Introduction
편모 모터는 나선형 외 필라멘트를 회전하여 수영을 셀 수 있습니다. 모터가 편모 (즉, 점성 부하)의 소정 기간 동안 생성 할 수있는 토크의 양이 수영 속도를 결정한다. 한편, 회전 방향을 전환 할 수있는 능력은 화학 약품, 화학 주성으로 공지 된 과정에 응답하여 세포 이동을 제어한다. 화성과 운동성되는 독성은 1-3, 편모 모터는 년 4로 잘 특성화 된 요인. 증거 확보 해주기 모터가 mechanosensor 역할을 제안 - 그것은 기계적 고체 기판 -5,6-의 존재를 검출한다. 이 기능은 가능성이 표면 식민지 및 감염 5,7 트리거링에 도움이됩니다. 결과적으로, 모터의 표면과 동수 신호를 감지하여 그에 메커니즘의 중요성 8,9이다.
편모 모터는 쉽게 flagell를 테 더링으로 공부하실 수 있습니다UM 기판에 세포 회전을 관찰. 이러한 테 더링이 먼저 안티 - 후크 항체 (10)와 유리 기판에 polyhook의 대장균에서 돌연변이 성공적으로 연결된 후크와 협력 실버 사이먼에 의해 달성되었다. 속박 세포 분석은 화학 자극의 다양한 모터 스위치의 반응을 연구 연구 할 수 있었다. 예를 들어, Segall와 동료들은 화학적으로 이온 영동 피펫의 도움으로 닿는 세포를 자극. CW 바이어스에 해당 변경 화성 네트워크 (11, 12)에서 적응의 반응 속도를 측정하기 위해 그들을 사용 (시간 모터의 비율은 CW, 시계 방향으로 회전). 닿는 세포 분석은 스위치 응답을 공부에 효과적이지만, 단지 점성로드 (13)의 제한된 범위에서 모터 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있었다. 이 문제를 극복하기 위해 류와 동료들은 표면에 붙어있는 세포 스텁 필라멘트 구면 라텍스 비즈 닿는. 비드이었다다음 약한 광 트랩 (14) 백 초점 간섭을 사용하여 추적. 서로 다른 크기의 구슬과 협력함으로써, 연구진은 부하의 훨씬 넓은 범위에 걸쳐 모터를 연구 할 수있다. 이 분석법 후에 레이저 암시 야 조명과 결합 된 광전자 계 비드 추적 기술을 개발 위안 베르그 향상했다. 외부 점성 저항이 회전 (15, 16)에 내부 점성 저항에 비해 낮았다 너무 작았 닿는 골드 나노 비드 (~ 60 ㎚)의 그들의 방법을 사용 추적. 이 대장균에서 달성 가능한 최대 속도 (~ 300 Hz에서)의 측정을했다. V.의 alginolyticus에서 유사한 비드 분석은 중간 점성 부하 (~ 700 Hz에서) (17)의 회전 속도를 측정 할 수 있었다. (제로로드에서 가까운 매점에) 점성 부하의 전체 가능한 범위에서 모터 반응의 측정을 가능하게함으로써, 비드 분석은 t을 이해하는 중요한 생물 리 학적 도구를 제공orque 생성 프로세스 (18, 19).
최근에, 우리는 각각의 모터 6 정밀 기계적인 자극을 적용 할 수있게 광 핀셋을 포함하도록 위안 - 버그 분석을 수정했습니다. 그들은 점성 부하의 변화에 응답하여 개조 -이 기술을 이용하여, 모터 회전 힘 발전기 동적 mechanosensors이다 것으로 나타났다. 이 메커니즘 불분명 남아 있지만 이러한 하중 감지가 진을 치고 박테리아로 세포 분화를 유발하는 것이 가능하다. 직접적인 증거는 부족하지만 다른 종의 편모 모터는,도 20 mechanosensitive 것으로도 보인다. 여기, 우리는 편모 필라멘트 (15)에 닿는 라텍스 구슬의 회전을 추적하기위한 광전자 기반 (PMT) 접근 방식에 대해 설명합니다. 이 실시간으로 긴 경질 위에 단일 비드를 추적 비교적 간단하기 때문에 초고속 카메라 추적 비교에서, 광전자 - 설치 유리한TIONS. 때문에 환경 자극 (21)에 편모 모터 단지에 리모델링 긴 시간을 공부 할 때 특히 유용합니다. 구체적으로는 E. coli에 대한 우리 상세히 프로토콜이지만, 그들은 용이하게 다른 종 편모 모터 공부하도록 할 수있다.
