Abstract
Очистка активного белок-белковых комплексов и белково-нуклеиновых кислот имеет решающее значение для характеристики ферментативной активности и De Novo идентификации новых подразделений и пост-трансляционных модификаций. Бактериальные системы обеспечивают экспрессию и очистку широкого спектра одиночных полипептидов и белковых комплексов. Тем не менее, эта система не позволяет очистку белковых субъединиц , которые содержат посттрансляционные модификации (например, фосфорилирования и ацетилирования), а также выявление новых регуляторных субъединиц, которые присутствуют только в / выраженных в эукариотической системе. Здесь мы приводим подробное описание романа, надежный и эффективный метод очистки тандем сродством (TAP) с использованием септический и FLAG-меченных белков, что облегчает очистку белковых комплексов с временно или стабильно выражается эпитопными меченых белков из эукариотических клеток. Этот протокол может быть применен для характеристики ProtEin комплекс функциональность, чтобы открыть пост-трансляционные модификации на сложных субъединиц, а также определить новые регуляторные сложные компоненты с помощью масс-спектрометрии. Следует отметить, что этот метод ТАР может быть применен для изучения белковых комплексов, образованных эукариотических или патогенными (вирусные и бактериальные) компонентов, получая таким образом широкий спектр ниже по течению экспериментальные возможности. Мы полагаем, что исследователи, работающие с белковыми комплексами могли бы использовать этот подход в самых разных формах.
Introduction
Белок-белковые взаимодействия (ИПП) имеют решающее значение для точного регулирования биологических процессов 1, и дальнейшие исследования по этим ИПН может сообщить об их функции 2. Существует несколько подходов были разработаны для исследования и определения характеристик ИПН, а также для идентификации De Novo новых регуляторных белковых компонентов. В 1989 году Стэнли Филдс и его коллеги сообщили дрожжи двух гибридных (Y2H) анализ 3. Такой подход позволяет беспристрастно и полной идентификации interactors (охотится) для определенного интересующего белка (приманки) в Saccharomyces CEREVISIAE. В дополнение к своей замечательной утилиты для обнаружения ИЦП, анализ Y2H может быть использован для определения характеристик пар белков в дрожжевых клетках, определяя минимальные взаимодействующие домены, а также идентификации мутаций, которые отменяют такие взаимодействия. Изменяя анализа Y2H, ИЦП также могут быть изучены в клетках млекопитающихкласс = "Xref"> 4. Вариации анализа Y2H (например, дрожжи три гибридные системы) , также могут быть применены для изучения белок-РНК и белок-малые органические взаимодействия лиганда в клетках.
Другим часто используемым инструментом для изучения ИЦП в гомологичной системе является со-иммунопреципитации (со-IP) анализ 5. Используя антитела к иммунопреципитации белок, представляющий интерес, анализ со-IP позволяет исследователям контролировать ИЦП в клетках для различных условий окружающей среды и экспериментальных ситуаций. Использование эпитоп-меченных белков (например, FLAG, Мус, STREP и HA, среди прочих) в аффинной очистки (AP) методов способствовало выделение белков из сложных белковых смесей в течение нескольких последующих анализов, в том числе вестерн - блоттинга, серебро пятно и ферментный анализ. Тем не менее, ни один из этих подходов не ранее позволяют выделение больших количеств белковых комплексов для дальнейшей характеристики в том числе в пробиркеssays, открытие регуляторных субъединиц с помощью масс-спектрометрии и идентификации посттрансляционных модификаций. Усовершенствованный вариант метода AP называется Тандем AP (TAP), которая представляет собой метод очистки для изучения ИЦП путем создания гибридного белка с двумя эпитопов , который очищают с помощью двух последующих точек доступа 6, 7. В этой статье мы представляем вариант способа ТАР для очистки белковых комплексов, в которых две субъединицы, помеченных различными эпитопами и затем очищают с помощью двух последовательных точек доступа (AP STREP с последующим FLAG IP). Сначала обеспечить минималистичный обзор TAP (рисунок 1) , а затем подробное описание всех экспериментальных шагов (рисунок 2), так что исследователи могут применить их к белковым комплексом интересов.
