDK9-complex (ook bekend als P-TEFb kinase).
Plasmiden die Cycline T1-STREP (CycT1: S) en CDK9-FLAG (CDK9: F) of CDK9-STREP (CDK9: S) en cycline T1-FLAG (CycT1: F) (Tabel 1) werden getransfecteerd in HEK293T-cellen . Negatieve controles opgenomen transfecties met een lege vector en CDK9: F of CycT1: F plasmiden (figuur 3A en B, respectievelijk). De eiwitten werden tot expressie gebracht gedurende 48 uur voordat de cellen werden verzameld. Meerdere platen van cellen gebruikt per experiment (vijf platen per monster werden gebruikt voor de in figuur 3 gegevens) die eiwitproductie en terugwinning te verhogen. Nadat de cellen in individuele microcentrifugebuizen werden gelyseerd, werden de cellysaten van hetzelfde monster gecombineerd in één microcentrifUGE buis voorafgaand aan het toevoegen van de STREP kralen. Combineren van de eiwitmonsters met één portie van korrels vergroot de uiteindelijke eiwitconcentratie, welk eiwit herstel van proteïnen die moeilijk uit te drukken zijn kunnen verbeteren. Na de aanvankelijke elutie kan een tweede elutie worden uitgevoerd om het totale eiwit ingang te verhogen voor de FLAG IP. Het is belangrijk om de ingang voor elke zuiveringsstap opslaan voordat het toevoegen van de korrels voor toekomstige probleemoplossing (tabel 2), indien nodig.
De gegevens in Figuur 3A toont de resultaten van de TAP methode CycT1: S en CDK9: F, door Western blot geanalyseerd. CDK9: F co-elueerde met CycT1: S van STREP parels, maar niet in de negatieve controle AP ontbreken CycT1: S, wat aangeeft dat CDK9: F en CycT1: S dus een eiwit-eiwitcomplex. Zoals verwacht, werden beide eiwitten gedetecteerd in de FLAG elutie, die verder de complexvorming bevestigd. Figuur 3B toont de results van de wederzijdse TAP methode, waarbij het epitoop tags van de twee eiwitten werden verwisseld (CDK9: S en CycT1: F), en geanalyseerd door Western blot.
Figuren 3C en 3D tonen de resultaten van de TAP en wederzijdse TAP door zilverkleuring geanalyseerd, respectievelijk. Figuur 3C laan 2 blijkt dat CDK9: F co-elueerde met CycT1: S af van de STREP parels, maar niet van controle AP (laan 1), hetgeen erop wijst dat CDK9: F en CycT1: S vormden een eiwit-eiwitcomplex. In de daaropvolgende elutie FLAG, zoals getoond in laan 4, CycT1: S co-elueerde met CDK9: F af van de FLAG parels. Evenzo figuur 3D gebleken dat CycT1: F co-elueerde met CDK9: S af van de STREP parels, maar niet van controle AP, en dat de eiwit-eiwitcomplex werd efficiënt teruggewonnen na de tweede stap FLAG IP. Zowel de westelijke vlekken en zilveren vlekken bevestigd dat het TAP protocol efficiënt werkte voor de purificatio n, isolatie en karakterisering van het eiwitcomplex plaats.
