Abstract
Rensingen av aktivt protein-protein og protein-nukleinsyre-komplekser er avgjørende for karakteriseringen av enzymatiske aktiviteter og de novo identifisering av nye underenheter og post-translasjonelle modifikasjoner. Bakterielle systemer tillater for ekspresjon og rensing av en rekke forskjellige enkle polypeptider og proteinkomplekser. Men dette systemet ikke aktivere rensing av protein subenheter som inneholder posttranslasjonelle modifikasjoner (f.eks fosforylering og acetylering), og identifisering av nye regulatoriske subenheter som bare er til stede / uttrykt i eukaryote system. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en roman, robust og effektiv tandem affinitet rensing (TAP) metode med bruk STREP- og flagg-merkede proteiner som forenkler rensing av protein komplekser med forbigående eller stabilt uttrykt epitop-merket proteiner fra eukaryote celler. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere protein kompleks funksjonalitet, for å oppdage posttranslasjonelle modifikasjoner på komplekse subenheter, og å identifisere nye regulatoriske komplekse komponenter ved massespektrometri. Spesielt, kan denne TAP metoden anvendes til å studere proteinkomplekser dannet av eukaryote eller sykdomsfremkallende (viral og bakteriell) komponentene, for således å gi et bredt spekter av eksperimentelle nedstrøms muligheter. Vi foreslår at forskere som arbeider med protein komplekser kan utnytte denne tilnærmingen på mange forskjellige måter.
Introduction
Protein-protein interaksjoner (PPI) er kritisk for nøyaktig regulering av biologiske prosesser 1, og videre studier på disse PPIer kan informere om deres funksjon 2. Flere metoder har blitt utviklet for å studere og karakteriseringen av PPIer så vel som for de novo identifisering av nye regulatoriske proteinkomponenter. I 1989 Stanley Fields og kolleger rapporterte gjær to-hybrid (Y2H) assay tre. Denne tilnærmingen gjør det mulig for objektiv og helhetlig identifisering av interactors (byttedyr) for en definert protein av interesse (agn) i Saccharomyces cerevisiae. I tillegg til den bemerkelsesverdige verktøy for å oppdage PPIer, kan Y2H analysen anvendes for å karakterisere protein parene i gjærceller, som avgrenser minimal samvirkende domener, og å identifisere mutasjoner som avskaffe slike interaksjoner. Ved å endre Y2H analysen, kan PPIs også bli studert i pattedyrcellerclass = "xref"> 4. Variasjoner av Y2H analysen (f.eks gjær tre-hybrid systemet) kan også brukes til å studere protein-RNA og protein liten organisk ligand interaksjoner på celler.
En annen mye brukt verktøy for å studere PPIs i en homolog system er co-immunoprecipitation (co-IP) assay 5. Ved å bruke et antistoff mot immunutfelle et protein av interesse, kan det ko-IP-analysen forskere til å overvåke PPIer i celler for forskjellige miljøforhold og eksperimentelle situasjoner. Bruken av epitop-merket proteiner (f.eks FLAG, Myc, STREP, og HA, blant andre) i affinitet rensing (AP) metoder har muliggjort isolering av proteiner fra komplekse proteinblandinger for flere nedstrøms analyser, blant annet western blot, sølvfarge og enzymatisk analyse. Imidlertid har ingen av disse tidligere fremgangsmåter muliggjøre isolering av store mengder av proteinkomplekser for ytterligere karakterisering inkludert in vitro enssays, oppdagelsen av regulatoriske subenheter av massespektrometri, og identifisering av posttranslasjonelle modifikasjoner. En forbedret versjon av AP metoden kalles tandem AP (TAP), som er en renseteknikk for å studere PPIer ved å lage et fusjonsprotein med to epitoper som er renset gjennom to påfølgende aksesspunkter 6, 7. I denne artikkelen presenterer vi en variasjon av den TAP metode for rensing av protein komplekser hvor to subenheter er merket med forskjellige epitoper og deretter renset gjennom to sekvensielle aksesspunkter (AP STREP fulgt av FLAG IP). Vi gir først en minimalistisk oversikt over TAP (figur 1), og deretter en detaljert beskrivelse av alle de eksperimentelle trinn (figur 2), slik at forskere kan bruke dem til deres protein kompleks av interesse.