Чтобы продемонстрировать применимость метода TAP, мы выбрали хорошо охарактеризованный циклин-CDK комплекс (называемый PTEFB - киназа), который состоит из регуляторной субъединицы циклина Т1 (CycT1) и киназы (CDK9), и участвует в регуляции транскрипции РНК - полимеразы II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb фосфорилирует С-концевой домен Pol II и связанных с ним негативных факторов удлинения, которые снимает транскрипционный приостановку на промотор и тем самым способствует транскрипции удлинение 11, 12, 13. С помощью этого известного взаимодействия в виду, STREP-меченый CycT1 и FLAG-меченый CDK9 были более выражены в клетках HEK293T. Ответный эксперимент TAP проводили с STREP-меченый CDK9 и FLAG-меченый CycT1 для дальнейшей проверки, что взаимодействие белка не зависит от используемых эпитопов. Клетки собирали и лизировали через 48 часов после трансфекции. Растворимый лизат очищали TAP (STREP AP с последующим FLAGIP). Входные и очищенные белки анализировали с помощью Вестерн - блоттинга и серебра пятно (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Покрытие клеток
- За один день до трансфекции, плиты 3,5 х 10 6 HEK293T клеток в 10 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (об / об) пенициллин / стрептомицин (10000 ед / мл запас) на 100 мм блюдо. Пластина 3 - 5 100 мм блюда на эксперимент / состоянии, чтобы обеспечить достаточное восстановление белка.
Примечание: Число пластин должен быть определен для каждого эксперимента / состояния, который будет опираться на уровни экспрессии и растворимости белкового комплекса, представляющего интерес. В качестве альтернативы, если очистка в более крупном масштабе необходимо, клеточные линии могут быть адаптированы к росту в суспензии в колбах 2 центрифужных, но этот метод не будет работать на временной трансфекции.
2. трансфекции клеток или склонение стабильной клеточной линии
- На следующий день, проверьте клетки под микроскопом. Клетки должны составлять 70 - 80% сплошности перед тем процеEding.
- Трансфекции клеток с общей смесью 7 мкг плазмидной ДНК и 21 мкл трансфекции реагента на 100 мм чашку. Трансфекции клеток с вектором , экспрессирующие GFP (таблица 1) в качестве контрол эффективности трансфекции.
Примечание: При использовании HEK293-T-REX или аналогичный стабильной клеточной линии , которая индуцирует экспрессию двух или более сложных субъединиц в ответ на доксициклина 14, 15, индуктор должны быть добавлены к клеткам и инкубируют в течение 48 часов. Точно так же, стабильной клеточной линии, которая индуцирует экспрессию GFP при добавлении индуктора также потребуется для целей проверки. Перейдите к шагу 2.7. - Приготовьте смесь для трансфекции на мм блюдо 100. В 1,5 мл трубки микроцентрифужных, смешать 500 мкл DMEM без добавок с 7 мкг общей плазмидной ДНК (что соответствует двум или более плазмид). В отдельном микроцентрифужных трубки, смешать 500 мкл DMEM без добавок Wiго 21 мкл реагента трансфекции. Повторите эти действия для каждой реакции трансфекции.
- Пипетировать раствора реагента трансфекции в раствор плазмидной ДНК (не смешивать решения в обратном порядке). Смешайте с помощью пипетки по крайней мере, в 4 раза.
- Инкубируйте эту смесь при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин, но не более чем на 15 мин.
- Наклон пластины, чтобы создать медиа-резервуар и тщательно пипетки трансфекционной смеси по каплям на внутреннюю сторону пластины, не нарушая клетки. Вернуть блюдо в исходное плоское положение и водоворот осторожно, чтобы распределить смесь.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе для культивирования клеток с 5% CO 2 (это условие в дальнейшем упоминается как "тканевой культуры инкубатор"). Заменить носитель 5 ч после трансфекции (по желанию).
3. Проверка Трансфекция или индукционные Эффективность
- В 24 ч после трансфекции, визуализировать клетки под гриппаorescent микроскоп для проверки эффективности трансфекции (или индукции стабильной клеточной линии управления HEK293T-REX, выражающей GFP). Инкубируют в течение еще 24 ч.
4. STREP Affinity Очистка (STREP AP)
- Сбор клеток
- По прошествии 48 ч после трансфекции, удалить носитель и добавляют 8 мл холодной 1x фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Пипетировать вверх и вниз, чтобы отделить клетки от пластины.
