Abstract
טיהור חלבונים פעילים ומכלולים חומצות גרעין חלבון חיוני לאפיון של פעילות אנזימטית ו דה נובו זיהוי של יחידות משנה רומן שלאחר translational שינויים. מערכות בקטריאלי לאפשר ביטוי וטיהור של מגוון רחב של פוליפפטידים יחיד קומפלקסי חלבונים. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת טיהור של יחידות משנה חלבון המכילים שלאחר translational שינויים (למשל, זירחון acetylation), ואת ההזדהות של יחידות משנה הרגולציה רומן כי הם רק בהווה / הביעו במערכת איקריוטיים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של רומן, חזק, וטיהור זיקת טנדם יעילה (TAP) שיטה באמצעות STREP- וחלבונים מתויג FLAG המאפשר הטיהור של קומפלקסי חלבונים עם זמני או ביציבות הביע-tagged חלבוני epitope מתאי איקריוטיים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לאפיין protein פונקציונליות מורכבות, לגלות שלאחר translational שינויים על יחידות משנה מורכבות, ולזהות רכיבים מורכבים רגולטוריות רומן על ידי ספקטרומטריית מסה. יש לציין, שיטת TAP זה ניתן להחיל ללמוד קומפלקסי חלבונים שהוקמו על ידי איקריוטיים או פתוגניים (נגיפיים וחיידקיים) רכיבים, ובכך מניב מגוון רחב של הזדמנויות ניסיון במורד זרם. אנו מציעים כי חוקרי עובדים עם קומפלקסי חלבונים יכולים לנצל גישה זו בדרכים רבות ושונות.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן קריטיות להסדרה המדויקת של תהליכים ביולוגיים 1, ומחקרים נוספים על PPIs אלה יכולים להודיע על תפקידם 2. גישות כמה כבר המציאו לחקר ואפיון של PPI כמו גם לזיהוי דה נובו של רכיבי חלבון הרגולציה הרומן. בשנת 1989, סטנלי פילדס ועמיתיו דיווחו על השנייה היברידי השמרים (Y2H) assay 3. גישה זו מאפשרת זיהוי המשוחדת ומקיפה של interactors (פושט) עבור חלבון מוגדר של עניין (פיתיון) ב שמר אפייה. בנוסף השירות המדהים שלה לגילוי PPIs, assay Y2H יכול לשמש לאפיון זוגות חלבון בתאי שמרים, הגדרה מינימאלי תחומי אינטראקציה, וזיהוי מוטציות לבטל אינטראקציות כאלה. על ידי שינוי assay Y2H, PPIs יכול להיות גם למד בתאי יונקיםclass = "Xref"> 4. וריאציות של assay Y2H (למשל, מערכת תלת-היברידית שמרים) יכול להיות מיושם גם ללמוד חלבון-רנ"א אינטראקציות ליגנד אורגני-קטן חלבונים בתאים.
כלי נוסף נפוץ ללמוד PPIs במערכת הומולוגית הוא immunoprecipitation שיתוף (שיתוף IP) assay 5. באמצעות נוגדן כדי immunoprecipitate חלבון של עניין, assay שיתוף IP מאפשר לחוקרים לעקוב אחר PPIs בתאים עבור תנאים סביבתיים שונים ומצבים ניסיוניים. השימוש-tagged חלבונים epitope (למשל, דגל, Myc, סטרפטוקוקוס, ו HA, בין היתר) טיהור זיקה (AP) שיטות יש להקל את הבידוד של חלבונים מתערובות חלבון מורכב במשך כמה מבחני במורד הזרם, כולל כתם המערבי, כתם כסף , וניתוח האנזימטית. עם זאת, אף אחד הגישות הקודמות אלה מאפשרים הבידוד של כמויות גדולות של קומפלקסי חלבונים עבור אפיון נוסף כולל במבחנהssays, גילוי יחידות משנת רגולציה על ידי ספקטרומטריית מסה, וזיהוי שלאחר translational שינויים. גרסה משופרת של שיטת AP נקראת טנדם AP (TAP), שהיא טכניקת טיהור ללימוד PPIs על ידי יצירת חלבון היתוך עם שני אפיטופים כי הוא מטוהר באמצעות שתי נקודות גישה עוקבות 6, 7. במאמר זה, אנו מציגים וריאציה של שיטת TAP עבור קומפלקסי חלבוני טיהור שבו שתי תת יחידות מתויגות עם אפיטופים שונים וטהרו מכן דרך שתי נקודות גישה סדרתית (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAG IP). אנחנו ראשונים לספק סקירה מינימליסטי של TAP (איור 1) ולאחר מכן תיאור מפורט של כל שלבי הניסוי (איור 2), כך חוקרים יכולים ליישם אותם על מורכבות עניין החלבון שלהם.