For å demonstrere anvendeligheten av den TAP-metoden, valgte vi et godt karakterisert cyklin-CDK-kompleks (kalt PTEFB kinase), som består av regulerings subenheten cyclin T1 (CycT1) og en kinase (CDK9), og er involvert i regulering av transkripsjon av RNA polymerase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforylerer det C-terminale domene av Pol II og de tilhørende negative forlengelsesfaktorer, som avlaster transkripsjonen midlertidig stopping ved promotoren og derved letter transkripsjon forlengelse 11, 12, 13. Med dette kjent interaksjon i tankene, STREP-merket CycT1 og FLAG-merket CDK9 var over uttrykt i HEK293T celler. En gjensidig TAP eksperiment ble utført med STREP-merket CDK9 og FLAG-merket CycT1 å ytterligere bekrefte at proteinet interaksjonen er uavhengig av epitoper utnyttet. Celler ble oppsamlet og lysert 48 timer etter transfeksjon. Det oppløselige lysat ble renset ved TAP (STREP AP etterfulgt av FLAGIP). Inngangs- og rensede proteiner ble analysert ved hjelp av western blot og sølvfarging (fig 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating Cells
- En dag før transfeksjon, plate 3,5 x 10 6 HEK293T celler i 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) serum føtalt bovint (FBS) og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin (10000 U / ml lager) per 100 mm skål. Plate 3 - 5 100 mm retter per eksperiment / tilstand for å sikre tilstrekkelig protein utvinning.
MERK: antall plater må bestemmes for hvert forsøk / tilstand, noe som vil stole på ekspresjonsnivåene og løseligheten av proteinet kompleks av interesse. Alternativt, hvis i større målestokk rensing er nødvendig, cellelinjer kan tilpasses for å vokse i suspensjon i spinnerflasker 2, men denne metode vil ikke fungere for transiente transfeksjoner.
2. trans Celler eller Induksjon stabile cellelinjer
- Dagen etter, sjekke cellene under mikroskopet. Celler må være 70-80% konfluent før behEding.
- Transfektere cellene med en total blanding av 7 ug av plasmid-DNA og 21 pl av transfeksjon reagens pr 100 mm skål. Transfektere celler med en vektor som uttrykker GFP (tabell 1) som en kontroll for transfeksjonseffektiviteten.
MERK: Ved bruk av en HEK293-T-Rex eller lignende stabil cellelinje som induserer ekspresjonen av to eller flere komplekse underenheter som svar på doksycyklin 14, 15, vil den indus måtte bli tilsatt til cellene og inkubert i 48 timer. På samme måte vil en stabil cellelinje som induserer ekspresjon av GFP ved tilsetning av induseren også være nødvendig for validering. Gå videre til trinn 2.7. - Forbered transfeksjon blanding per 100 mm skål. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, blande 500 ul av usupplert DMEM med 7 ug av total plasmid DNA (svarende til to eller flere plasmider). I en separat mikrosentrifugerør, bland 500 mL av usupplerte DMEM with 21 pl av reagens transfeksjon. Gjenta for hver transfeksjon reaksjon.
- Pipetter transfeksjon reagensoppløsningen inn i plasmid-DNA-oppløsning (ikke blande løsninger i motsatt rekkefølge). Bland ved å pipettere minst 4 ganger.
- Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 - 15 min, men ikke lenger enn 15 min.
- Vippe platen for å skape et reservoar media og nøye pipette transfeksjon blandingen dråpevis på den indre side av platen uten å forstyrre cellene. Tilbake fatet til sin opprinnelige flate posisjon og virvle forsiktig for å fordele blandingen.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet cellekulturinkubator med 5% CO 2 (denne tilstanden blir heretter referert til som "vevsdyrkningsinkubator"). Sett på 5 timer etter transfeksjon (valgfritt).
3. Kontroll Transfeksjon eller induksjon Effektivitet
- På 24 timer etter transfeksjon, visualisere cellene under et influensaorescent mikroskop for å se etter transfeksjonseffektivitet (eller induksjon av kontroll HEK293T-Rex stabil cellelinje som uttrykker GFP). Inkuber i ytterligere 24 timer.
4. STREP Affinity Rensing (STREP AP)
- Samle cellene
- På 48 timer etter transfeksjon, fjerne media og tilsett 8 ml kald 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Pipettere opp og ned for å løsne cellene fra platen.
