Abstract
A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.
Introduction
Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos 1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função 2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio 3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cerevisiae. Para além da sua utilidade notável para a descoberta de IPP, o ensaio Y2H pode ser utilizado para caracterizar pares de proteínas em células de levedura, que define o mínimo de domínios interactuantes, e a identificação de mutações que abolem essas interacções. Ao modificar o ensaio Y2H, IPP também pode ser estudado em células de mamíferoclass = "xref"> 4. Variações do ensaio Y2H (por exemplo, sistema de levedura de três híbridos) também pode ser aplicada ao estudo de proteínas e de ARN-ligante orgânico proteína-pequeno em células.
Outra ferramenta utilizada para estudar os IPP num sistema homólogo é o ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) 5. Ao utilizar um anticorpo para imunoprecipitar uma proteína de interesse, o ensaio de co-IP permite aos investigadores monitorar IPP em células para diferentes condições ambientais e experimentais situações. A utilização de proteínas marcadas no epitopo (por exemplo, FLAG, Myc, estreptococos e HA, entre outros), a purificação por afinidade (AP) métodos facilitou o isolamento de proteínas a partir de misturas complexas de proteínas para vários ensaios a jusante, incluindo Western blot, coloração de prata , e análise enzimática. No entanto, nenhuma destas abordagens anteriores permitem o isolamento de grandes quantidades de complexos de proteínas para caracterização adicional in vitro incluindo umssays, descoberta de subunidades reguladoras por espectrometria de massa, e a identificação de modificações pós-traducionais. Uma versão melhorada do método de AP AP é chamado tandem (TAP), que é uma técnica de purificação para o estudo de IPP através da criação de uma proteína de fusão com dois epitopos que se purifica por meio de dois pontos de acesso subsequentes 6, 7. Neste artigo, apresentamos uma variação do método TAP para complexos de proteína de purificação em que duas subunidades são marcadas com epítopos diferentes e depois purificado através de dois APs sequenciais (STREP AP seguido por FLAG IP). Em primeiro lugar, proporcionar uma visão minimalista da TAP (Figura 1) e, em seguida, uma descrição detalhada de todas as etapas experimentais (Figura 2), de modo que os investigadores possam aplicá-las a seu complexo de proteína de interesse.
Para demonstrar a aplicabilidade do método de TAP, nós escolhemos um bem caracterizado ciclina-CDK complexa (referido como PTEFB quinase), que é composta da subunidade reguladora da ciclina T1 (CycT1) e uma cinase (CDK9), e está envolvido na regulação da transcrição por ARN-polimerase II (pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila o domínio C-terminal de pol II e os seus associados factores de alongamento negativos, o que alivia a pausa da transcrição no promotor e facilita assim a transcrição de alongamento 11, 12, 13. Com essa interação conhecida em mente, STREP-marcado CycT1 e CDK9 marcado com FLAG foram mais expressos em células HEK293T. Uma experiência recíproca TAP foi realizada com CDK9 marcaram-STREP e marcado com FLAG CycT1 para validar ainda mais que a interacção da proteína é independente dos epítopos utilizados. As células foram recolhidas e lisadas 48 h após a transfecção. O ligado solúvel foi purificado por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada e proteínas purificadas foram analisadas por Western blot e por coloração com prata (Figura 3).
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Protocol
1. Células chapeamento
- Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente.
NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai contar com os níveis de expressão e a solubilidade do complexo proteína de interesse. Alternativamente, se a purificação é necessária maior escala, as linhas celulares podem ser adaptadas para crescer em suspensão em frascos rotativos de 2, mas este método não funciona para transfecções transientes.
2. Indução de transfecção de células ou linhas celulares estáveis
- No dia seguinte, verifique as células ao microscópio. As células devem ser 70 - 80% confluentes antes de proceeding.
- Transfectar as células com uma mistura total de 7 ug de ADN de plasmídeo e 21 uL de reagente de transfecção por placa de 100 mm. Transfectar as células com um vector que expressa GFP (Tabela 1) como um controlo para a eficiência da transfecção.
