Abstract
La purificazione della proteina-proteina attiva e complessi acido nucleico-proteina è cruciale per la caratterizzazione delle attività enzimatiche e de novo identificazione di nuovi subunità e modificazioni post-traduzionali. sistemi batterici permettono l'espressione e la purificazione di una grande varietà di singoli polipeptidi e proteine complessi. Tuttavia, questo sistema non consente la purificazione di subunità proteiche che contengono modificazioni post-traduzionali (ad esempio, fosforilazione e acetilazione), e l'identificazione di nuovi subunità regolatorie che sono presenti solo / espressi nel sistema eucariotico. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un romanzo, robusto, ed efficiente metodo di purificazione tandem affinità (TAP) utilizzando STREP- e le proteine FLAG-tag che facilita la purificazione di complessi proteici con transitoriamente o stabilmente espresso proteine epitopi-tag da cellule eucariotiche. Questo protocollo può essere applicata per caratterizzare protEin funzionalità complesse, alla scoperta di modificazioni post-traduzionali su subunità complesse, e per identificare nuovi componenti complessi normativi mediante spettrometria di massa. In particolare, questo metodo TAP può essere applicato per studiare complessi proteici formati da componenti eucariotiche o patogeni (virali e batteriche), ottenendo così una vasta gamma di possibilità sperimentali valle. Proponiamo che i ricercatori che lavorano con i complessi proteici potrebbero utilizzare questo approccio in molti modi diversi.
Introduction
Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la precisa regolazione dei processi biologici 1, e ulteriori studi su questi inibitori della pompa protonica può dare informazioni relative la loro funzione 2. Diversi approcci sono stati ideati per lo studio e la caratterizzazione di IPP e per l'identificazione de novo di nuove componenti proteici normativi. Nel 1989, Stanley Campi e colleghi hanno riportato il lievito doppio ibrido (Y2H) test 3. Questo approccio consente l'identificazione imparziale e completa di interattori (prede) per una proteina definito di interesse (esche) in Saccharomyces cerevisiae. Oltre alla sua notevole utilità per scoprire IPP, il saggio Y2H può essere utilizzato per caratterizzare coppie di proteine in cellule di lievito, definendo domini interagenti minime, e identificare mutazioni che aboliscono tali interazioni. Modificando il test Y2H, inibitori della pompa protonica può anche essere studiata in cellule di mammiferoclass = "xref"> 4. Variazioni del dosaggio Y2H (ad esempio, il sistema di lievito tre ibrido) possono essere applicate anche a studiare proteina-RNA e proteina-piccola interazioni legante organico nelle cellule.
Un altro strumento comunemente utilizzato per studiare PPI in un sistema omologo è il test 5 co-immunoprecipitazione (co-IP). Utilizzando un anticorpo per immunoprecipitare una proteina di interesse, il test di co-IP permette ai ricercatori di monitorare PPI nelle celle per diverse condizioni ambientali e situazioni sperimentali. L'uso di proteine epitopi-tag (ad esempio, la bandiera, Myc, STREP, e HA, tra gli altri) in purificazione di affinità (AP) metodi ha facilitato l'isolamento di proteine da miscele complesse di proteine per diversi saggi a valle, tra cui Western Blot, macchia d'argento , e l'analisi enzimatica. Tuttavia, nessuno di questi approcci precedenti consentire l'isolamento di grandi quantità di complessi proteici per un'ulteriore caratterizzazione compreso in vitro unssays, scoperta di subunità regolatorie mediante spettrometria di massa, e l'identificazione di modificazioni post-traslazionali. Una versione migliorata del metodo AP viene chiamato Tandem AP (TAP), che è una tecnica di purificazione per studiare IPP creando una proteina di fusione con due epitopi che viene purificato mediante due AP successive 6, 7. In questo articolo, vi presentiamo una variante del metodo TAP per purificare complessi proteici in cui due subunità sono contrassegnati con diversi epitopi e poi purificato attraverso due punti di accesso sequenziali (STREP AP seguiti da FLAG IP). In primo luogo abbiamo a disposizione una panoramica minimalista di TAP (figura 1) e poi una descrizione dettagliata di tutte le fasi sperimentali (figura 2), in modo che i ricercatori li possono applicare alla loro complesso proteina di interesse.