- Samle og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml rør og spinne cellene ned ved 800 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
- Fjern PBS supernatant. Gjenta spinne ned (800 xg i 1 minutt ved 4 ° C) for å fjerne eventuelle gjenværende PBS. Oppbevar cellepelleten ved -80 ° C for fremtidig bruk eller følge fremgangsmåten nedenfor for å fortsette protein rensing.
- Lysere cellene
- Resuspender cellepelletene ved anvendelse av 5 x cellepelleten volum (~ 250 ul per plate) av passiv Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor cocktail tablett, 5% volum / volum glycerol, og 1,0% NP-40) og overføre cellesuspensjonen til en 1,5 ml mikro tube.
- I korthet vortex suspensjonen og nutere i 30 minutter ved 4 ° C.
- Spinne ned cellesuspensjonen ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør de oppløselige lysatene til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og kast cellepelletene. Spare 10% av det endelige volum av det oppløselige lysat som "STREP AP Input". Oppbevar ved 4 ° C.
- Equilibrating strep perler
MERK: Bruk strep perler for første AP trinn! Komplekser trakk ned med streptokokk perler utvinne betydelig mer protein enn de som trakk ned med FLAG perler.- Ta ut (n x 40 mL) + n ul av 50% STREP vulst oppslemning (n = antall prøver) og spinne ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
MERK: Bruk wide-mouthed tips til pipettes perler. - Fjern supernatanten og tilsett 500 mL av PLB til perlene. Nutere den perler blandingen i 5 min ved 4 ° C. Spinn ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
- Gjenta for totalt 3 vasker. Resuspender perler i PLB til et sluttvolum på n x 40 ul.
- Legg 40 ul 50% STREP vulst oppslemning til hver cellelysat prøve og nutere i 2 timer ved 4 ° C.
- Ta ut (n x 40 mL) + n ul av 50% STREP vulst oppslemning (n = antall prøver) og spinne ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
- STREP AP
- Spinn ned løsningen ved 1500 xg i 2 min ved 4 ˚C.
- Fjern supernatanten og lagre som "STREP AP Gjennomstrømning (FT)" ved 4 ° C.
- Legg 500 mL av STREP AP vaskebuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glyserol og 0,2% NP-40) til kulene. Nutere den perler blandingen i 5 min ved 4 ° C og sentrifuger ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C. Kast supernatanten.
- Gjenta til totalt 4 vaskinger.
- Gjenta til totalt 4 vaskinger.
- Tilsett 500 ul vaskebuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, og 1 mM EDTA) og likevekt perlene ved å snu rørene. Spinne ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Eluere proteinet av interesse med 50 ul STREP elueringsbuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA og 2,5 mM desthiobiotin). Vortex ved 800 rpm i 15 minutter ved 4 ° C.
- Spinne ned perlene ved 1500 xg i 1 min ved 4 ° C. Samle supernatanten. Denne fraksjon tilsvarer "STREP AP Eluering" sample.
- Lagre perler fraksjon ved 4 ° C i en andre eluering, noe som kan gi opp til halvparten av den mengde protein som oppnås med den første eluering. Delmengde 10% av Strep AP Eluering for sølvfarging og / eller western blotting16.
- Equilibrating flagget perler
- Ta ut (nx 16 mL) + n fil av FLAG perler løsning (n = antall prøver) og spinne ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
MERK: Bruk bred åpning tips til pipettes perler. - Fjern supernatanten og tilsett 500 ul av FLAG vaskebuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 0,1% NP-40) til kulene. Spinn ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C. Gjenta for totalt 3 vasker.
- Resuspender perler i FLAG vaskebuffer til et endelig volum på 16 ul nx.
- Legg 16 mL av FLAG vulsten oppslemmingen til den gjenværende STREP AP eluering og nutere over natten ved 4 ° C.
- Ta ut (nx 16 mL) + n fil av FLAG perler løsning (n = antall prøver) og spinne ned ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C.
5. FLAG IP
- Spinn ned flagget perler oppheng i 1500 xg i 2 min ved 4 ° C. Lagre supernatanten og lagre som "FLAG IP Flow-through" (FT) ved 4 ° C.
- Legg 50081; l av FLAG vaskebuffer til oppløsningen. Nutere i 5 min ved 4 ° C og sentrifuger ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C. Gjenta til totalt 4 vaskinger og fjern supernatanten etter hver vask.
