Abstract
Reningen av aktivt protein-protein och protein-nukleinsyrakomplex är avgörande för karakterisering av enzymatiska aktiviteter och de novo identifiering av nya subenheter och posttranslationella modifieringar. Bakteriella system tillåter för uttryck och rening av ett brett utbud av enstaka polypeptider och proteinkomplex. Men detta system inte möjliggör rening av proteinunderenheter som innehåller post-translationella modifieringar (t.ex. fosforylering och acetylering), och identifiering av nya regulatoriska underenheter som bara före / uttryck i eukaryota systemet. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett nytt, robust och effektiv tandem affinitetsrening (TAP) metod som använder STREP- och FLAG-taggade proteiner som underlättar reningen av proteinkomplex med gående eller stabilt uttryckte epitopmärkta proteiner från eukaryota celler. Detta protokoll kan användas för att karakterisera protein komplex funktionalitet, att upptäcka posttranslationella modifieringar på komplexa subenheter, och att identifiera nya reglerings komplexa komponenter med masspektrometri. Noterbart kan detta TAP metod användas för att studera proteinkomplex som bildas av eukaryota eller patogena (virus- och bakterie) komponenter, vilket således ger ett brett spektrum av nedströms experimentella möjligheter. Vi föreslår att forskare som arbetar med proteinkomplex kan utnyttja denna metod på många olika sätt.
Introduction
Protein-proteininteraktioner (PPI) är avgörande för exakt reglering av biologiska processer 1, och ytterligare studier på dessa PPI kan informera om deras funktion 2. Flera tillvägagångssätt har föreslagits för att studera och karakterisering av protonpumpshämmare såväl som för identifiering av nya regulatoriska proteinkomponenter de novo. 1989, Stanley Fält och kollegor rapporterade jäst två-hybrid (Y2H) analys 3. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att det ej förspända och omfattande identifiering av Interactmedlemmar (bytesorganismer) för ett definierat protein av intresse (bete) i Saccharomyces cerevisiae. Utöver sin anmärkningsvärda verktyg för att upptäcka PPI kan Y2H analysen användas för att karaktärisera protein par i jästceller, som definierar minimala samverkande domäner, och identifiera mutationer som avskaffar sådana interaktioner. Genom att modifiera Y2H analys kan protonpumpshämmare också studeras i däggdjurscellerclass = "xref"> 4. Variationer av Y2H analysen (t.ex., jäst tre-hybridsystemet) kan också tillämpas för att studera protein-RNA och protein-små organiska ligand interaktioner i celler.
En annan vanligt förekommande verktyg för att studera protonpumpshämmare i en homolog systemet är co-immunoprecipitation (co-IP) -analys 5. Genom användning av en antikropp för att immunfälla ett protein av intresse, tillåter samtidig IP-analysen forskare att övervaka PPI i celler för olika miljöförhållanden och experimentella situationer. Användningen av epitopmärkta proteiner (t.ex. FLAG, Myc, STREP och HA, bland andra) i affinitetsrening (AP) metoder har underlättat isolering av proteiner från komplexa proteinblandningar under flera nedströms analyser, inklusive western blöt, silverfärg , och enzymatisk analys. Men ingen av dessa tidigare tillvägagångssätt gör det möjligt för isolering av stora mängder av proteinkomplex för ytterligare karakterisering inklusive in vitro enssays, upptäckten av regulatoriska underenheter genom masspektrometri, och identifiering av posttranslationella modifieringar. En förbättrad version av AP metoden kallas Tandem AP (TAP), som är en reningsteknik för att studera protonpumpshämmare genom att skapa ett fusionsprotein med två epitoper som renas genom två efterföljande AP 6, 7. I den här artikeln presenterar vi en variant av TAP förfarande för rening av proteinkomplex i vilka två subenheter är märkta med olika epitoper och sedan renas genom två sekventiella APS (STREP AP följt av FLAG IP). Vi tillhandahåller först en minimalistisk översikt av TAP (figur 1) och därefter en detaljerad beskrivning av alla de experimentella stegen (Figur 2), så att forskare kan använda dem till deras proteinkomplex av intresse.