Per dimostrare l'applicabilità del metodo di TAP, abbiamo scelto un ben caratterizzato ciclina-CDK complesso (di seguito PTEFB chinasi), che è composto della ciclina T1 subunità regolatrice (CycT1) e una chinasi (CDK9), ed è coinvolto nella regolazione della trascrizione di RNA polimerasi II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila il dominio C-terminale di Pol II e dei suoi fattori di allungamento negativi associati, che allevia la pausa trascrizionale al promotore e facilita in tal modo la trascrizione allungamento 11, 12, 13. Con questa interazione conosciuta in mente, STREP-tag CycT1 e CDK9 FLAG-tag sono stati oltre espresso in cellule HEK293T. Un esperimento TAP reciproca è stata eseguita con CDK9 STREP-tag e FLAG-tagged CycT1 per convalidare ulteriormente che l'interazione proteina è indipendente dalle epitopi utilizzati. Le cellule sono state raccolte e lisate 48 ore dopo la trasfezione. Il lisato solubile è stato purificato dalla TAP (STREP AP seguito da FLAGIP). Input e proteine purificate sono state analizzate mediante western blot e macchia d'argento (Figura 3).
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Protocol
1. Cellule placcatura
- Un giorno prima della trasfezione, piastra di 3,5 x 10 6 cellule HEK293T in 10 mL di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml magazzino) per ogni piatto a 100 mm. Tavola 3 - 5 100 piatti mm per esperimento / condizione per garantire il recupero di proteine sufficiente.
NOTA: Il numero di lastre deve essere determinato per ogni esperimento / condizione, che si baserà sui livelli di espressione e la solubilità del complesso proteina di interesse. In alternativa, se è necessaria la purificazione scala ingrandita, linee cellulari possono essere adattati a crescere in sospensione in fiaschi filatore 2, ma questo metodo non funziona per trasfezioni transitorie.
2. transfecting cellule o indurre linee cellulari stabili
- Il giorno seguente, controllare le cellule sotto il microscopio. Le cellule devono essere 70 - 80% confluenti prima proceEding.
- Trasfezione delle cellule con una miscela totale di 7 mg di DNA plasmidico e 21 ml di reagente per trasfezione piatto a 100 mm. Cellule trasfezione con un vettore che esprime GFP (Tabella 1) come controllo per l'efficienza di trasfezione.
NOTA: Se si utilizza un HEK293-T-Rex o simile linea cellulare stabile che induce l'espressione di due o più complessi subunità in risposta alla doxiciclina 14, 15, l'induttore dovrà essere aggiunto alle cellule e incubate per 48 ore. Analogamente, una linea cellulare stabile che induce l'espressione di GFP dopo l'aggiunta del induttore sarebbe necessaria anche per scopi di convalida. Passare al punto 2.7. - Preparare la miscela di trasfezione per ogni piatto a 100 mm. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, miscelare 500 ml di DMEM senza supplementi con 7 mg di DNA plasmidico totale (corrispondente a due o più plasmidi). In una provetta separata, mescolare 500 ml di DMEM senza supplementi with 21 ml di reagente di trasfezione. Ripetere l'operazione per ogni reazione trasfezione.
- Pipetta la soluzione di trasfezione del reagente nella soluzione plasmide DNA (non mescolare soluzioni in ordine inverso). Mescolare pipettando almeno 4 volte.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 - 15 min, ma non più di 15 min.
- La piastra per creare un serbatoio media e accuratamente pipetta la miscela di trasfezione goccia a goccia sul lato interno della piastra senza disturbare le cellule. Riportare il piatto nella posizione piatta originale e miscelare delicatamente per distribuire il composto.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura cellulare con 5% di CO 2 (questa condizione è seguito indicato come "coltura tissutale incubatore"). Sostituire i media 5 ore dopo la trasfezione (opzionale).
3. Controllo Transfection o induzione efficienza
- A 24 ore dopo la trasfezione, visualizzare le cellule in una influenzaMicroscopio orescent per verificare l'efficienza di trasfezione (o induzione di controllo HEK293T-Rex linea cellulare stabile che esprimono GFP). Incubare per altre 24 ore.