כדי להדגים את תחולתה של שיטת TAP, בחרנו היטב מאופיין cyclin-CDK מורכב (המכונה PTEFB קינאז), אשר מורכב של T1 cyclin למקטע רגולטוריות (CycT1) ו קינאז (CDK9), והוא מעורב בוויסות שעתוק על ידי RNA פולימראז II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphorylates תחום מסוף-C של Pol II וגורם ההתארכות השלילית הקשורות אליו, ובכך יקל שהשהיה תעתיק בבית האמרגן ובכך מקלת התארכות שעתוק 11, 12, 13. עם אינטראקציה ידועה זה בחשבון, סטרפטוקוקוס-מתויג CycT1 ו CDK9 מתויג FLAG היה מעל לידי ביטוי בתאי HEK293T. ניסוי TAP גומלין בוצע עם FLAG-מתויג CDK9 ו מתויג סטרפטוקוקוס CycT1 לאמת נוסף שאינטראקצית החלבון היא עצמאית של אפיטופים מנוצלים. תאים נאספו lysed 48 transfection שעות שלאחר. את lysate המסיס היה מטוהר על ידי TAP (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAGIP). קלט חלבונים מטוהרים נותחו על ידי כתם המערבי כתם כסף (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי ציפוי
- יום אחד לפני transfection, צלחת 3.5 x 10 6 תאים HEK293T ב 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יח '/ מ"ל המניות) לכל צלחת 100 מ"מ. פלייט 3 - 5 100 מנות מ"מ לכל ניסוי / מצב כדי להבטיח התאוששות מספיק חלבון.
הערה: מספר הצלחות יש לקבוע עבור כל ניסוי / מצב, אשר יסתמך על רמות הביטוי המסיס של מתחם החלבון של עניין. לחלופין, אם טיהור בקנה מידה גדול יותר יש צורך, שורות תאים ניתן להתאים לגדול השעיות צלוחיות טווה 2, אך שיטה זו לא תעבוד עבור transfections חולף.
2. Transfecting תאים או גרימת שורות תאים יציבות
- למחרת, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. התאים חייבים להיות 70 - 80% ומחוברות לפני proceeding.
- Transfect התאים עם תערובת הכוללת 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ו -21 μl של מגיב transfection לכל צלחת 100 מ"מ. תאים Transfect עם GFP להביע וקטור (טבלה 1) כביקורת על יעילות transfection.
הערה: אם אתה משתמש HEK293-T-Rex או שורת תאים יציבה דומה התופעה אשר עלול לגרום הביטוי של שתיים או יותר מורכבי יחידות משנה בתגובת דוקסיציקלין 14, 15, inducer יצטרך להתווסף התאים וטופח במשך 48 שעות. בדומה לכך, שורת תאים יציבה תופעה אשר עלולה לגרום ביטוי GFP על תוספת של inducer יהיה דרוש גם ולאמת אותם. עבור לשלב 2.7. - מכינים את תערובת transfection לכל צלחת 100 מ"מ. בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, לערבב 500 μl של DMEM unsupplemented עם 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד הכולל (המקביל ל שניים או יותר פלסמידים). בתוך צינור microcentrifuge נפרד, לערבב 500 μl של wi unsupplemented DMEM21 μl ה של מגיב transfection. חזור על הפעולה עבור כל תגובה transfection.
- פיפטה הפתרון מגיב transfection לתוך פתרון ה- DNA פלסמיד (לא לערבב פתרונות בסדר הפוך). מערבבים על ידי pipetting לפחות 4 פעמים.
- דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 - 15 דקות, אך לא יותר מ 15 דקות.
- הטה את הצלחת ליצור מאגר תקשורת ובזהירות פיפטה תערובת transfection ירידה מבחינת על הצד הפנימי של הצלחת מבלי להפריע את התאים. מחזירים את המנה למצב שטוח המקורי ו מערבולת בעדינות כדי לפזר את התערובת.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאי humidified עם 2 5% CO (תנאי זה להלן המכונה "חממה בתרבית רקמה"). החזר את שלאחר transfection hr תקשורת 5 (אופציונאלי).
3. Transfection סימון או יעילות אינדוקציה
- בגיל 24 שעות שלאחר transfection, לדמיין את התאים תחת שפעתמיקרוסקופ orescent כדי לבדוק יעילות transfection (או אינדוקציה של שורת תאים יציבים השליטה HEK293T-REX להביע GFP). דגירה של 24 שעות אחרות.
4. סטרפטוקוקוס טיהור זיקה (סטרפטוקוקוס AP)
- איסוף התאים
- בשעה 48 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה ולהוסיף 8 מ"ל של 1x קר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק תאים מהצלחת.
- אסוף ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל ומסובב את התאים למטה ב 800 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant PBS. חזור על ספין למטה (800 XG דקות 1 ב 4 ° C) כדי לחסל כל PBS שיורית. אחסן את התא גלולה ב -80 ° C לשימוש עתידי או פעל לפי הנוהל שלהלן כדי להמשיך טיהור חלבונים.
- Lysing התאים
- Resuspend את כדורי התא באמצעות 5 × נפח תא גלולה (~ 250 μl לכל צלחת) של הצפת תמוגה פסיבי(PLB: 20 mM Tris-HCl 7.5 pH, 150 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ 2 MgCl, 1 מ"מ DTT, לוח קוקטייל מעכב פרוטאז, 5% v / גליצרול נ, ו -1.0% NP-40) ולהעביר את ההשעיה התא 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge.
- בקצרה מערבולת ההשעיה nutate למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- ספין למטה השעית תא XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- מעביר את lysates המסיס לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש וזורק כדורי התא. חסוך 10% של הנפח הסופי של lysate המסיס כמו "קלט AP סטרפטוקוקוס." חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Equilibrating חרוזי סטרפטוקוקוס
הערה: השתמש סטרפטוקוקוס חרוזים עבור שלב AP הראשון! המכלולים הורידו עם חרוזי סטרפטוקוקוס לשחזר חלבון גבוה יותר מאשר אלו משכו מטה עם חרוזי FLAG.- להוציא (n × 40 μl) + n μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
הערה: השתמש רחב-מ 'טיפים outhed חרוזים פיפטה. - הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של PLB על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C.
- חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. Resuspend את החרוזים PLB לנפח סופי של n × 40 μl.
- הוסף 40 μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס לטעום כל lysate התא nutate עבור שעה 2 ב 4 ° C.
- להוציא (n × 40 μl) + n μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
- סטרפטוקוקוס AP
- ספין למטה פתרון ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ג.
- הסר את supernatant וחנות בשם "סטרפטוקוקוס AP זרימת הדרך (FT)" על 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 500 μl של סטרפטוקוקוס AP הצפת לשטוף לי (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ 2 MgCl, 1 מ"מ DTT, גליצרול 5% ו -0.2% NP-40) על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. בטל supernatant.
- חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף.
- חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף.
- הוסף 500 μl לשטוף הצפת השנייה (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, ו 1 mM EDTA) לאזן את החרוזים על ידי היפוך הצינורות. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- Elute החלבון של עניין עם 50 μl של סטרפטוקוקוס הצפת elution (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -2.5 מ"מ Desthiobiotin). וורטקס ב 800 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 °.
- ספין למטה חרוזים ב 1500 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant. חלק זה תואם המדגם "סטרפטוקוקוס AP Elution".