För att demonstrera tillämpbarheten av TAP-metoden, valde vi en välkarakteriserad cyklin-CDK-komplex (kallas PTEFB-kinas), vilken är sammansatt av den regulatoriska subenheten cyklin T1 (CycT1) och en kinas (CDK9), och är involverad i regleringen av transkription genom RNA-polymeras II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforylerar den C-terminala domänen av Pol II och dess associerade negativa elongeringsfaktorer, som befriar transkriptionspaus vid promotorn och därigenom underlättar transkription töjning 11, 12, 13. Med denna kända interaktion i åtanke, STREP-märkta CycT1 och FLAG-märkt CDK9 var överuttryckt i HEK293T celler. En reciprok TAP experiment utfördes med STREP-taggade CDK9 och FLAG-märkt CycT1 att ytterligare validera att interaktionen proteinet är oberoende av de epitoper som används. Celler uppsamlades och lyserades 48 h efter transfektion. Det lösliga lysatet renades genom TAP (STREP AP följt av FLAGIP). Ingång och renade proteinerna analyserades genom western blöt och silverfärgning (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utstrykning av celler
- En dag före transfektion, plattan 3,5 x 10 6 HEK293T-celler i 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin (10.000 U / ml lager) per 100 mm skål. Plate 3 - 5 100 mm skålar per experiment / skick för att säkerställa tillräcklig proteinutvinning.
OBS: Antalet plattor måste bestämmas för varje experiment / skick, vilket kommer att förlita sig på de uttrycksnivåer och löslighet av proteinet komplexet av intresse. Alternativt, om det behövs större skala rening, cellinjer kan anpassas för att växa i suspensioner i spinnerflaskor 2, men denna metod fungerar inte för transienta transfektioner.
2. transfektera celler eller förmå stabila cellinjer
- Följande dag, ta cellerna under mikroskop. Cellerna måste vara 70 - 80% sammanflytande före förfaEding.
- Transfektera cellerna med en total blandning av 7 | ig av plasmid-DNA och 21 | il av transfektionsreagens per 100 mm skål. Transfektera celler med en vektor som uttrycker GFP (Tabell 1) som en kontroll för transfektionseffektivitet.
OBS: Om du använder en HEK293-T-REx eller liknande stabil cellinje som leder till uttryck av två eller mer komplexa subenheter som svar på doxycyklin 14, 15, kommer att induceraren tillsättas till cellerna och inkuberades under 48 h. På samma sätt skulle också krävas en stabil cellinje som leder till uttryck av GFP vid tillsats av induceraren för validering. Gå vidare till steg 2,7. - Förbereda transfektion blandningen per 100 mm skål. I en 1,5 ml mikrocentrifugrör, blanda 500 ^ il okompletterat DMEM med 7 | j, g av total plasmid-DNA (motsvarande två eller flera plasmider). I en separat mikrocentrifugrör, blanda 500 pl osupplerat DMEM with 21 pl av transfektionsreagens. Upprepa för varje transfektion reaktion.
- Pipettera transfektion reagenslösning in i plasmid-DNA-lösning (inte blanda lösningar i omvänd ordning). Blanda genom att pipettera minst 4 gånger.
- Inkubera denna blandning vid rumstemperatur under 10 - 15 min, men inte längre än 15 minuter.
- Luta plattan för att skapa en mediereservoar och försiktigt pipettera transfektion blandningen droppvis på den inre sidan av plattan, utan att störa cellerna. Återgå skålen till dess ursprungliga plant läge och snurra försiktigt för att fördela blandningen.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad cellodling inkubator med 5% CO2 (detta villkor är det följande kallad "vävnadsodlingsinkubator"). Byt media fem timmar efter transfektion (tillval).
3. Kontroll transfektion eller Induktions Effektivitet
- Vid 24 h post-transfektion, visualisera cellerna under ett influensaorescent mikroskop för att kontrollera transfektionseffektiviteten (eller induktion av styr HEK293T-Rex stabil cellinje som uttrycker GFP). Inkubera under ytterligare 24 timmar.
4. STREP Affinity Purification (STREP AP)
- Uppsamling av cellerna
- Vid 48 h efter transfektion, ta bort media och tillsätt 8 ml kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Pipettera upp och ned för att lösgöra celler från plattan.
- Samla in och överföra cellsuspensionen in i ett 15 ml rör och centrifugera cellerna ner vid 800 xg under 4 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort PBS supernatanten. Upprepa centrifuger ned (800 xg i 1 min vid 4 ° C) för att eliminera eventuellt kvarvarande PBS. Förvara cellpelleten vid -80 ° C för framtida bruk eller följ anvisningarna nedan för att fortsätta proteinrening.