NOTA: Se for utilizada uma linha celular estável semelhante HEK293-T-REX ou que induz a expressão de dois ou mais complexos subunidades em resposta à doxiciclina 14, 15, o indutor terá de ser adicionado às células e incubado durante 48 h. Do mesmo modo, uma linha celular estável que induz a expressão de GFP após a adição do indutor também seria necessária para fins de validação. Avance para o passo 2.7. - Preparar a mistura de transfecção por placa de 100 mm. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 500 ul de DMEM suplementada com 7 ug de ADN plasmídeo total (correspondendo a dois ou mais plasmídeos). Num tubo de microcentrífuga separado, misturar 500 ul de DMEM sem suplementos with 21 ul de reagente de transfecção. Repita para cada reacção de transfecção.
- Pipetar a solução de reagente de transfecção para a solução de DNA de plasmídeo (não misturar soluções na ordem inversa). Misturar por pipetagem de pelo menos 4 vezes.
- Incubar esta mistura à temperatura ambiente durante 10 - 15 minutos, mas não mais do que 15 min.
- Inclinar a placa para criar um reservatório de meios de comunicação e cuidadosamente pipetar a mistura de transfecção gota a gota, sobre o lado interior da placa, sem perturbar as células. Devolver o prato à sua posição original plana e homogeneizar suavemente para distribuir a mistura.
- Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de célula humidif içada com 5% de CO 2 (esta condição é a seguir referido como "tecido incubadora de cultura"). Substitua a mídia 5 horas após a transfecção (opcional).
3. A transfecção corrente ou Eficiência Indução
- Às 24 h pós-transfecção, visualizar as células sob uma gripemicroscópio orescent para verificar a eficiência de transfecção (ou indução de linha de células estável controle HEK293T-Rex expressando GFP). Incubar por mais 24 horas.
4. Purificação de Afinidade STREP (STREP AP)
- Recolher as células
- Em 48 horas após a transfecção, remova a mídia e adicionar 8 ml de solução salina 1x frio fosfato tamponada (PBS). Pipeta-se para baixo e para separar as células a partir da placa.
- Recolha e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a células para baixo a 800 * g durante 4 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante de PBS. Repetir a rotação para baixo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar qualquer PBS residual. Armazenar o sedimento de células a -80 ° C para uso futuro ou siga o procedimento a seguir para continuar a purificação de proteínas.
- Lisar as células
- Ressuspender as peletes de células utilizando 5 x o volume de sedimento de células (~ 250 mL por placa) de Passive Lysis Buffer(PLB: Tris-HCl 20 pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, protease de cocktail inibidor de comprimido, 5% v / v de glicerol, e 1,0% de NP-40) e transferir a suspensão de células para uma 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Resumidamente vortex a suspensão e nutar durante 30 min a 4 ° C.
- Girar a suspensão de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transfira os lisados solúveis para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e descartar os sedimentos celulares. Guardar a 10% do volume final do lisado solúvel como "entrada STREP AP." Armazenar a 4 ° C.
- Equilibrando as contas STREP
NOTA: Use STREP esferas para o primeiro passo AP! Complexos puxado para baixo com contas STREP recuperar significativamente mais proteína do que as puxou para baixo com contas de bandeira.- Retire (N × 40 ul) + N ul da suspensão STREP talão 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
NOTA: Use de toda a mdicas outhed a esferas de pipeta. - Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de PLB às pérolas. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- Repetir para um total de 3 lavagens. Ressuspender as esferas em PLB para um volume final de 40 ul N ×.
- Adicionar 40 ul de 50% de pasta STREP talão para cada amostra de ligado celular e nutar durante 2 horas a 4 ° C.
- Retire (N × 40 ul) + N ul da suspensão STREP talão 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- STREP AP
- Spin down solução a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e armazenar como "STREP-AP por meio de fluxo (FT)" a 4 ° C.
- Adicionar 500 ul de Tampão de Lavagem STREP AP I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, 5% de glicerol e 0,2% de NP-40) para os grânulos. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
- Repetir para um total de 4 lavagens.
- Repetir para um total de 4 lavagens.
- Adicionar 500 ul de tampão de lavagem II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, e EDTA 1 mM) e equilibrar as contas por inversão dos tubos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Eluir a proteína de interesse com 50 ul de tampão de eluição STREP (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM e). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C.
- Girar as esferas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante. Esta fracção corresponde à amostra "A eluição STREP AP".
- Guardar a fracção de esferas, a 4 ° C durante uma segunda eluição, que pode produzir-se a metade da quantidade de proteína obtida com a primeira eluição. Alíquota de 10% do AP STREP eluição por coloração com prata e / ou transferência de western16.