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Protocol
1. 셀 준비
- 10 mL의 신선한 TB 100 희석 : 1에 접종 한 다음 트립 톤 국물 (TB, 1 % 펩톤, 0.5 % 염화나트륨)에 대립 유전자 15, 22 끈적 끈적한 플릭를 들고 원하는 균주의 야간 문화를 성장. OD 600 = 0.5까지 진탕 배양기에서 33 ° C에서 문화를 성장.
- 1,500 XG에서 세포 펠렛 5-7 분, 재 분산 펠렛 적극적으로 필터 살균 운동 버퍼의 10 ㎖의 (MB를 10 mM의 인산 완충액 : 0.05-0.06 M 염화나트륨, 10-4 M EDTA, 1 μm의 메티오닌, pH가 7.0).
- 단계를 반복 1.2 두 번 더 1 ML의 MB의 마지막 펠릿을 재 분산.
- (- 12cm 길이, 0.58 mm 내경 7) 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21 ~ 23 게이지 어댑터와 함께 두 주사기 사이에 앞뒤로 ~ 75 번 전달하여 정지 전단. 45 초 - (30) 전단의 총 시간을 제한합니다.
- 5-7 분 동안 1,500 XG에서 전단 된 세포를 원심 분리하여 다시 분산MB의 500 μL - 100 펠렛.
2. 슬라이드 준비
- 커버 슬립 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 접착 테이프를 개재하여 촬상 챔버를 준비한다. 화성 분석을 위해, MB, 화학적 자극의 교환을 가능하게하는 미세 유체 챔버를 사용합니다.
- 챔버에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 솔루션을 추가하고 5 분 후 부드럽게 MB와 표면 세척 (80-100 μL)를.
- 챔버 내로 세포 현탁액 40 μL의 추가, 유리 표면에 부착을위한 충분한 시간이 허용 (7-8 분). 다른 측면에서 여과지로 용액을 심지하면서 상기 챔버의 일측에 100 μL를 첨가하여 MB 떨어진 세포를 흐른다.
- 챔버로 라텍스 구슬 15 μL와 비즈를 정착 세포에 부착 할 충분한 시간 수 - 10 추가 (7-8 분). 구슬 떨어진 제거하는 단계 2.3에 설명 된대로 조심스럽게, MB의 100 μL 씻어. 비드 실리콘의 범위를 사용하여좋은 대비를 사용할 정도로 오랫동안 실험 ZES.
3. 비드 추적
- 현미경 스테이지에 샘플을 놓고 모터에 연결된 구슬 위해 표면을 검사합니다. 위상 현미경이 필요하지 않지만 관측을 만들기 위해 40X 위상 목적을 사용합니다. 또한, 너무 오래 충분한 대비가 명확하게 어두운 배경에 밝은 구슬을 구분하기 위해 유지되는 밝은 - 필드 이미징을 사용한다.
- 비드가 선택되면,도 1b에 도시 된 바와 같이 소정의 모서리에 비드를 위치 시키도록 측 방향으로 상기 스테이지를 이동. 같은 코너에 위치 구슬은 구슬의 회전 방향이 제대로 알려져 있는지 확인합니다. 이상적인 비드 궤도는 대략 원형이지만, 타원형 궤도가 허용됩니다.
- 에일리어싱과 연관된 에러를 방지하기 위해 모터의 회전 주파수의 두 배 이상의 샘플링 주파수를 높게 유지. 본 연구에서는으로 회전 된 모터를 사용10 시간 이상 (500 Hz에서)했다 주파수 50 Hz의 시료는 평활 한 신호를 획득한다.
4. 데이터 분석
- 23 필요한 경우 센터는 아핀 변환과 궤적의 PMT 출력 전압과 정확한 타원의 크기를 조절합니다. 회전 속도 (17)를 결정하기 위해 전력 스펙트럼 분석을 사용한다.
- 극 각도 θ (t) = ATAN (Y (t) / X (t))를 결정합니다. 모터 속도의 변화를 확인하고 ω를 계산하여 시간이 지남에 따라 전환
14. - 모터 속도 데이터를 부드럽게 중앙값 필터를 사용한다. 이 전체 회전을 통해 필터 창 (23, 24)를 권장합니다.