MERK: Før den fjerde vask, overføre protein-perler løsning til en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør å redusere bakgrunns. Dette trinn er viktig. - Fjern supernatanten fra sluttsentrifugeringen og tilsett 30 mL av FLAG vaskebuffer som inneholder 200 ng / ul FLAG peptid i perlene. Vortex ved 800 rpm i 2 timer ved 4 ° C.
- Spinne ned suspensjonen ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C. Høste supernatanten og oppbevares ved 4 ° C som "FLAG IP Elution."
MERK: elusjonstester prøvene kan bekreftes av sølvfarge og / eller western blot ved hjelp av standard protokoller 16, og er klar for videre protein analyser. Når du setter opp en western blot, kjøre alle de følgende prøver: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutipå, (4) FLAG IP FT, og (5) FLAG IP Elution. Volumene lastet må bestemmes for hvert forsøk. Alle innsamlede prøver og perler kan lagres ved 4 ° C i kort tid, og ved -80 ° C for langtidslagring. TAP-prøver kan analyseres ved hjelp av massespektrometri for å bekrefte identiteten til sine komponenter, for å identifisere nye post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), og / eller for å oppdage hvilken som helst nytt protein interaksjon med det rensede kompleks 2, 17. For dette formål, etter å ha kjørt en coomassie-gel eller sølvfarge, bånd kan skjæres ut fra gelen ved anvendelse av en ren skalpell. Flere gode anmeldelser som diskuterer massespektrometri metoder ble tidligere utgitt 18 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen viser vi anvendelsen av TAP metoden til den godt karakterisert CycT1-CDK9 kompleks (også kjent som P-TEFb kinase).
Plasmider som koder Cyclin T1-STREP (CycT1: S) og CDK9-FLAG (CDK9: F), eller CDK9-STREP (CDK9: S) og Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (tabell 1), ble transfektert inn HEK293T celler . Negative kontroller inkludert transfections med en tom vektor og CDK9: F eller CycT1: F plasmider (Tall 3A og B, henholdsvis). Proteinene ble uttrykt i 48 timer før cellene ble oppsamlet. Flere plater av celler ble anvendt for hvert forsøk (fem plater per prøve ble anvendt for dataene presentert i figur 3) for å øke proteinproduksjon og utvinning. Etter at cellene ble lysert i enkelt mikrosentrifugerør ble cellelysatene av den samme prøven sammen til en microcentrifuge rør før du legger strep perler. Ved å kombinere de proteinprøvene med en porsjon av perlene øker den endelige proteinkonsentrasjon, noe som kan forbedre proteingjenvinning fra proteiner som er vanskelig å uttrykke. Etter den første eluering, kan en andre eluering gjøres for å øke den totale proteininngangen for FLAG IP. Det er viktig å lagre inngang for hvert rensetrinn før tilsetning av kulene for fremtidig feilsøking (tabell 2), om nødvendig.
Dataene i Figur 3A viser resultatene av TAP fremgangsmåte for CycT1: S og CDK9: F, analysert ved hjelp av western blot. CDK9: F ko-eluert med CycT1: S fra Strep perlene, men ikke i den negative kontroll AP mangler CycT1: S, noe som indikerer at CDK9: F og CycT1: S danne et protein-proteinkompleks. Ventet, ble begge proteiner detektert i FLAG elueringen, noe som ytterligere bekrefter den kompleksdannelsen. Figur 3B viser results av den gjensidige TAP-metoden, der epitop kodene av de to proteinene ble byttet (CDK9: S og CycT1: F), og analysert ved western blot.
Figurene 3C og 3D viser resultatene av TAP og gjensidig TAP analysert ved hjelp av sølvfarging, respektivt. Figur 3C felt 2, viste at CDK9: F ko-eluert med CycT1: S ut av Strep perlene, men ikke fra styre AP (spor 1), noe som indikerer at CDK9: F og CycT1: S dannet en protein-proteinkompleks. I den etterfølgende FLAG elueringen, som vist i felt 4, CycT1: S ko-eluert med CDK9: F ut av flagget kulene. Tilsvarende Figur 3D viser at CycT1: F ko-eluert med CDK9: S ut av Strep perlene, men ikke fra styre AP, og at den protein-protein-komplekset var effektivt gjenvunnet etter den andre FLAG IP trinn. Både vestlige blotter og sølv flekker bekreftet at TAP protokollen jobbet effektivt for purificatio n, isolering og karakterisering av protein-komplekset av interesse.