- Equilibrando as contas BANDEIRA
- Retire (nx 16 ul) + n ul de solução de esferas de FLAG (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
NOTA: Use dicas de boca larga a contas pipeta. - Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de tampão de lavagem FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, e 0,1% de NP-40) para os grânulos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 3 lavagens.
- Ressuspender as pérolas em tampão de lavagem FLAG para um volume final de 16 ul NX.
- Adicionar 16 ul da suspensão FLAG grânulo para o restante eluição STREP AP e durante a noite a 4 ° nutar C.
- Retire (nx 16 ul) + n ul de solução de esferas de FLAG (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C.
5. FLAG IP
- Spin down a suspensão esferas BANDEIRA a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante e armazenar como a "bandeira IP Flow-through" (FT) a 4 ° C.
- Adicionar 50081; l de tampão de lavagem FLAG para a solução. Nutar durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 4 lavagens e remover o sobrenadante depois de cada lavagem.
NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de proteína de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo. Este passo é essencial. - Retirar o sobrenadante do centrifugação final e adicionar 30 uL de tampão de lavagem FLAG contendo 200 ng / mL de péptido FLAG nas pérolas. Vortex a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C.
- Girar a suspensão a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Colher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C como o "BANDEIRA IP eluição."
NOTA: As amostras de eluição pode ser confirmada por coloração de prata e / ou transferência de Western utilizando protocolos padrão de 16, e está pronto para mais ensaios de proteína. Ao configurar um western blot, execute todas as seguintes amostras: (1) STREP AP entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) BANDEIRA IP FT, e (5) BANDEIRA IP eluição. Volumes carregados terá de ser determinado para cada experimento. Todas as amostras recolhidas e contas podem ser armazenadas a 4 ° C para armazenagem a curto prazo e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Amostras de TAP podem ser analisados por espectrometria de massa para verificar a identidade dos seus componentes, para identificar novas modificações pós-traducionais (PTMs), e / ou para descobrir qualquer interacção nova proteína com o complexo purificado 2, 17. Para este efeito, após a execução de um gel de mancha de Coomassie ou prata, as bandas podem ser excisadas a partir do gel utilizando um bisturi limpa. Vários excelentes comentários que discutem métodos de espectrometria de massa foram publicados anteriormente 18, 19.
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Representative Results
Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase).
Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9: F ou CycT1: plasmídeos F (Figuras 3A e B, respectivamente). As proteínas foram expressas durante 48 horas antes de as células foram recolhidas. Várias placas de células foram utilizados por experiência (cinco placas por amostra foram usadas para os dados apresentados na Figura 3) para aumentar a produção e a recuperação de proteína. Depois as células foram lisadas em tubos de microcentrífuga individuais, os lisados celulares da mesma amostra foram combinados em uma microcentrifUGE tubo antes de adicionar as contas de STREP. Combinando as amostras de proteína com uma porção dos grânulos aumenta a concentração final de proteína, que pode melhorar a recuperação de proteínas a partir de proteínas que são difíceis de expressar. Após a eluição inicial, uma segunda eluição pode ser feito de modo a aumentar a entrada de proteína total para o PI FLAG. É importante para salvar a entrada de cada passo de purificação antes de adicionar as contas na solução de problemas futuro (Tabela 2), se necessário.
Os dados da Figura 3A mostra os resultados do método para TAP CycT1: S e CDK9: F, analisado por western blot. CDK9: F co-eluiu com CycT1: S a partir das pérolas STREP, mas não no controlo negativo a que falta AP CycT1: S, indicando que CDK9: F e CycT1: S formar um complexo proteína-proteína. Como era de esperar, ambas as proteínas foram detectadas na eluição bandeira, que confirmou adicionalmente a formação de complexos. A Figura 3B mostra o resuLTS do método recíproco TAP, onde os marcadores de epitopo das duas proteínas foram trocados (CDK9: S e CycT1: F), e analisados por Western blot.