- Сбор и передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки и спина клетки вниз со скоростью 800 мкг в течение 4 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант PBS. Повторить вращение вниз (800 мкг в течение 1 мин при температуре 4 ° С), чтобы исключить любой остаточной PBS. Хранить осадок клеток при -80 ° С для дальнейшего использования или следовать процедуре ниже, чтобы продолжить очистку белка.
- Лизиса клеток
- Ресуспендируют гранул клеток с использованием 5 × объем клеточного осадка (~ 250 мкл на чашку) пассивного лизирующего буфера(PLB: 20 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ДТТ, ингибитор протеазы коктейль таблетка, 5% об / об глицерина и 1,0% NP-40) и передачи клеточной суспензии к 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Кратко вихрь подвеска и качаться в течение 30 мин при 4 ° С.
- Спин вниз клеточной суспензии при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Передача растворимых лизатов в новый 1,5 мл трубки микроцентрифужных и отбрасывать клеточных гранул. Сохранить 10% от конечного объема растворимого лизата как "STREP AP Input». Хранить при температуре 4 ° С.
- Уравновешивания Стрептококковое бусы
Примечание: Используйте Стрептококковое шарики для первого шага AP! Комплексы снесены с Стрептококковое шарики восстановить значительно больше белка, чем те, снесены с FLAG бусин.- Вынимают (N × 40 мкл) + п мкл 50% суспензии STREP шарик (п = число выборок) и спином вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: Используйте широкий мouthed советы пипетки бисера. - Удалить супернатант и добавить 500 мкл PLB к шарикам. Качаться смесь шариками в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- Повторить в общей сложности 3 стирок. Ресуспендируют бисером в PLB до конечного объема п × 40 мкл.
- Добавьте 40 мкл 50% суспензии STREP борта для каждого образца клеточного лизата и качаться в течение 2 ч при 4 ° С.
- Вынимают (N × 40 мкл) + п мкл 50% суспензии STREP шарик (п = число выборок) и спином вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
- STREP А.П.
- Спин вниз раствор при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант и хранить как "STREP AP проточный (FT)" при температуре 4 ° С.
- Добавьте 500 мкл стрептококкового AP промывочного буфера I (20 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 250 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl 2, 1 мМ DTT, 5% глицерина и 0,2% NP-40) к шарикам. Качаться смесь шариками в течение 5 мин при 4 ° С и центрифуге при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант.
- Повторить в общей сложности 4 стирок.
- Повторить в общей сложности 4 стирок.
- Добавить 500 мкл промывочного буфера II (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) и уравновешивают бусинки переворачиванием пробирки. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С и отбросить супернатант.
- Элюции интересующего белка с 50 мкл буфера для элюции STREP (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ и Desthiobiotin). Вихрь при 800 оборотах в минуту в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Спин вниз бусинки при 1500 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатант. Эта часть соответствует образцу "STREP А.П. элюции".
- Сохранить фракцию бусин при 4 ° С в течение второго элюции, которое могло бы дать до половины количества белка, полученного с первого элюирования. Аликвоты 10% от стрептококковые AP элюции окрашиванием серебром и / или вестерн-блоттинга16.
- Уравновешивания флаге бусы
- Выньте (NX 16 мкл) + п мкл раствора FLAG гранул (п = число выборок) и спином вниз при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С.
Примечание: Используйте с широким горлышком советы для пипеток бисером. - Удалить супернатант и добавьте 500 мкл буфера для промывки ФЛАГ (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,1% NP-40) к шарикам. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Повторить в общей сложности 3 стирок.
- Ресуспендируют бисером в ФЛАГ промывочным буфером до конечного объема 16 мкл NX.
- Добавьте 16 мкл флаге шарик суспензии в оставшейся STREP AP элюирования и качаться в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Выньте (NX 16 мкл) + п мкл раствора FLAG гранул (п = число выборок) и спином вниз при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С.
5. FLAG IP
- Спин вниз суспензии FLAG шарики при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С. Сохраните супернатант и хранить как "FLAG IP проточный" (FT) при 4 ° С.
- Добавить 50081; л флагового буфера для промывки к раствору. Качаться в течение 5 мин при 4 ° С и центрифуге при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Повторить в общей сложности 4 промывок и удалить супернатант после каждого мытья.