Figuur 1: Overzicht van TAP Purification Strategy. Een eenvoudig schema beschrijft de stappen van TAP. Plasmiden coderend voor het eiwit van belang met zowel de STREP of FLAG-epitoop tag worden tezamen getransfecteerd in zoogdiercellen. Na 48 uur inductie worden de cellen verzameld en gelyseerd. Oplosbare cellysaat bevattende het gewenste eiwit en andere eiwitten worden geladen op STREP kralen voor STREP AP. Eiwitten die ofwel bevatten of STREP tag gebonden aan de STREP-gemerkt eiwit verbonden aan de korrels worden daarna geëlueerd. De FLAG parels werden vervolgens toegevoegd aan de STREP elutie. Eiwitten die bevatten ofwel het FLAG tag of gebonden aan het FLAG-gemerkt eiwit verbonden aan de korrels worden daarna geëlueerd. Eluties kan worden geanalyseerd door de werkwijzen aangegeven.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van TAP-strategie. Een gedetailleerd protocol van TAP. Zie tekst voor details. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van stap-voor-stap analyse van TAP Purification. (A) Western blot analyse van TAP (CycT1: S en CDK9: F). (B) Western blot analyse van wederzijdse TAP (CDK9: S en CycT1: F). weerm 1 ml totaal cellysaat, 5 pl (0,2%) werd geladen als "STREP AP Input". 975 pl van het resterende totaal cellysaat werd STREP kralen voor STREP AP en 100 pl "STREP AP Elutie" werd verzameld toegevoegd. Hieruit 5 gl (2%) werd geladen. 80 ul van de "STREP AP Elutie" werd aan FLAG kralen voor FLAG IP en 30 pi "FLAG IP Elutie" werd verzameld toegevoegd. Van de 30 gl "FLAG IP Elutie", 7 gl (23,3%) werd geladen. (C) Silver vlek analyse van TAP (CycT1: S en CDK9: F). (D) Silver vlek analyse van wederzijdse TAP (CDK9: S en CycT1: F). 5 gl (2%) van "STREP AP Elutie" en 7 pl (23,3%) van "FLAG IP Elution" geladen. De sterretjes geven samen geëlueerd verontreinigingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Eiwit | residuen | Vector | Label | kloneringsplaatsen | Referentie |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - EcoRI | McNamara et al. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | VLAG | HindIII - EcoRI | Dit artikel |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - Xhol | Dit artikel |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FLAG | HindIII - Xhol | McNamara et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | STREP-FLAG | BamHI - XhoI | Dit artikel |
Tabel 1: De plasmiden die in deze studie. CycT1 en CDK9 werden geligeerd in de pcDNA / 4TO-STREP en pcDNA / 4TO-FLAG plasmidevectoren. Deze constructen werden getransformeerd in DH5a competente cellen en uitgeplaat op LB-ampicilline-platen. Kolonies werden geselecteerd, gekweekt, en gescreend. Succesvol geligeerd klonen werden geverifieerd door Sanger sequentiebepaling en de combinatie van restrictie digestie en agarosegelelektroforese. Voor CycT1 gebruikten we een kortere versie (1-708) in plaats van de volledige lengte (1-726), omdat de laatste 18 residu's bevatten een PEST sequentie (een peptidesequentie rijkproline, glutaminezuur, serine en threonine), die als een signaalpeptide voor eiwitafbraak 20. CDK9 was full-length. De volgorde van de tandem STREP tag is als volgt: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. De volgorde van de tandem FLAG tag is als volgt: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabel 2: Problemen oplossen tafel. Voordat u begint met het oplossen van problemen, dubbel te controleren om ervoor te zorgen dat elke essentiële stap is gevolgd. Bepaalde stappen in dit protocol vereisen meer optimalisatie dan anderen het verwachte resultaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven voor de expressie en isolatie van eiwitcomplexen van eukaryote cellen protocol is niet beperkt tot de biochemische eigenschappen van deze moleculaire samenstellingen, maar kan ook worden gebruikt voor de identificatie van nieuwe interactorenen post-translationele modificaties die de functie kan regelen. Het gebruik van affiniteitsmerkers is niet beperkt tot hetgeen vermeld in dit protocol; maar onze ervaring leert dat het gebruik STREP als eerste AP stap verbetert aanzienlijk de opbrengst van het uiteindelijke eiwit-eiwitcomplex. Zowel de binding en elutie stappen en naar de STREP kralen zijn zeer efficiënt in vergelijking met andere epitoop-tags (bijvoorbeeld FLAG). Bovendien, in theorie, TAP kan worden toegepast op andere eiwitten of domeinen met enkele kleine optimalisaties, zoals bufferomstandigheden, aantal platen per experiment (voor zowel tijdelijke als stabiele expressie systemen), enz. Verder kan de methode ook TAP toegepaste to andere cellijnen als specifiek eiwit complexen vereisen een speciaal systeem voor hun functie of hun interacties met unieke factoren. Om het oplossen van problemen te vergemakkelijken, is het sterk aanbevolen dat de input en FT monsters beide gered worden (tabel 2). Wanneer de verwachte eiwitbanden niet kunnen worden gevisualiseerd in de elutie kan de FT monsters worden gebruikt om het experiment te lossen en bepalen of het monster was gebonden en / of geëlueerd van de korrels.