As Figuras 3C e 3D mostram os resultados da torneira e da TAP recíproco analisados por coloração com prata, respectivamente. Figura 3C pista 2 mostrou que CDK9: F co-eluiu com CycT1: S fora dos grânulos STREP, mas não a partir do AP controlo (pista 1), indicando assim que CDK9: F e CycT1: S formado um complexo proteína-proteína. Na eluição subsequente FLAG, como se mostra na pista 4, CycT1: S co-eluiu com CDK9: F fora dos grânulos FLAG. Da mesma forma, a Figura 3D mostrou que CycT1: F co-eluiu com CDK9: S fora dos grânulos STREP, mas não a partir do AP controlo, e que o complexo proteína-proteína foi eficientemente recuperado após o segundo passo de IP FLAG. Ambos os borrões ocidentais e manchas de prata confirmou que o protocolo TAP trabalhou de maneira eficiente para o purificatio N, isolamento e caracterização do complexo proteína de interesse.
Figura 1: Visão geral da Estratégia TAP Purificação. Um esquema simples que descreve os passos de TAP. Os plasmídeos que codificam para a proteína de interesse, quer com o STREP ou FLAG tag de epitopo são co-transfectados em células de mamíferos. Após 48 horas de indução, as células são recolhidas e lisadas. ligado celular solúvel contendo a proteína de interesse juntamente com outras proteínas são carregadas em grânulos STREP para STREP AP. As proteínas que não contêm a etiqueta STREP ou são ligadas à proteína STREP-etiquetado ligado às pérolas são então eluídos. Os grânulos foram então adicionados FLAG na eluição STREP. As proteínas que não contêm o marcador FLAG ou são ligadas à proteína FLAG-tag ligada às pérolas são então eluídos. Eluições poderia ser analisados pelos métodos indicados.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática da estratégia da TAP. Um protocolo detalhado da TAP. Veja o texto para mais detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de Análise Passo-a-passo de purificação TAP. (A) Análise Western blot da TAP (CycT1: S e CDK9: F). (B) Análise Western blot da TAP recíproca (CDK9: S e CycT1: F). from 1 ml de lisado celular inteiro, 5 ul (0,2%) foi carregado como "STREP AP entrada." 975 ul de lisado de células inteiras remanescente foi adicionado a esferas STREP para STREP AP e 100 ul de "STREP AP A eluição" foram recolhidos. A partir deste, 5 ul (2%) foi carregado. 80 ul da "STREP AP eluição" foi adicionado a contas Sinalizar para IP FLAG e 30 ul de "BANDEIRA IP eluição" foram recolhidos. A partir dos 30 ul de "eluição FLAG IP", 7 ul (23,3%) foi carregado. (C) Análise de mancha de prata da TAP (CycT1: S e CDK9: F). Análise (D) Silver mancha da TAP recíproca (CDK9: S e CycT1: F). 5 ul (2%) do "STREP AP A eluição" e 7 ul (23,3%) de "eluição de IP FLAG" foi carregado. Os asteriscos indicam as impurezas co-eluídos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Proteína | resíduos | Vetor | etiqueta | locais de clonagem | Referência |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - EcoRI | McNamara et ai. De 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4TO | BANDEIRA | HindIII - EcoRI | Este artigo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | STREP | HindIII - XhoI | Este artigo |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4TO | FLAG | HindIII - XhoI | McNamara et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4TO | STREP-FLAG | BamHI - XhoI | Este artigo |
Tabela 1: Os plasmídeos usados neste estudo. CycT1 e CDK9 foram ligados ao pcDNA vectores plasmídicos / 4TO-FLAG pcDNA / 4TO-STREP e. Estas construções foram transformados em células DH5a competentes e plaqueadas em placas de LB-ampicilina. Colónias foram selecionados, crescido, e rastreados. Os clones com sucesso ligados foram verificados por sequenciação de Sanger e a combinação da digestão de restrição e electroforese em gel de agarose. Para CycT1 foi utilizada uma versão mais curta (1-708), em vez de o de comprimento total (1-726) porque os últimos 18 resíduos contêm uma sequência PEST (uma sequência de péptido rico emprolina, ácido glutâmico, serina, treonina e), que funciona como um péptido de sinal para a degradação da proteína de 20. CDK9 estava cheio de comprimento. A sequência do marcador em tandem STREP é como se segue: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. A sequência do marcador FLAG conjunto é como se segue: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabela 2: Solução de problemas Tabela. Antes de iniciar a solução de problemas, verifique para certificar-se de que cada passo essencial tem sido seguido. Certas etapas neste protocolo exigir mais de otimização do que outros para atingir o resultado esperado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
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Discussion
O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta significativamente o rendimento do complexo final de proteína-proteína. Ambos os passos de ligação e eluição de e para as contas STREP são extremamente eficientes em comparação com outros marcadores de epitopo (por exemplo, Bandeira). Além disso, em teoria, a TAP pode ser aplicado a outras proteínas ou domínios com algumas optimizações menores, tais como condições de tampão, o número de placas por experiência (para ambos os sistemas que expressam transientes e estáveis), etc. Para além disso, o método também pode ser TAP Aplicada to outras linhas celulares se complexos de proteínas específicas requerem um sistema especial para a sua função ou suas interações com fatores únicos. Para facilitar a solução de problemas, é altamente recomendado que as amostras de entrada e FT ambos ser salvos (Tabela 2). Quando as bandas de proteína esperadas não pode ser visualizado na eluição, as amostras FT pode ser utilizado para resolver o experimento e determinar se ou não a amostra tinha ligado a e / ou eluído das esferas.