- Lysering av cellerna
- Resuspendera cellpellets med hjälp 5 × cellpelleten volym (~ 250 | il per platta) av Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, proteasinhibitorcocktail tablett, 5% vol / vol glycerol och 1,0% NP-40) och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- virvel kort fjädring och nutera under 30 minuter vid 4 ° C.
- Centrifugera ner cellsuspensionen vid 10.000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Överföra de lösliga lysat till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och kassera de cellpelletar. Spara 10% av den slutliga volymen av den lösliga lysatet som "STREP AP Input". Lagra vid 4 ° C.
- Jämvikt STREP pärlor
OBS: Använd STREP pärlor för första AP steg! Komplex drog ned med STREP pärlor återhämta sig betydligt mer protein än de drog ned med FLAG pärlor.- Ta ut (n × 40 | j, l) + n il av 50% STREP pärluppslamningen (n = antal prover) och spinn ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
OBS: Använd bred mouthed tips till pipett pärlor. - Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 pl av PLB till pärlorna. Vicka den pärlor blandningen under 5 min vid 4 ° C. Centrifugera ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- Upprepa för totalt 3 tvättar. Resuspendera kulorna i PLB till en slutlig volym av n x 40 ^.
- Tillsätt 40 | il av 50% STREP pärluppslamningen till varje cellysat prov och nutera under 2 h vid 4 ° C.
- Ta ut (n × 40 | j, l) + n il av 50% STREP pärluppslamningen (n = antal prover) och spinn ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- STREP AP
- Spinn ner lösning vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 C.
- Avlägsna supernatanten och lagra som "STREP AP Genomflöde (FT)" vid 4 ° C.
- Tillsätt 500 pl av STREP AP tvättbuffert I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol och 0,2% NP-40) till pärlorna. Vicka den pärlor blandningen under 5 min vid 4 ° C och centrifugera vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Upprepa för totalt 4 tvättar.
- Upprepa för totalt 4 tvättar.
- Tillsätt 500 ^ il tvättbuffert II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl och 1 mM EDTA) och jämvikta kulorna genom att vända rören. Centrifugera ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Eluera proteinet av intresse med 50 pl av STREP Elution Buffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA och 2,5 mM destiobiotin). Vortex vid 800 varv per minut under 15 min vid 4 ° C.
- Centrifugera ner pärlorna vid 1500 xg under 1 min vid 4 ° C. Samla in supernatanten. Denna del motsvarar den "STREP AP Eluering" prov.
- Spara pärlor fraktionen vid 4 ° C under en andra eluering, vilket skulle kunna ge upp till hälften av den mängd protein som erhålls med den första elueringen. Alikvotera 10% av STREP AP Eluering för silverfärgning och / eller western blotting16.
- Ekvilibrering av FLAG pärlor
- Ta ut (nx 16 l) + n il FLAG pärlor lösning (n = antal prover) och spinn ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
OBS: Använd bred mun tips till pipett pärlor. - Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 mikroliter av FLAG tvättbuffert (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA och 0,1% NP-40) till pärlorna. Centrifugera ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Upprepa för totalt 3 tvättar.
- Resuspendera kulorna i FLAG tvättbuffert i en slutlig volym av nx 16 ^ il.
- Lägg 16 pl FLAG pärluppslamningen till den återstående STREP AP eluering och nutera över natten vid 4 ° C.
- Ta ut (nx 16 l) + n il FLAG pärlor lösning (n = antal prover) och spinn ner vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
5. FLAG IP
- Spinn ner flaggan pärlor suspensionen vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Spara supernatanten och lagra som den "FLAG IP Flow-through" (FT) vid 4 ° C.
- Lägg 50081; il av FLAG tvättbuffert till lösningen. Vicka under 5 minuter vid 4 ° C och centrifugera vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Upprepa för totalt 4 tvättar och avlägsna supernatanten efter varje tvätt.
OBS! Innan den fjärde tvätten, överför lösningen protein-pärlor i ett annat 1,5 ml mikrocentrifugrör för att minska bakgrunden. Detta steg är viktigt. - Avlägsna supernatanten från den slutliga spinn och tillsätt 30 mikroliter av FLAG tvättbuffert innehållande 200 ng / l av FLAG-peptiden i pärlorna. Vortex vid 800 varv per minut under 2 h vid 4 ° C.