- שמור את החלק יחסי חרוז על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת elution שני, אשר יכול להניב עד מחצית כמות החלבון שהושגה עם elution הראשון. Aliquot 10% של סטרפטוקוקוס AP Elution עבור צביעת כסף ו / או המערבי סופג16.
- Equilibrating חרוזי FLAG
- להוציא (NX 16 μl) + n μl של פתרון חרוזים FLAG (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
הערה: השתמש בעצות פעורות פה חרוז פיפטה. - הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.1% NP-40) על חרוזים. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף.
- Resuspend את החרוזים חיץ לשטוף FLAG לנפח סופי של μl 16 NX.
- להוסיף 16 μl של slurry חרוז הדגל elution סטרפטוקוקוס AP הנותרים ולינה nutate על 4 מעלות צלזיוס.
- להוציא (NX 16 μl) + n μl של פתרון חרוזים FLAG (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
5. FLAG IP
- ספין למטה השעית חרוזי FLAG ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וחנות בשם "הדגל IP הזרימה דרך" (FT) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- הוספת 50081; l של חיץ FLAG לשטוף לפתרון. Nutate במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף ולהסיר את supernatant לאחר כל שטיפה.
הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את פתרון חלבון-חרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את הרקע. צעד זה חיוני. - הסר את supernatant מן הסיבוב האחרון ולהוסיף 30 μL של חיץ לשטוף FLAG המכיל 200 ng / μl של פפטיד FLAG לתוך חרוזים. וורטקס ב 800 סל"ד במשך שעה 2 ב 4 ° C..
- ספין למטה ההשעיה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. קציר supernatant וחנות ב 4 ° C כמו "FLAG IP Elution."
הערה: דגימות elution יכולות להיות מאושרות על ידי כתם כסף ו / או כתם מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 16, והם מוכנים מבחני חלבון נוספים. בעת הגדרת כתם מערבי, להפעיל את כל הדגימות הבאות: (1) קלט AP סטרפטוקוקוס, (2) סטרפטוקוקוס AP FT, (3) סטרפטוקוקוס AP Elutiעל, (4) דגל IP FT, ו (5) דגל IP Elution. כרכים הטעונים יצטרכו להיקבע עבור כל ניסוי. כל הדגימות וחרוזים שנאספו ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. דגימות TAP יכולות להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לאמת את הזהות ומרכיביהן, לזהות שינויים שלאחר translational רומן (PTMs), ו / או לגלות כל אינטראקצית חלבון רומן עם המורכבות המטוהרות 2, 17. לשם כך, אחרי ריצת כתם ג'ל או כסף coomassie, להקות ניתן ניכרו מן ג'ל באמצעות אזמל נקי. ביקורות מצוינות כמה דנים בשיטות ספקטרומטריית מסה פורסמו בעבר 18, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במאמר זה, אנחנו מדגימים את תחולתה של שיטת TAP למתחם CycT1-CDK9 היטב מאופיין (הידוע גם בשם קינאז P-TEFb).
פלסמידים קידוד Cyclin T1-סטרפטוקוקוס (CycT1: S) ו-FLAG CDK9 (CDK9: F), או CDK9-סטרפטוקוקוס (CDK9: S) ו Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (טבלה 1), היו transfected לתאי HEK293T . בקרות שליליות כללו transfections עם וקטור ריק ואת CDK9: F או CycT1: פלסמידים F (איורים 3 א 'וב', בהתאמה). החלבונים התבטאו במשך 48 שעות לפני התאים נאספו. הצלחות מרובות של תאים שימשו לכל ניסוי (חמש צלחות לדגימה שימשו בנתונים המוצגים באיור 3) להגדיל את הייצור והתאוששות חלבון. אחרי התאים היו lysed צינורות microcentrifuge הפרט, lysates תא של מדגם זהה אוחדו לאחת microcentrifצינור Uge לפני הוספת חרוזי סטרפטוקוקוס. שילוב דגימות החלבון עם מנה אחת של חרוזים מגדיל את ריכוז החלבון הסופי, אשר יכול לשפר את התאוששות חלבון מחלבונים שקשה לבטא. בעקבות elution הראשונית, ניתן לעשות זאת elution השני כדי להגביר את קלט החלבון הכולל עבור IP FLAG. חשוב לשמור את הקלט לכל שלב טיהור לפני הוספת חרוזים לפתרון בעיות בעתיד (טבלה 2), במידת הצורך.