Een succesvolle TAP strikt afhankelijk is van een hoog niveau van eiwit expressie en herstel. Zo zou onderzoekers moeten de hoeveelheid uitgangsmateriaal van geval tot geval te optimaliseren. Indien tijdelijke transfectie wordt gebruikt om eiwitcomponenten expressie dient de transfectie-efficiëntie van ten minste 70% zijn alvorens de tweede stap van de TAP. De wederzijdse TAP methode (waarbij de epitopen worden verwisseld tussen de twee aas) helpt gewoonlijk bij het bepalen welke experimentele strategieworden gebruikt om de beste zuiverheid en opbrengst te bereiken. Nogmaals, zal dit moeten worden onderzocht op een case-by-case basis. Belangrijker uitvoeren wederzijdse TAP bevestigt ook dat de PPI onafhankelijk van de affiniteit tag worden gebruikt.
Enkele aspecten van de TAP methode gepresenteerd hebben hierin beperkingen. Bijvoorbeeld, overexpressie VLAG en STREP gemerkte eiwitten kunnen artefacten voor het ectopisch tot expressie gebrachte eiwit zelf of hun interactorenen genereren. Ander epitoop labels kunnen beïnvloeden eiwitexpressie niveaus, eiwit conformatie en / of subcellulaire lokalisatie. Naast de beperking cellijn en transfectie-efficiëntie, de grootte van de complexen te zuiveren kan een probleem. Dit TAP methode werkt goed voor multi-subeenheid eiwitcomplexen. Onze ervaring kunnen vier componenten worden gedetecteerd door zilverkleuring (gegevens niet getoond). Als echter twee gelabelde componenten, de andere interactoren mogelijk niet co-gezuiverd op dezelfde stoichiometrische niveaus. daaromvoor dit doel, is het gebruik van cellijnen die lagere niveaus van expressie van de complexe componenten induceert geadviseerd. Een andere beperking zou de sterkte van de PPI. Indien de interacties niet stabiel genoeg, kunnen sommige onderdelen worden verloren tijdens de zuiveringsstappen (met name in de laatste stap FLAG IP).
TAP methode is eerder beschreven en verschillende epitoop-merkers werden getest, gevalideerd en vergeleken 6. Echter, de TAP methode in dit artikel is nieuw en biedt een eenvoudige, efficiënte, robuust, en alternatieve strategie om PPI's, complexe assemblage te bestuderen, en concluderen eiwit netwerk samenstelling en functie. Vergeleken met eerdere werkwijzen TAP Dit STREP-FLAG TAP strategie maakt de snelle zuivering van complexen voor verdere karakterisering zonder voorafgaande kennis van de complexe samenstelling, activiteit of functie; en zonder protease klieving (bijvoorbeeld TEV) voor elutie eiwit (which kan aanzienlijk dalen eiwit opbrengst). Vanwege de verhoogde eiwitcomplex herstel, de STREP-FLAG TAP werkwijze maakt ook de robuuste identificatie van eiwitten die associëren met het eiwitcomplex van belang cellen door tandem massaspectrometrie-analyse 10, 15. Vervolgens, andere methoden, zoals confocale microscopie, size exclusion chromatografie, en co-IP assays kunnen ook worden gebruikt om de PPI valideren. Ten slotte stellen wij dat een alternatieve versie van het TAP protocol kan worden aangepast om te zuiveren en bestuderen van de assemblage van discrete eiwit-RNA-complexen, die enorm onderzoekers helpen bij het gebied van RNA biologie.
Samenvattend presenteren we een werkwijze gezuiverd en gekarakteriseerd PPI in zoogdiercellijnen. Wij stellen voor dat deze methode wordt de basis gelegd voor de toekomst karakterisatie en functionele analyse van een groot aantal nieuwe eiwitcomplexen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