Примечание: Перед четвертой промывки передать Белковый раствор бусинок к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки для уменьшения фона. Этот шаг имеет важное значение. - Удалить супернатант из конечного отжима и добавьте 30 мкл буфера для промывки FLAG, содержащего 200 нг / мкл флаговых пептида в гранулы. Вихрь при 800 оборотах в минуту в течение 2 часов при температуре 4 ° С.
- Спин вниз суспензии при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Урожай супернатант и хранят при температуре 4 ° C, как "FLAG IP элюции."
Примечание: Образцы элюции может быть подтверждена с помощью окрашивания серебром и / или вестерн - блоттинга с использованием стандартных протоколов 16, и готовы к дальнейшему белковый анализ. При настройке вестерн-блот, запустить все следующие образцы: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiна, (4) FLAG IP-FT, и (5) FLAG IP элюирования. Объемы нагруженные должны быть определены для каждого эксперимента. Все собранные образцы и гранулы могут храниться при температуре 4 ° С для кратковременного хранения и при -80 ° С в течение длительного хранения. Образцы TAP могут быть проанализированы с помощью масс - спектрометрии , чтобы проверить подлинность их компонентов, чтобы идентифицировать новые посттрансляционные модификации (PTMs), и / или открыть любой новый взаимодействие белка с очищенным комплексом 2, 17. С этой целью после запуска Кумасси геля или окрашивания серебром, полосы могут быть вырезаны из геля с помощью чистой скальпель. Несколько превосходных обзоров , в которых обсуждаются методы масс - спектрометрии были ранее опубликованы 18, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье мы покажем применимость метода TAP к хорошо охарактеризованного CycT1-CDK9 комплекса (также известный как P-TEFb-киназы).
Плазмидами , кодирующими циклин T1-Strep (CycT1: S) и CDK9-FLAG (CDK9: F) или CDK9-Strep (CDK9: S) и циклин T1-FLAG (CycT1: F) (таблица 1), были трансфицированы в клетках HEK293T , Отрицательные контроли включали трансфекций с пустым вектором и CDK9: F или CycT1: F плазмид (фиг.3А и В, соответственно). выражались Белки в течение 48 ч до того, собирали клетки. Множественные чашки клеток были использованы в эксперименте (пять пластин в образце были использованы для данных , представленных на рисунке 3) для увеличения производства и восстановления белка. После того, как клетки лизируют в отдельных микропробирок, клеточные лизаты одного и того же образца, были объединены в одну microcentrifУГЭ трубки перед добавлением Стрептококковое бусы. Объединение образцов белка с одной порции гранул повышает конечную концентрацию белка, что может улучшить выход белка из белков, которые трудно выразить. После первичного элюировани, второй элюирование может быть сделано для того, чтобы увеличить количество затраченного белка для флаге IP. Важно , чтобы сохранить вход для каждой стадии очистки перед добавлением бусин для дальнейшего поиска неисправностей (таблица 2), если это необходимо.
Данные , представленные на фигуре 3А показаны результаты метода штуцером для CycT1: S и CDK9: F, анализировали с помощью вестерн - блоттинга. CDK9: F совместно элюировали CycT1: S из стрептококковые бисера, но не в отрицательном контроле AP хватает CycT1: S, что указывает на CDK9: F и CycT1: S образуют белок-белкового комплекса. Как и следовало ожидать, оба белка были обнаружены в флаге элюции, который еще раз подтвердил образование комплекса. Фигура 3В показывает RESULTS на обратной метода TAP, где поменялись местами эпитоп метки двух белков (CDK9: S и CycT1: F) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга.
Цифры 3C и 3D показаны результаты ТКП и взаимной TAP анализировали с помощью окрашивания серебром, соответственно. Рисунок 3C полоса 2 показано , что CDK9: F совместно элюировали CycT1: S прочь стрептококковые бусинок, но не от контрольной точки доступа (полоса 1), тем самым указывая , что CDK9: F и CycT1: S образуется белок-белкового комплекса. В последующем FLAG элюирования, как показано на дорожке 4, CycT1: S совместно элюировали CDK9: F прочь флаге бусинок. Аналогичным образом , на рисунке показано , что 3D CycT1: F совместно элюировали CDK9: S прочь стрептококковые бусинок, но не от контрольной точки доступа, а также о том , что белок-белковый комплекс был эффективно восстановлен после второго этапа ФЛАГ IP. И западные помарки и серебряные пятна подтвердили, что протокол TAP работал эффективно для purificatio N, выделение и характеристика белкового комплекса, представляющего интерес.