4. STREP Affinity Purification (STREP AP)
- Raccogliere le cellule
- A 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto e aggiungere 8 ml di soluzione fisiologica fredda 1x tampone fosfato (PBS). Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra.
- Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e girare le celle in basso a 800 xg per 4 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante PBS. Ripetere la rotazione verso il basso (800 xg per 1 min a 4 ° C) per eliminare eventuali residui di PBS. Conservare il pellet a -80 ° C per un uso futuro o seguire la procedura qui sotto per continuare purificazione della proteina.
- Lisi delle cellule
- Risospendere il pellet di cellule utilizzando 5 × volume pellet cellulare (~ 250 microlitri per piastra) di Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, proteasi tablet inibitore cocktail, 5% v / v di glicerolo, e 1,0% NP-40) e trasferire la sospensione cellulare in un 1,5 ml provetta.
- Brevemente vortice sospensione e nutate per 30 minuti a 4 ° C.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire i lisati solubili in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet di cellule. Risparmi 10% del volume finale del lisato solubile "STREP AP Input." Conservare a 4 ° C.
- Equilibrando le perline STREP
NOTA: Utilizzare STREP perline per il primo passo di AP! Complessi tirato giù con perline STREP recuperare significativamente più proteine di quelle abbattute con perline FLAG.- Estrarre (n × 40 ml) + n ml di STREP tallone slurry 50% (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
NOTA: utilizzare in tutto il mpunte outhed a perline pipetta. - Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di PLB ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
- Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere le sfere in PLB ad un volume finale di n × 40 microlitri.
- Aggiungere 40 ml di 50% STREP tallone slurry per ogni campione lisato cellulare e nutate per 2 ore a 4 ° C.
- Estrarre (n × 40 ml) + n ml di STREP tallone slurry 50% (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
- STREP AP
- Spin down soluzione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e conservare come "STREP AP flusso-through (FT)" a 4 ° C.
- Aggiungere 500 pl di STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 5% glicerolo e 0,2% NP-40) ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
- Ripetere per un totale di 4 lavaggi.
- Ripetere per un totale di 4 lavaggi.
- Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, e 1 mM EDTA) ed equilibrare le perline invertendo i tubi. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Eluire la proteina di interesse con 50 ml di tampone di eluizione STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2,5 mM Desthiobiotin). Vortex a 800 rpm per 15 min a 4 ° C.
- Spin giù le perline a 1.500 xg per 1 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. Tale quota corrisponde al campione "STREP AP Elution".
- Salvare la frazione perline a 4 ° C per una seconda eluizione, che potrebbe produrre fino a metà della quantità di proteina ottenuta con la prima eluizione. Aliquotare 10% del STREP AP Elution per la colorazione argento e / o western blotting16.
- Equilibrando le perline FLAG
- Estrarre (nx 16 ml) + n ml di soluzione di FLAG perline (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
NOTA: utilizzare punte bocca larga per perline pipetta. - Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% NP-40) ai talloni. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
- Risospendere le sfere in tampone di lavaggio FLAG ad un volume finale di nx 16 ml.
- Aggiungere 16 ml di liquame FLAG tallone per il restante eluizione STREP AP e pernottamento nutate a 4 ° C.
- Estrarre (nx 16 ml) + n ml di soluzione di FLAG perline (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
5. FLAG IP
- Spin giù la sospensione perline FLAG a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante e conservare come la "FLAG IP Flow-through" (FT) a 4 ° C.
- Aggiungere 50081; l di tampone di lavaggio FLAG alla soluzione. Nutate per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 4 lavaggi e rimuovere il surnatante dopo ogni lavaggio.
NOTA: prima il quarto lavaggio, trasferire la soluzione proteica-perline in una nuova provetta da 1,5 ml per ridurre sfondo. Questo passaggio è fondamentale. - Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere 30 ml di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 ng / ml di FLAG peptide nelle perline. Vortex a 800 rpm per 2 ore a 4 ° C.
- Centrifugare la sospensione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a 4 ° C come la "FLAG IP eluizione."