הנתונים באיור 3 א מציג את התוצאות של השיטה TAP עבור CycT1: S ו- CDK9: F, ונותחו על ידי כתם המערבי. CDK9: F שיתוף eluted עם CycT1: S מן החרוזים סטרפטוקוקוס, אבל לא בפרוטוקול הנוסף בקרה שלילית חסר CycT1: S, המציין CDK9 כי: F ו CycT1: S להקים קומפלקס חלבון-חלבון. כצפוי, שני החלבונים אותרו elution FLAG, אשר נוסף אשר את ההיווצרות המורכבת. איור 3 ב מציג את resuLTS של השיטה TAP גומלין, שבו תגים epitope של שני החלבונים הוחלפו (CDK9: S ו- CycT1: F), ונותחו על ידי כתם המערבי.
דמויות 3C ו 3D להראות את התוצאות של הקש והקש גומלין ונותח על ידי צביעת כסף, בהתאמה. איור 3 ג מסלול 2 הראה כי CDK9: F שיתוף eluted עם CycT1: S הנחה של חרוזי סטרפטוקוקוס, אך לא מן AP המלא (מסלול 1), ובכך המציין כי CDK9: F ו CycT1: S נוצרו קומפלקס חלבונים. בשנות ה elution FLAG הבאים, כפי שמוצג מסלול 4, CycT1: S שיתוף eluted עם CDK9: F הנחה של חרוזים FLAG. באופן דומה, איור 3D הראה כי CycT1: F שיתוף eluted עם CDK9: S הנחה של חרוזי סטרפטוקוקוס, אך לא מן AP השליטה, וכי מתחם החלבונים נמצא יעיל לאחר שלב IP הדגל השני. הן הכתמים המערביים וכתמי כסף אשרו כי פרוטוקול TAP עבד ביעילות עבור purificatio n, בידוד, ואפיון של מתחם החלבון של עניין.
איור 1: סקירה כללית של אסטרטגית טיהור TAP. ערכה פשוטה המתארת את השלבים של TAP. פלסמידים המקודד את החלבון של עניין גם עם תג epitope סטרפטוקוקוס או FLAG הם שיתוף transfected לתאי יונקים. לאחר 48 אינדוקציה h, התאים נאספים lysed. lysate תא מסיסים המכיל את החלבון של עניין יחד עם חלבונים אחרים נטען חרוזים סטרפטוקוקוס עבור הדלקת AP. חלבונים שכוללים את תג סטרפטוקוקוס או המאוגדים חלבון סטרפטוקוקוס-מתויג המצורפים החרוזים אז הם eluted. חרוזי FLAG אז נוספו לתוך elution סטרפטוקוקוס. חלבונים שכוללים את תג FLAG או המאוגדים חלבון FLAG-מתויג המצורפים החרוזים אז הם eluted. Elutions יכול להיות מנותח על ידי השיטות המצוינות.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ייצוג סכמטי של אסטרטגית TAP. פרוטוקול מפורט של TAP. ראו טקסט לקבלת פרטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דוגמה של צעד-אחר-צעד ניתוח של טיהור TAP. (א) ניתוח כתם המערבי של TAP (CycT1: S ו- CDK9: F). (ב) ניתוח כתם המערבי של TAP גומלין (CDK9: S ו- CycT1: F). הלוך ושוב מ 1 מ"ל של lysate התא כולו, 5 μl (0.2%) היה טעון כמו "קלט סטרפטוקוקוס AP." 975 μl של lysate כל תא הנותרים התווסף חרוזים סטרפטוקוקוס עבור דלקת AP ו 100 μl של "סטרפטוקוקוס AP Elution" נאסף. מכאן, 5 μl (2%) היה טעון. 80 μl של "Elution AP סטרפטוקוקוס" התווסף חרוזים FLAG עבור IP הדגל 30 μl של "דגל IP Elution" נאסף. מתוך 30 μl של "דגל IP Elution", 7 μl (23.3%) היה טעון. (ג) ניתוח כתם כסף של TAP (CycT1: S ו- CDK9: F). (ד) ניתוח כתם כסף של TAP גומלין (CDK9: S ו- CycT1: F). 5 μl (2%) של "Elution AP סטרפטוקוקוס" ו -7 μl (23.3%) של "דגל IP Elution" הועמסו. הכוכביות מצביעות זיהומי שיתוף eluted. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| חֶלְבּוֹן | שאריות | וֶקטוֹר | תָג | אתרי שיבוט | התייחסות |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | סטרפטוקוקוס | HindIII - EcoRI | מקנמרה ואח. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | דֶגֶל | HindIII - EcoRI | המאמר הזה |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | סטרפטוקוקוס | HindIII - XhoI | המאמר הזה |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FLAG | HindIII - XhoI | מקנמרה et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | סטרפטוקוקוס-FLAG | BamHI - XhoI | המאמר הזה |
טבלה 1: פלסמידים השתמשו במחקר זה. CycT1 ו CDK9 היו ligated לתוך וקטורים פלסמיד pcDNA / 4TO-סטרפטוקוקוס ו pcDNA / 4TO הדגל. שני המושגים הללו הפכו תאים מוסמכים DH5α ו מצופים על צלחות LB-אמפיצילין. מושבות נבחרו, גדלו, הוקרנו. שיבוטים ligated בהצלחה אומתו על ידי רצף סנגר והשילוב של עיכול הגבלה ו ג'ל אלקטרופורזה agarose. לקבלת CycT1 השתמשנו בגרסה מקוצרת (1 - 708) במקום אורך המלא (1 - 726) כי 18 השאריות האחרונות להכיל רצף PEST (רצף הפפטיד עשירפרולין, חומצה גלוטמית, סרין, תראונין ו), אשר משמש פפטיד האות פירוק חלבונים 20. CDK9 היה באורך מלא. הרצף של תג טנדם סטרפטוקוקוס הוא כדלקמן: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. הרצף של תג FLAG טנדם הוא כדלקמן: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
טבלה 2: לוח פתרון בעיות. לפני התחילה עם פתרון בעיות, בדוק כדי לוודא שכל צעד חיוני כבר אחרי. צעדים מסוימים בפרוטוקול זה דורש יותר אופטימיזציה יותר מאחרים כדי להשיג את התוצאה המקווה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן לביטוי והבידוד של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים אינו מוגבל באפיון ביוכימי של מכלולים מולקולריים כזה, אבל יכול גם להיות מנוצל לצורך זיהוי של interactors רומן שלאחר translational שינויים שיכולים לווסת את תפקידם. הניצול של תגי קרבה אינו מוגבל למה מוזכר בפרוטוקול זה; אבל מניסיוננו עולה כי באמצעות סטרפטוקוקוס כצעד AP הראשון משפר באופן משמעותי את התשואה של מתחם החלבונים הסופי. הן המדרגות מחייבות elution וממנה החרוזים סטרפטוקוקוס הן מאוד יעילות בהשוואת תגי epitope אחרים (למשל, FLAG). בנוסף, בתיאוריה, TAP יכול להיות מיושם על חלבונים או תחומים אחרים עם כמה אופטימיזציות קטין, כגון תנאי חיץ, מספר צלחות לכל ניסוי (עבור שתי המערכות להביע חולף ויציבה), וכו 'יתר על כן, השיטה TAP יכול גם להיות t שימושיתo שורות תאים אחרות אם קומפלקסי חלבונים ספציפיים דורשים מערכת מיוחדת תפקידם או האינטראקציות שלהם עם גורמים ייחודיים. כדי להקל על פתרון בעיות, מומלץ מאוד כי דגימות קלט FT הן תישמרנה (טבלה 2). כאשר להקות חלבון צפוי לא ניתן דמיינו את elution, דגימות FT יכול לשמש כדי לפתור את הניסוי לקבוע אם המדגם היה כבול ו / או eluted off של חרוזים.