A TAP sucesso é estritamente dependente altos níveis de expressão da proteína e recuperação. Assim, os investigadores o de optimizar a quantidade de material de partida, numa base caso-a-caso. Se transfecção transiente é utilizada para expressar a proteína componentes, a eficiência da transfecção deve ser de pelo menos 70%, antes de prosseguir com o segundo passo da torneira. O método TAP recíproca (em que os epitopos são trocados entre as duas iscas) geralmente ajuda a determinar qual estratégia experimentaldeve ser utilizado para obter a melhor pureza e rendimento. Mais uma vez, esta terá de ser investigada, numa base caso-a-caso. Importante, realizando TAP recíproca também confirma que o PPI é independente da marca de afinidade utilizada.
Alguns aspectos do método TAP aqui apresentados têm limitações. Por exemplo, superexpressão do FLAG- e proteínas marcadas no STREP poderia gerar artefatos para a própria proteína ectopicamente expressa ou seus interagentes. Diferentes marcadores de epitopo pode afetar os níveis de expressão de proteína, conformação da proteína e / ou localização subcelular. Além disso a linha de células e a eficiência de transfecção limitação, o tamanho dos complexos a ser purificado pode ser um problema. Este método funciona bem para TAP complexos de proteína de múltiplas subunidades. A partir da nossa experiência, quatro componentes podem ser detectadas por coloração com prata (dados não mostrados). No entanto, quando se utiliza componentes de dois marcados, os outros interactores não pode ser co-purificado a níveis estequiométricos idênticos. Assim sendo,para este objectivo, nomeadamente, a utilização de linhas de células que induz níveis mais baixos de expressão dos componentes do complexo é aconselhada. Outra limitação seria a força do PPI. Se as interacções não são suficientemente estáveis, alguns componentes podem ser perdidos durante os passos de purificação (especialmente no passo de IP FLAG final).
O método TAP foi descrito anteriormente e vários marcadores de epitopo diferentes foram testadas, validadas e comparadas 6. No entanto, o método TAP apresentada neste artigo é novo e proporciona uma estratégia fácil, eficiente e robusta, e alternativa para estudar IPP, montagem complexa, e inferir rede composição e função das proteínas. Em comparação com os métodos anteriores TAP, esta estratégia TAP STREP-FLAG permite a rápida purificação de complexos para caracterização adicional, sem o conhecimento prévio do complexo composição, a actividade ou função; e sem a necessidade de clivagem de protease (por exemplo, TEV) para a eluição da proteína (WHich pode diminuir significativamente a produção de proteína). Devido ao aumento da recuperação de complexo de proteína, o método TAP STREP-FLAG permite também a identificação robusto de proteínas que se associam com o complexo proteína de interesse em células por meio de análise de espectrometria de massa em tandem 10, 15. Subsequentemente, outros métodos, como a microscopia confocal, cromatografia de exclusão de tamanho, e ensaios de co-IP, podem também ser utilizados para validar os PPIs. Finalmente, propõe-se que uma versão alternativa do protocolo TAP pode ser adaptado para purificar e estudar a montagem de complexos de ARN-proteína discretas, o que irá ajudar tremendamente pesquisadores no campo da biologia ARN.
Em resumo, apresentamos um método para purificar e caracterizar PPIs em linhas de células de mamíferos. Propomos que este método estabelece as bases para a caracterização futuro e análise funcional de muitos complexos de proteínas novas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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