- Centrifugera ner suspensionen vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Skörda supernatanten och förvara vid 4 ° C som "FLAG IP Eluering."
OBS: Elueringen prover kan bekräftas genom silverfärgning och / eller Western blöt med användning av standardprotokoll 16, och är redo för ytterligare proteinanalyser. När du ställer in en western blöt, köra alla följande prover: (1) STREP AP ingång, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutipå, (4) FLAG IP FT, och (5) FLAG IP Eluering. Volymer laddade måste bestämmas för varje experiment. Alla insamlade prover och pärlor kan lagras vid 4 ° C under korttidslagring och vid -80 ° C för långtidsförvaring. TAP prov kan analyseras med masspektrometri för att kontrollera identiteten på sina komponenter, för att identifiera nya posttranslationella modifieringar (PTMs), och / eller att upptäcka någon ny proteininteraktion med det renade komplexet två, 17. För detta ändamål, efter att ha kört en coomassie gel eller silverfärgning, band kan skäras ut från gelén med användning av en ren skalpell. Flera utmärkta recensioner som diskuterar masspektrometri metoder tidigare publicerats 18, 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna artikel, visar vi tillämpbarheten av TAP metoden till den välkarakteriserade CycT1-CDK9 komplex (även känt som P-TEFb kinas).
Plasmider som kodar cyklin T1-STREP (CycT1: S) och CDK9-FLAG (CDK9: F), eller CDK9-STREP (CDK9: S) och Cyklin T1-FLAG (CycT1: F) (tabell 1), transfekterades in i HEK293T-celler . Negativa kontroller inkluderade transfektioner med en tom vektor och CDK9: F eller CycT1: F-plasmider (Figurerna 3A och B, respektive). Proteinerna uttrycktes under 48 h innan cellerna uppsamlades. Flera plattor av celler användes per experiment (fem plattor per prov användes för de data som presenteras i Figur 3) för att öka produktion och återvinning protein. Efter det att cellerna lyserades i individuella mikrocentrifugrör rades cellysat av samma prov kombineras till en microcentrifuge tube före tillsats Strep pärlor. Kombinera de proteinprover med en portion av pärlorna ökar den slutliga proteinkoncentrationen, som kan förbättra proteinutvinning från proteiner som är svåra att uttrycka. Efter den inledande eluering, kan en andra eluering göras för att öka den totala protein ingång för FLAG IP. Det är viktigt att spara ingången för varje reningssteg före tillsats av pärlorna för framtida felsökning (tabell 2), om det behövs.
Data i Figur 3A visar resultaten av den TAP metod för CycT1: S och CDK9: F, analyserades med western blöt. CDK9: F sameluerades med CycT1: S från Strep pärlor, men inte i den negativa kontrollen AP saknar CycT1: S, vilket indikerar att CDK9: F och CycT1: S bildar ett protein-proteinkomplex. Expectedly var båda proteinerna detekteras i FLAG elueringen, vilket ytterligare bekräftade komplexbildning. Figur 3B visar Results för ömsesidigt TAP-metoden, där de epitopmärkningar av de två proteinerna byttes (CDK9: S och CycT1: F), och analyserades genom Western blöt.
Figurerna 3C och 3D visar resultaten av TAP och ömsesidig TAP analyserades genom silverfärgning, respektive. Figur 3C lane 2 visade att CDK9: F sameluerades med CycT1: S off av Strep pärlor, men inte från kontroll AP (spår 1), vilket sålunda indikerar att CDK9: F och CycT1: S bildade ett protein-proteinkomplex. I den efterföljande FLAG eluering, såsom visas i kanal 4, CycT1: S sameluerades med CDK9: F bort av FLAG-pärlor. På liknande sätt, fig 3D visade att CycT1: F sameluerades med CDK9: S off av Strep pärlor, men inte från kontroll AP, och att protein-proteinkomplex var effektivt återhämtat sig efter den andra flaggan IP steget. Både western blöts och silver fläckar bekräftade att TAP-protokollet arbetade effektivt för purificatio n, isolering och karaktärisering av proteinkomplexet av intresse.