ברז מוצלח תלוי אך ורק על רמות גבוהות של ביטוי חלבון והתאוששות. לכן, החוקרים היו צריכים לייעל את כמות חומר המוצא על בסיס כל מקרה לגופו. אם transfection חולף משמש להביע רכיבי חלבון, יעילות transfection צריכה להיות לפחות 70% לפני שתמשיך לשלב השני של TAP. שיטת TAP הגומלין (שבו אפיטופים הם החליפו בין שתי פיתיון) בדרך כלל עוזרת בקביעת אסטרטגיה ניסיוןיש להשתמש כדי להשיג את הטוהר ואת התשואה הטובה ביותר. שוב, זה יצטרך להיחקר על בסיס כל מקרה לגופו. חשוב לציין, ביצוע TAP הגומלין גם מאשר כי PPI אינו תלוי תג הזיקה בשימוש.
היבטים מסוימים של שיטת TAP המוצגים כאן יש מגבלות. לדוגמה, overexpressing FLAG- וחלבונים מתויג סטרפטוקוקוס יכול להסיק מסקנות שגויות לחלבון ectopically התבטא או interactors שלהם. תגים epitope שונים עשויים להשפיע על רמות ביטוי חלבון, קונפורמציה חלבון, ו / או לוקליזציה subcellular. מלבד יעילות transfection קו ותא ההגבלה, בגודל של המתחמים להיטהר עלול להיות בעיה. שיטת TAP זה עובד היטב עבור קומפלקסים חלבונים רב למקטע. מניסיוננו, ארבעה מרכיבים יכולים להיות מזוהים על ידי כתם כסף (מידע לא מוצג). עם זאת, כאשר באמצעות רכיבים שני מתויגים, את interactors האחר עשוי לא להיות שיתוף מטוהר ברמות stoichiometric זהות. לכן,עבור יעד מסוים זה, השימוש של שורות תאים שגורם רמות נמוכות יותר של ביטוי של הרכיבים המורכבים מומלץ. מגבלה נוספת תהיה הכח של PPI. אם האינטראקציות אינן יציבות מספיק, כמה רכיבים עלולים ללכת לאיבוד במהלך השלבים לטיהור (במיוחד בשלב IP FLAG הסופי).
שיטת TAP תוארה בעבר וכמה תגי epitope שונים נבדקו, תוקף, ולעומת 6. עם זאת, שיטת TAP שהוצגה במאמר זה היא רומן ומספקת אסטרטגיה יעילה ונוחה, חזקה, ואלטרנטיבית ללמוד PPIs, הרכבה מורכבת, להסיק רכב רשת חלבון ותפקודו. בהשוואה לשיטות TAP קודמות, אסטרטגית TAP סטרפטוקוקוס-הדגל הזה מאפשרת לטיהור המהירה של מתחמים עבור אפיון נוסף ללא ידע מוקדם של הרכב, פעילות, או פונקציה המורכבת; וללא צורך של מחשוף פרוטאז (למשל, TEV) עבור elution חלבון (ש"שich יכול להפחית משמעותי בתשואת חלבון). בגלל ההתאוששות המורכבת החלבון המוגברת, שיטת TAP-FLAG סטרפטוקוקוס מאפשרת גם לזיהוי החזק של חלבונים מקשרים עם מורכב החלבון של עניין תאים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסת טנדם 10, 15. בהמשך לכך, שיטות אחרות, כמו מיקרוסקופיה confocal, כרומטוגרפיה הדרה גודל, מבחני-IP שיתוף, יכול גם להיות מנוצל כדי לאמת את PPI. לבסוף, אנו מציעים כי גרסה חלופית של פרוטוקול TAP יכולה להיות מותאמת כדי לטהר וללמוד את ההרכבה של קומפלקסי חלבונים-RNA בדידים, אשר יסייעו מאוד חוקרים בתחום ביולוגית RNA.
לסיכום, אנו מציגים שיטה לטהר ולאפיין PPIs בשורות תאי יונקים. אנו מציעים כי שיטה זו מניחה את היסודות לאפיון בעתיד והניתוח פונקציונלי של קומפלקסי חלבונים רבים רומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