Рисунок 1: Обзор TAP Очистка стратегии. Простая схема, описывающая этапы TAP. Плазмидами, кодирующими белок, представляющий интерес либо с стрептококковые или FLAG эпитопной меткой котрансфицируют в клетки млекопитающих. Через 48 часов индукции клетки собирают и лизируют. Растворимый лизата клеток, содержащих белок, представляющий интерес, наряду с другими белками, которые загружаются на Strep бусин на стрептококк AP. Белки, которые либо содержат Стрептококковое тег или связываются с STREP-меченого белка, прикрепленного к бусин затем элюируют. Флагу Затем гранулы добавляют в стрептококковые элюции. Белки, которые либо содержат FLAG тег или связываются с FLAG-меченого белка, прикрепленного к бусин затем элюируют. Элюирование может быть проанализирована с помощью указанных методов.TTP: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическое представление ТАР стратегии. Подробный протокол TAP. Смотри текст для деталей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Пример Шаг за шагом анализа TAP очистки. (A) Вестерн - блот анализ TAP (CycT1: S и CDK9: F). (Б) Вестерн - блот - анализ взаимного утряски (CDK9: S и CycT1: F). Фром 1 мл цельной клеточного лизата, 5 мкл (0,2%) был загружен как "STREP AP Input." 975 мкл оставшегося целого клеточного лизата добавляли к Strep бусин на стрептококк AP и 100 мкл "STREP А. П. Элюирование" была собрана. Исходя из этого, 5 мкл (2%) был загружен. 80 мкл "STREP А. П. Элюирование" был добавлен в FLAG бусин для флаговых IP и 30 мкл "FLAG IP Элюирование" была собрана. Из 30 мкл "FLAG IP Элюирование", был загружен 7 мкл (23,3%). (C) Silver анализ пятен ТАР (CycT1: S и CDK9: F). (D) Серебро пятно анализ обратной TAP (CDK9: S и CycT1: F). были загружены 5 мкл (2%) из "STREP А. П. Элюирование» и 7 мкл (23,3%) от "FLAG IP Элюирование". Звездочки указывают совместно элюированных примеси. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| белка | Остаточные | Вектор | Тег | Клонирование сайтов | Справка |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4to | STREP | HindIII - EcoRI | Макнамара и др. 2013 г. 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4to | ФЛАГ | HindIII - EcoRI | Эта статья |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4to | STREP | HindIII - XhoI | Эта статья |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4to | ФлоридаА.Г. | HindIII - XhoI | Макнамара и др., 2013 г. 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4to | STREP-FLAG | BamHI - XhoI | Эта статья |
Таблица 1: Плазмиды , используемые в данном исследовании. CycT1 и CDK9 были лигированы в pcDNA / 4to-STREP и плазмидных векторов pcDNA / 4to-FLAG. Эти конструкции были трансформированы в компетентные клетки DH5 & alpha и высевали на LB-ампициллин пластинах. Колонии были отобраны, выращены, и подвергали скринингу. Успешно лигатурой клоны были проверены с помощью Sanger секвенирования и сочетание рестриктазами и электрофореза в агарозном геле. Для CycT1 мы использовали сокращенный вариант (1 - 708) вместо полной длины (1 - 726), так как последние 18 остатков содержат последовательность PEST (пептидную последовательность, богатуюпролин, глутаминовая кислота, серин и треонин), который действует в качестве сигнального пептида для деградации белка 20. CDK9 был полнометражный. Последовательность тандем STREP тега выглядит следующим образом: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. Последовательность тандема FLAG тега выглядит следующим образом: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Таблица 2: Поиск и устранение неисправностей. Перед тем как начать устранение неполадок, дважды проверьте, чтобы убедиться, что каждый существенный шаг последовало. Определенные шаги в этом протоколе требуют больше, чем другие оптимизации для достижения ожидаемого результата. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, для экспрессии и выделения белковых комплексов из эукариотических клеток не ограничивается биохимической характеризации таких молекулярных ансамблей, но также могут быть использованы для идентификации новых interactors и посттрансляционных модификаций, которые могут регулировать свою функцию. Использование аффинных меток не ограничивается тем, что упоминается в данном протоколе; но наш опыт показывает, что использование Strep в качестве первого шага AP значительно повышает выход конечного белок-белкового комплекса. Оба связывания и элюции шаги к и от стрептококкового шариков чрезвычайно эффективны по сравнению с другими тегами эпитопов (например, флаг). Кроме того, в теории, ТАП может быть применено к другим белкам или доменов с некоторыми незначительными оптимизаций, таких как условия, буферные количества пластин в эксперименте (для обоих переходных и стабильных экспрессирующих систем) и т.д. Кроме того, метод ТАР также может быть приложенное то других клеточных линий, если специфические белковые комплексы требуют специальной системы их функции или их взаимодействия с уникальными факторами. Для облегчения поиска неисправностей, настоятельно рекомендуется, чтобы входные и FT образцы оба сохранены (таблица 2). Когда ожидаемые полосы белка не могут быть визуализированы в элюции, образцы FT могут быть использованы для устранения эксперимента и определить, является ли или нет образец обязан и / или элюируют из шариков.