Figur 1: Översikt av TAP reningsstrategi. Ett enkelt schema som beskriver stegen av TAP. Plasmider kodande för proteinet av intresse med antingen STREP eller FLAG-epitop-taggen samtransfekteras in i däggdjursceller. Efter 48 h induktion, uppsamlas cellerna och lyserades. Lösligt cell-lysat innehållande proteinet av intresse tillsammans med andra proteiner laddas på STREP pärlor för STREP AP. Proteiner som antingen innehåller strep-taggen eller är bundna till Strep-märkt protein fäst till pärlorna elueras därefter. Flaggan kulorna sattes sedan in i STREP eluering. Proteiner som antingen innehåller den FLAG-märkning eller är bundna till FLAG-märkt protein fäst till pärlorna elueras därefter. Elueringar kan analyseras av de angivna metoderna.ttp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55236/55236fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk representation av TAP Strategin. En detaljerad protokoll av TAP. Se text för detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på steg-för-steg Analys av TAP Rening. (A) Western blot-analys av TAP (CycT1: S och CDK9: F). (B) Western blot-analys av reciproka TAP (CDK9: S och CycT1: F). Tillbakam 1 ml helcellslysat, 5 pl (0,2%) laddades som "STREP AP Input". 975 pl av återstående hela cellysatet sattes till STREP pärlor för STREP AP och 100 pl "STREP AP Eluering" samlades in. Från detta, 5 pl (2%) var laddad. 80 pl av "STREP AP Eluering" lades till FLAG pärlor för FLAG IP och 30 pl "FLAG IP Eluering" samlades in. Från 30 pl "FLAG IP Eluering", var 7 il (23,3%) laddad. (C) Silverfärgningsanalys av TAP (CycT1: S och CDK9: F). (D) Silverfärgningsanalys med ömsesidig TAP (CDK9: S och CycT1: F). 5 pl (2%) av "STREP AP Eluering" och 7 pl (23,3%) av "FLAG IP Eluering" laddades. Asteriskerna indikerar sameluerades föroreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein | rester | Vektor | Märka | kloningsställen | Referens |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4to | STREP | Hindlll - EcoRI | McNamara et al. 2013 10 |
| CycT1 | 1-708 | pcDNA / 4to | FLAGGA | Hindlll - EcoRI | Denna artikel |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4to | STREP | Hindlll - Xhol | Denna artikel |
| CDK9 | 1-372 | pcDNA / 4to | FLAG | Hindlll - Xhol | McNamara et al., 2013 10 |
| GFP | 1-238 | pcDNA / 4to | STREP-FLAG | BamHI - Xhol | Denna artikel |
Tabell 1: Plasmider som används i denna studie. CycT1 och CDK9 ligerades in i pcDNA / 4 till-STREP och pcDNA / 4 till-FLAG plasmidvektorer. Dessa konstruktioner transformerades in i DH5a-kompetenta celler och ströks ut på LB-ampicillin-plattor. Kolonier valdes, odlades och screenades. Framgångsrikt ligerade kloner verifierades genom Sanger-sekvensering och kombinationen av restriktionsdigerering och agarosgelelektrofores. För CycT1 använde vi en kortare version (1-708) i stället för full längd (1-726), eftersom de senaste 18 resterna innehåller en PEST-sekvens (en peptidsekvens rik påprolin, glutaminsyra, serin och treonin), som fungerar som en signalpeptid för proteinnedbrytning 20. CDK9 var full längd. Sekvensen för tandem STREP taggen är som följer: GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK. Sekvensen för tandem FLAG-taggen är följande: GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.