Figur 1: Oversikt over TAP Rensing Strategy. En enkel ordning som beskriver trinnene TAP. Plasmider som koder for proteinet av interesse med enten Strep eller FLAG-epitop tag er ko-transfektert inn i pattedyrceller. Etter 48 timers induksjon, ble cellene samlet og lysert. Løselig cellelysat inneholdende protein av interesse sammen med andre proteiner som er lastet inn Strep perler for strep AP. Proteiner som enten inneholder Strep-tag eller er bundet til Strep-merkede proteiner bundet til perlene blir deretter eluert. Flagget perler ble deretter lagt inn i STREP eluering. Proteiner som enten inneholder FLAG tag eller er bundet til den FLAG-merkede proteiner bundet til perlene blir deretter eluert. Elueringer kunne analyseres ved de angitte metoder.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av TAP Strategy. En detaljert protokoll for TAP. Se teksten for detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel på trinn-for-trinn Analyse av TAP Rensing. (A) Western blot analyse av TAP (CycT1: S og CDK9: F). (B) Western blot-analyse av gjensidig TAP (CDK9: S og CycT1: F). from 1 ml av hel-celle-lysat, 5 pl (0,2%) ble anbragt som "STREP AP Input". 975 mL av gjenværende hele cellelysat ble lagt til strep perler for STREP AP og 100 ul "STREP AP Elueringen" ble samlet inn. Fra denne, 5 pl (2%) ble lastet. 80 mL av "STREP AP Elueringen" ble lagt til FLAG perler for FLAG IP og 30 ul "FLAG IP Elueringen" ble samlet inn. Fra 30 ul "FLAG IP Elueringen", ble 7 mL (23,3%) lagt inn. (C) Silver flekk analyse av TAP (CycT1: S og CDK9: F). (D) Silver stain analyse av gjensidig TAP (CDK9: S og CycT1: F). 5 ul (2%) av "STREP AP Eluering" og 7 mL (23,3%) av "FLAG IP Eluering" ble lastet. Stjernene indikerer co-eluert urenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein | rester | Vector | stikkord | kloningsseter | Henvisning |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | STREP | Hindi - EcoRI | McNamara et al. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | FLAGG | Hindi - EcoRI | denne artikkelen |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | STREP | Hindi - XhoI | denne artikkelen |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FLAG | Hindi - XhoI | McNamara et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | STREP-FLAG | BamHI - XhoI | denne artikkelen |
Tabell 1: Plasmider anvendt i denne studien. CycT1 og CDK9 ble ligert inn i pcDNA / 4TO-STREP og pcDNA / 4TO-FLAG plasmidvektorer. Disse konstruksjonene ble transformert inn i DH5a kompetente celler og sådd ut på LB-ampicillinplater. Kolonier ble valgt, dyrket, og vist. Vellykket ligerte kloner ble verifisert ved Sanger-sekvensering og kombinasjonen av restriksjonsspalting og agarosegel-elektroforese. For CycT1 det benyttet en kortere versjon (1 - 708) i stedet for full-lengde (1-726) fordi de siste 18 rester inneholder en sekvens PEST (en peptidsekvens rik iprolin, glutaminsyre, serin, treonin og), som virker som et signalpeptid for proteindegradering 20. CDK9 var full-lengde. Sekvensen av tandem STREP taggen er som følger: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. Sekvensen av tandem FLAG tag er som følger: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabell 2: Feilsøking tabellen. Før du begynner med feilsøking, for å dobbeltsjekke sørge for at hver viktig skritt har blitt fulgt. Visse trinn i denne protokollen krever mer optimalisering enn andre for å oppnå forventet resultat. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her for ekspresjon og isolering av proteinkomplekser fra eukaryote celler er ikke begrenset til den biokjemiske karakteriseringen av slike molekylære sammenstillinger, men kan også benyttes for identifisering av nye interactors og post-translasjonelle modifikasjoner som kunne regulere deres funksjon. Utnyttelsen av tilhørighet koder er ikke begrenset til det som er nevnt i denne protokollen; men vår erfaring tyder på at bruk STREP som den første AP trinnet forbedrer utbyttet av det endelige protein-proteinkompleks betydelig. Både bindende og eluering skritt til og fra strep perlene er ekstremt effektiv sammenlignet med andre epitop tags (f.eks flagg). I tillegg, i teorien, TAP kan anvendes på andre proteiner eller domener med noen mindre optimaliseringer, slik som bufferbetingelser, antall plater pr eksperiment (for både forbigående og stabilt uttrykte-systemer), etc. Videre kan den TAP-metoden også bli anvendt to andre cellelinjer hvis spesifikke protein komplekser krever et spesielt system for deres funksjon eller deres interaksjon med unike faktorer. For å lette feilsøking, er det sterkt anbefalt at inn- og FT prøver begge bli frelst (tabell 2). Når de forventede proteinbåndene ikke kan visualiseres i elueringen, kan FT prøvene brukes for å feilsøke eksperimentet og avgjøre hvorvidt prøven hadde bundet til og / eller eluert ut av kulene.