NOTA: I campioni di eluizione possono essere confermate con macchia d'argento e / o Western Blot utilizzando protocolli standard di 16, e sono pronti per ulteriori analisi di proteine. Quando si imposta un Western Blot, eseguire tutti i seguenti campioni: (1) STREP AP Ingresso, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutisu, (4) FLAG IP FT, e (5) bandiera IP eluizione. I volumi caricati dovranno essere determinati per ogni esperimento. Tutti i campioni raccolti e perline possono essere conservati a 4 ° C per una conservazione a breve termine e a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Campioni TAP possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per verificare l'identità dei loro componenti, per identificare nuove modificazioni post-traduzionali (PTM), e / o per scoprire ogni interazione proteina romanzo con il complesso purificato 2, 17. A tale scopo, dopo l'esecuzione di un gel Coomassie o argento macchia, bande possono essere tagliate dal gel utilizzando un bisturi pulito. Diversi ottime recensioni che discutono i metodi di spettrometria di massa sono stati pubblicati in precedenza 18, 19.
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Representative Results
In questo articolo, abbiamo dimostrato l'applicabilità del metodo TAP per il ben caratterizzato CycT1-CDK9 complesso (noto anche come P-TEFb chinasi).
I plasmidi codificanti ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabella 1), sono state trasfettate in cellule HEK293T . I controlli negativi inclusi trasfezioni con un vettore vuoto e il CDK9: F o CycT1: (rispettivamente figure 3A e B) plasmidi F. Le proteine sono state espresse per 48 ore prima che le cellule sono state raccolte. Diverse piastre di cellule sono stati usati per esperimento (cinque piastre per campione sono stati utilizzati per i dati presentati in Figura 3) per aumentare la produzione ed il recupero di proteine. Dopo che le cellule sono state lisate in tubi da microcentrifuga individuali, i lisati cellulari dello stesso campione sono stati combinati in un unico microcentrifTubo uge prima di aggiungere le perline streptococco. Combinando i campioni di proteine con una porzione di perline aumenta la concentrazione proteica finale, che può migliorare il recupero proteina da proteine che sono difficili da esprimere. Dopo l'eluizione iniziale, una seconda eluizione può essere realizzata in modo da aumentare il quantitativo totale di proteine per il PI FLAG. È importante salvare l'input per ogni fase di purificazione prima di aggiungere le perline per la ricerca guasti futuro (Tabella 2), se necessario.
I dati nella Figura 3A mostra i risultati del metodo TAP per CycT1: S e CDK9: F, analizzati mediante western blot. CDK9: F co-eluito con CycT1: S dalle perline STREP, ma non nel controllo negativo AP manca CycT1: S, che indica che CDK9: F e CycT1: S formano un complesso proteina-proteina. Come previsto, entrambe le proteine sono state rilevate nel eluizione FLAG, che ha confermato ulteriormente la formazione del complesso. Figura 3B mostra la resuLTS del metodo reciproco TAP, dove sono stati scambiati i tag epitopo della due proteine (CDK9: S e CycT1: F), e analizzati mediante Western Blot.
Figure 3C e 3D mostrano i risultati del TAP e TAP reciproca analizzato mediante colorazione argento rispettivamente. Figura 3C corsia 2 ha mostrato che CDK9: F co-eluito con CycT1: S al largo delle perline STREP, ma non dal AP di controllo (corsia 1), indicando così che CDK9: F e CycT1: S formato un complesso proteina-proteina. Nella successiva eluizione FLAG, come mostrato in corsia 4, CycT1: S co-eluito con CDK9: F largo delle perline FLAG. Analogamente, Figura 3D mostrato che CycT1: F co-eluito con CDK9: S off delle perline STREP, ma non dal AP controllo e che il complesso proteina-proteina era efficiente recuperato dopo la seconda fase FLAG IP. Entrambe le macchine occidentali e le macchie d'argento hanno confermato che il protocollo TAP ha lavorato in modo efficiente per la purificatio n, l'isolamento e la caratterizzazione del complesso proteina di interesse.