Tabell 2: Felsökning Tabell. Innan du börjar med felsökningen, att dubbelkolla att se till att varje viktigt steg har följts. Vissa steg i detta protokoll kräver mer optimering än andra för att uppnå det förväntade resultatet. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här för uttryck och isolering av proteinkomplex från eukaryota celler är inte begränsad till den biokemiska karakteriseringen av sådana molekylära aggregat, men kan även utnyttjas för identifiering av nya Interactmedlemmar och posttranslationella modifieringar som skulle kunna reglera deras funktion. Användningen av affinitetsmarkörer inte är begränsad till vad som anges i detta protokoll; men vår erfarenhet tyder på att användning av STREP som den första AP steget signifikant förbättrar utbytet av den slutliga protein-proteinkomplex. Både bindnings- och elueringssteg till och från Strep pärlor är extremt effektiva jämfört med andra epitopmärkningar (t.ex. FLAG). Dessutom, i teorin, TAP skulle kunna tillämpas på andra proteiner eller domäner med några mindre optimeringar, t.ex. buffertförhållanden, antal plattor per försök (för både övergående och stabila uttryckande system), etc. Vidare kan TAP metoden också vara tillämpad to andra cellinjer om specifika proteinkomplex kräver ett särskilt system för deras funktion eller deras interaktioner med unika faktorer. För att underlätta felsökning, är det starkt rekommenderat att ingångs- och FT prover både sparas (tabell 2). När de förväntade proteinbanden inte kan visualiseras i elueringen, kan FT prover användas för att felsöka experimentet och bestämma huruvida eller inte provet hade bundit till och / eller elueras bort av pärlorna.
En framgångsrik TAP är strikt beroende av höga nivåer av proteinuttryck och återhämtning. Således skulle forskarna att optimera mängden av utgångsmaterial på ett enskilt fall. Om övergående transfektion används för att uttrycka proteinkomponenter, bör transfektionseffektiviteten vara åtminstone 70% innan du fortsätter med det andra steget av TAP. Den ömsesidiga TAP-metoden (i vilken epitoperna växlas mellan de två beten) hjälper vanligtvis med att fastställa vilken experimentell strategibör användas för att uppnå bästa renhet och utbyte. Återigen kommer detta måste undersökas från fall till fall. Viktigt är att utföra ömsesidig TAP också bekräftar att PPI är oberoende av affinitetsmarkör används.
Vissa aspekter av TAP metod som presenteras häri har begränsningar. Till exempel kan överuttrycker FLAG- och STREP-märkta proteiner generera artefakter för ektopiskt uttryckta proteinet självt eller deras Interactmedlemmar. Olika epitopmärkningar kan påverka proteinexpressionsnivåer, proteinkonforma och / eller subcellulär lokalisering. Förutom cellinjen och transfektionseffektivitet begränsning, till storleken av komplexen renas kan vara ett problem. Denna TAP metod fungerar bra för multi-subenheten proteinkomplex. Från vår erfarenhet, kan fyra komponenter detekteras genom silverfärgning (data ej visade). Men när man använder två-märkta komponenter, andra interactmedlemmarna får inte vara co-renas på samma stökiometriska nivåer. Därför,för denna speciella mål, är användningen av cellinjer som inducerar lägre nivåer av expression av de komplexa komponenter rekommenderas. En annan begränsning skulle vara styrkan av PPI. Om samspelet inte är stabila nog, kan vissa komponenter förloras under reningsstegen (i synnerhet i slut FLAG IP steg).
TAP Metoden har tidigare beskrivits och flera olika epitopmärkningar testades, valideras och jämförs sex. Emellertid är TAP metod som presenteras i denna artikel ny och erbjuder ett enkelt, effektivt, robust och alternativ strategi för att studera protonpumpshämmare, komplex montering, och härleda proteinnätverk sammansättning och funktion. Jämfört med tidigare TAP metoder, ger detta STREP-FLAG TAP strategi för snabb rening av komplex för ytterligare karakterisering utan tidigare kunskap om den komplexa kompositionen, aktivitet eller funktion; och utan behov av proteas klyvning (t.ex., TEV) för eluering av protein (which kan avsevärt minska protein utbyte). Grund av den ökade proteinkomplex återhämtning, Strep-FLAG TAP metod möjliggör också för den robusta identifiering av proteiner som associerar med proteinet komplexet av intresse i celler genom tandemmasspektrometri analys 10, 15. Därefter andra metoder, som konfokal mikroskopi, storleksuteslutande kromatografi, och co-IP-analyser, kan också användas för att validera protonpumpshämmare. Slutligen föreslår vi att en alternativ version av TAP-protokollet skulle kunna anpassas för att rena och studera monteringen av diskreta protein RNA-komplex, som oerhört hjälper forskare inom området för RNA-biologi.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för att rena och karakterisera PPI i däggdjurscellinjer. Vi föreslår att denna metod lägger grunden för framtida karakterisering och funktionell analys av många nya proteinkomplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA Lifesciences | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA Lifesciences | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