Успешный ТАР строго зависит от высоких уровней экспрессии белка и восстановления. Таким образом, исследователи должны оптимизировать количество исходного материала на каждом конкретном случае. Если временная трансфекция используется для выражения белковых компонентов, эффективность трансфекции должна быть не менее 70%, прежде чем продолжить на второй стадии метчика. Метод взаимными ТАР (в которых эпитопы перепутаны между двумя приманок), как правило, помогает в определении того, какие экспериментальные стратегииследует использовать для достижения наилучшего чистоты и выхода. Опять же, это должны быть исследованы на основе случая к случаю. Важно отметить, что выполнение ответную TAP также подтверждает, что ИЦП не зависит от аффинной метки, используемой.
Некоторые аспекты метода TAP, представленные здесь имеют ограничения. Например, сверхэкспрессирующими FLAG- и Стрептококковое-меченных белков может генерировать артефакты для самого эктопически выраженного белка или их interactors. Различные теги эпитоп могут повлиять на уровень экспрессии белка конформацию белка и / или внутриклеточную локализацию. К тому же клеточной линии и эффективность трансфекции ограничение, размер комплексов, подлежащей очистке может быть проблемой. Этот метод TAP работает хорошо для белковых комплексов нескольких субъединиц. По нашему опыту, четыре компонента могут быть обнаружены с помощью серебр ным красителем (данные не показаны). Тем не менее, при использовании двух помеченных компонентов, другие interactors могут не быть совместно очищают при одинаковых стехиометрических уровнях. Следовательно,для этой конкретной цели, использование клеточных линий, что вызывает более низкие уровни экспрессии сложных компонентов рекомендуется. Другим ограничением будет сила PPI. Если взаимодействие не достаточно стабильны, некоторые компоненты могут быть потеряны в ходе стадий очистки (особенно на конечной стадии IP-FLAG).
Метод ТАР был ранее описан , и несколько различных теги эпитоп были протестированы, проверены, и по сравнению 6. Тем не менее, метод ТАР представлены в этой статье, является новым и обеспечивает легкий, эффективный, надежный, и альтернативную стратегию для изучения ИЦП, сложный монтаж, и вывод сетевой состав и функции белков. По сравнению с предыдущими методами TAP, этот STREP-FLAG стратегия TAP позволяет быстро очистки комплексов для дальнейшей характеристики без предварительного знания сложного состава, активности или функции; и без необходимости протеазы расщепления (например, ТРВ) для белка элюции (ВГIch может значительно уменьшить выход белка). Из - за увеличения белкового комплекса восстановления, метод ТАР STREP-ФЛАГ также позволяет робастной идентификации белков , которые связывают с белковым комплексом интереса клеток с помощью анализа тандемной масс - спектрометрии 10, 15. Впоследствии другие методы, такие как конфокальной микроскопии, гель-проникающей хроматографии, а также со-IP-анализов, также могут быть использованы для проверки ИЦП. И, наконец, мы предлагаем альтернативный вариант протокола TAP может быть адаптирован для очистки и изучения сборки дискретных белок-РНК комплексов, которые будут чрезвычайно помочь исследователям в области биологии РНК.
Таким образом, мы представляем метод для очистки и описания ИЦП в клеточных линиях млекопитающих. Мы полагаем, что этот метод закладывает основу для будущего определения характеристик и функционального анализа многих новых белковых комплексов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