Figura 1: Panoramica della strategia TAP Purificazione. Un semplice schema che descrive i passi di TAP. I plasmidi che codificano per la proteina di interesse sia con il tag epitopo STREP o FLAG sono co-trasfettato in cellule di mammifero. Dopo 48 h di induzione, le cellule sono raccolte e lisate. lisato cellulare solubile contenente la proteina di interesse insieme ad altre proteine sono caricati sul perline STREP per STREP AP. Le proteine che contengono sia il tag STREP o sono legati alla proteina STREP-tag attaccati alle perle sono poi eluiti. Le perle FLAG sono stati poi aggiunti nella eluizione STREP. Le proteine che contengono sia il tag bandiera o sono legati alla proteina FLAG-tag attaccati alle perle sono poi eluiti. Eluizioni potrebbe essere analizzato con i metodi indicati.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica della strategia TAP. Un protocollo dettagliato di TAP. Vedere il testo per i dettagli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esempio di analisi Step-by-step di TAP Purificazione. (A) Analisi Western Blot di TAP (CycT1: S e CDK9: F). (B) Analisi Western Blot di TAP reciproca (CDK9: S e CycT1: F). indietrom 1 ml di tutto lisato cellulare, 5 microlitri (0,2%) sono stati caricati come "STREP AP Input." 975 ml di rimanere tutto il lisato cellulare è stato aggiunto al perline STREP per STREP AP e 100 ml di "STREP AP eluizione" è stato raccolto. Da questo, 5 microlitri (2%) è stato caricato. 80 ml di "STREP AP eluizione" è stato aggiunto al perline Flag per IP bandiera e 30 ml di "IP eluizione FLAG" è stato raccolto. Dalle 30 pl di "IP eluizione FLAG", 7 ml (23,3%) è stato caricato. (C) analisi macchia d'argento di TAP (CycT1: S e CDK9: F). Analisi (D) Silver macchia di TAP reciproca (CDK9: S e CycT1: F). 5 ml (2%) di "STREP AP eluizione" e 7 ml (23,3%) di "IP eluizione flag" sono stati caricati. Gli asterischi indicano impurità co-eluiti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Proteina | residui | Vettore | Etichetta | siti clonazione | Riferimento |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - EcoRI | McNamara et al. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | BANDIERA | HindIII - EcoRI | Questo articolo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - XhoI | Questo articolo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FLAG | HindIII - XhoI | McNamara et al. 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | STREP-FLAG | BamHI - XhoI | Questo articolo |
Tabella 1: I plasmidi utilizzati in questo studio. CycT1 e CDK9 stati legati nel pcDNA / 4TO-STREP e vettori plasmidici pcDNA / 4TO-FLAG. Questi costrutti sono state trasformate in cellule competenti DH5α e placcato su piastre LB-ampicillina. Le colonie sono state selezionate, coltivate e proiettati. Successo cloni legatura sono stati verificati mediante sequenziamento Sanger e la combinazione della restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio. Per CycT1 abbiamo usato una versione più breve (1 - 708) invece del full-length (1 - 726) perché gli ultimi 18 residui contengono una sequenza PEST (una sequenza peptidica riccoprolina, acido glutammico, serina, treonina e), che agisce come un peptide segnale per la degradazione proteica 20. CDK9 era full-length. La sequenza del tag tandem STREP è il seguente: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. La sequenza del tag FLAG tandem è il seguente: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabella 2: risoluzione dei problemi Tabella. Prima di iniziare con la risoluzione dei problemi, doppio controllo per assicurarsi che ogni passo essenziale è stato seguito. Alcune fasi di questo protocollo richiedono più l'ottimizzazione di altri a conseguire il risultato previsto. Clicca qui per scaricare il file.
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Discussion
Il protocollo qui descritto per l'espressione e l'isolamento di complessi proteici da cellule eucariotiche non è limitata alla caratterizzazione biochimica di tali complessi molecolari, ma può anche essere utilizzato per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che potrebbe regolare la loro funzione. L'utilizzo di tag di affinità non si limita a ciò che è menzionato in questo protocollo; ma la nostra esperienza suggerisce che l'utilizzo STREP come primo passo AP migliora significativamente la resa del complesso proteina-proteina finale. Entrambi i punti di legame e di eluizione da e per le perle STREP sono estremamente efficienti rispetto ad altri tag epitopi (ad esempio, la bandiera). Inoltre, in teoria, TAP potrebbe essere applicata ad altre proteine o domini con alcune ottimizzazioni minori, come condizioni di buffer, il numero di piastre per esperimento (per entrambi i sistemi esprimono transienti e stabili), ecc Inoltre, il metodo TAP può anche essere applicata to altre linee cellulari se specifiche proteine complessi richiedono un sistema speciale per la loro funzione o il loro interazioni con i fattori unici. Per facilitare la risoluzione dei problemi, si raccomanda che i campioni di ingresso e FT entrambi essere salvati (Tabella 2). Quando le bande proteiche previsti non possono essere visualizzati nel eluizione, i campioni FT possono essere utilizzati per risolvere l'esperimento e determinare se il campione aveva legato e / o eluito off delle perline.