En vellykket TAP er strengt avhengig av høye nivåer av proteinekspresjon og utvinning. Dermed forskere ville ha for å optimalisere mengden av utgangsmaterialet fra sak til sak. Hvis transient transfeksjon brukes for å uttrykke protein-komponenter, bør transfeksjonseffektiviteten være minst 70% før fortsetter med det andre trinn i den aktuelle TAP. Den gjensidige TAP-metoden (der epitoper byttet mellom de to agn) hjelper vanligvis å bestemme hvilke eksperimentell strategibør benyttes for å oppnå best mulig renhet og utbytte. Igjen, vil dette måtte bli undersøkt på en sak-til-sak basis. Viktigere, utfører gjensidig TAP bekrefter også at PPI er uavhengig av tilhørighet tag brukt.
Noen aspekter av den aktuelle TAP fremgangsmåten presentert her har begrensninger. For eksempel kan overekspresjon den FLAG- og streptokokk-merket proteiner generere gjenstander for ectopically uttrykte protein i seg selv eller sine interactors. Ulike epitop koder kan påvirke protein uttrykk nivåer, protein konformasjon og / eller subcellulære lokalisering. I tillegg til cellelinjen og transfeksjonseffektiviteten begrensning, størrelsen av kompleksene som skal renses kan være et problem. Dette TAP metoden fungerer bra for multi-subenheten protein komplekser. Fra vår erfaring, kan fire komponenter påvises ved sølvfarging (data ikke vist). Men når du bruker to-merkede komponenter, de andre interactors kan ikke være co-renset på samme støkiometriske nivåer. Derfor,for det aktuelle målet, er anvendelsen av cellelinjer som induserer lavere nivåer av ekspresjon av de komplekse komponenter rådet. En annen begrensning ville være styrken av PPI. Dersom vekselvirkninger er ikke stabile nok, kan enkelte komponenter går tapt i løpet av rensetrinnene (særlig i det siste trinn FLAG IP).
TAP Metoden ble beskrevet tidligere, og flere forskjellige epitop koder ble testet, godkjent, og sammenlignet 6. Men TAP metoden som presenteres i denne artikkelen er romanen og gir en enkel, effektiv og robust, og alternativ strategi for å studere PPIs, komplekse montering, og antyde protein nettverk sammensetning og funksjon. Sammenlignet med tidligere TAP metoder, gjør dette STREP-FLAG TAP strategi for rask rensing av komplekser for videre karakterisering uten forutgående kunnskap om kompleks sammensetning, aktivitet, eller funksjon; og uten behov for proteasespaltningsstillingen (f.eks TEV) for protein eluering (which kan betydelig redusere protein utbytte). På grunn av den økte proteinkomplekset utvinning, gjør at STREP-FLAG TAP metode også for den robuste identifisering av proteiner som assosierer med protein kompleks av interesse i cellene gjennom tandem massespektrometri analyse 10, 15. Deretter ble andre metoder, i likhet med konfokal mikroskopi, størrelseseksklusjons-kromatografi, og co-IP-assays, kan også bli anvendt for å validere PPIer. Til slutt foreslår at en alternativ versjon av den TAP-protokollen kan tilpasses for å rense og studere montering av diskrete protein-RNA kompleksene, noe som vil bidra til å enormt forskere på området RNA biologi.
I sammendraget presenterer vi en metode for å rense og karakter PPIs i pattedyrcellelinjer. Vi foreslår at denne metoden legger grunnlaget for fremtiden karakterisering og funksjonell analyse av mange nye protein komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