Un TAP successo è strettamente dipendente alti livelli di espressione della proteina e recupero. Così, i ricercatori dovrebbero ottimizzare la quantità di materiale di partenza, caso per caso. Se trasfezione transiente viene usato per esprimere componenti proteiche, l'efficienza di trasfezione dovrebbe essere almeno del 70% prima di procedere alla seconda fase del TAP. Il metodo TAP reciproco (in cui gli epitopi sono scambiati tra le due esche) di solito aiuta a determinare quale strategia sperimentaledovrebbe essere utilizzato per ottenere la migliore purezza e resa. Di nuovo, questo dovrà essere esaminati caso per caso. È importante sottolineare che, eseguendo TAP reciproca conferma che il PPI è indipendente dal tag di affinità utilizzato.
Alcuni aspetti del metodo TAP presentati sono qui limitazioni. Ad esempio, l'iperespressione della bandierina e le proteine STREP-tag potrebbe generare artefatti per la stessa proteina ectopicamente espressa o dei loro interattori. Tag diversi epitopi possono influenzare i livelli di espressione della proteina, la conformazione delle proteine e / o localizzazione subcellulare. Oltre alla limitazione linea cellulare e l'efficienza di trasfezione, le dimensioni dei complessi da depurare potrebbe essere un problema. Questo metodo funziona bene per TAP complessi proteici multi-subunità. Dalla nostra esperienza, quattro componenti possono essere rilevate da macchia d'argento (dati non mostrati). Tuttavia, quando si utilizza componenti a due targhette, gli altri interattori non possono essere co-purificato a livelli stechiometrici identici. Perciò,per questo particolare obiettivo, si consiglia l'uso di linee cellulari che induce bassi livelli di espressione dei componenti complessi. Un'altra limitazione sarebbe la forza del PPI. Se le interazioni non sono sufficientemente stabili, alcuni componenti potrebbero essere persi durante le fasi di purificazione (soprattutto nella fase finale IP FLAG).
Il metodo TAP è stato precedentemente descritto e diversi tag epitopi diversi sono stati testati, validati, e confrontato 6. Tuttavia, il metodo TAP presentato in questo articolo è nuovo e fornisce una strategia semplice, efficace, affidabile e un'alternativa per studiare IPP, assieme complesso, e dedurre la composizione rete proteica e funzione. Rispetto ai metodi TAP precedenti, questa strategia TAP STREP-FLAG permette la rapida purificazione di complessi per un'ulteriore caratterizzazione senza una preventiva conoscenza della composizione complessa, attività o funzione; e senza la necessità di proteasi clivaggio (ad esempio, TEV) per eluizione della proteina (which può ridurre in modo significativo la resa di proteine). A causa della maggiore proteina complessa recupero, il metodo TAP STREP-FLAG permette anche l'identificazione robusta di proteine che si associano con il complesso proteina di interesse in cellule mediante analisi di spettrometria di massa tandem 10, 15. Successivamente, altri metodi, come la microscopia confocale, cromatografia ad esclusione sterica, e saggi di co-IP, possono anche essere utilizzati per convalidare i PPI. Infine, proponiamo che una versione alternativa del protocollo TAP potrebbe essere adattato per purificare e studiare l'assemblaggio di discrete complessi proteina-RNA, che tremendamente aiutare i ricercatori nel campo della biologia RNA.
In sintesi, vi presentiamo un metodo per purificare e caratterizzare i PPI in linee cellulari di mammifero. Proponiamo che questo metodo pone le basi per il futuro caratterizzazione e analisi funzionale di molti nuovi complessi proteici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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