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Representative Results
광전자 증 배관 설치는 그림 1A에 표시됩니다. 이는 관심의 PMT가 비드에 의해 산란의 파장 범위에서 높은 감도를 갖는 것이 중요하다. 여기에서 사용되는 PMT가 가시 근적외선 범위에서 동작하고, 할로겐 광원에 의해 조명 비즈 산란광을 검출 할 수 있었다. 최적의 조명 조건 및 공급 전압을 하나의 설정마다 다를 것이다. 이 작업에 사용되는 설정하는 PMT 이득 ~ 들어 4월 10일에서 5월 10일까지 충분히 입증했다. 각각의 광전자는 광전자 앞에 위치하는 3 × 1mm 슬릿 제외 덮었다. 슬릿 광은 광전자 증 배관을 입력 할 수있는 세포 샘플의 영역을 제한하고,이 슬릿은 서로 직교한다. 회전 비드 올바른 위치 (도 1b)에 위치하는 경우, 광전자 증 증가 들어오는 빛의 양이 비드 온다그것의 원형 경로로보기 및 감소에 떨어져보기에서 그것을합니다. 정현파 PMT 전압 출력의 주파수는 회전 속도를 나타내며, 두 신호 사이의 위상 차이는 회전 방향을 나타낸다. PMT를 출력 표시 오실로스코프를 사용하면 실시간으로 비드 궤적의 시각화를 가능하게한다.
대표적인 모터로부터 시변 PMT 신호 Y (t)이고, x (t)는,도 2a에 도시된다. 두 슬릿의 직교성 두 신호 사이의 위상 지연을 도입한다. 신호 진폭은 신호 - 대 - 잡음비는 물론 회전 편심에 의존한다. 비드의 대응 궤적은 그림 2B에 표시됩니다.
최 회장의 대표 모터에서 측정 한 속도의 히스토그램 - 삭제 된 균주도 3a에 도시된다 (25)가 닿는 모터 이전보고와 일치한다. 그림 1B의 회로도와 같이 비드 먼저, 오른쪽 하단에 위치했다. 해당 각속도는 그림 3B (상단 패널)에 표시됩니다. 인접한 왼쪽 하단에 구슬의 위치는 모터 속도에 기호 (하단 패널)의 반전 결과. 따라서, 인접한 코너로 구슬을 이동하는 모터 회전의 관측 방향을 변경합니다. 이와 관련하여, 대각선으로 대향하는 코너는 동일하다. 올바르게 스위칭 역학을 결정하기 위해 측정시 비드의 위치를 알기 때문에 중요하다. 도 3c는 회전의 두 방향 사이의 야생형 모터 반복 천이를 나타낸다.
데이터 수집 소프트웨어에 대한 사용자 지정 코드가 컴퓨터 (15) 상에 데이터를 기록하기 전에 작업에서 적응되었다. PMT를 출력 AC 결합하고, 저역 100 Hz의 컷오프 주파수로 여과 하였다. 실시간 추적은 오실로스코프에 필터링 된 출력을 연결하여 사용 하였다.
그림 1 : 구슬-추적 설정. PMT를 기반 추적 설정의 A) 도식. B) 두 개의 수직 슬릿에 비드 (검정 구) 상대의 이상적인 위치. 궤적은 점선으로 표시된다. 편심 E는 점선 원의 반경이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : PMT를 출력합니다. A) 로우 패스를 중심으로 / 스케일링 후, 두 광전자 증 배관에서 출력을 필터링. B) (3) (S)를 통해 샘플링 된 PMT 데이터로부터 얻어진 비드 궤적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 구슬 궤적. A) 대표 모터의 CCW 전용 속도의 히스토그램. B) 오른쪽 하단 (상단 패널)에 군데 CCW 전용 모터의 회전 속도. 같은 모터의 회전 속도는 왼쪽 하단 (하단 패널)에 위치 할 때. 기음) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
테더 비드 추적 모터 토크의 정확한 추정을 용이하게하기 위해, 다음과 같은 정보가 검토되어야한다. flagellated 세포 이러한 측정을 수행 할 때, 전단은 중요한 단계입니다. 전단시켜 상기 모터의 점성 부하가 비드에 주로 기인하고 10 %의 오차 (16)에서 추정 될 수 있도록, 단순한 스터브로 편모 필라멘트를 감소시킨다. 양털 깎기도 밀접하게 분산 기행 (<비드 직경 14)와 원형 궤적을 찾는 기회를 향상시킨다. 추적 및 점성 드래그를 계산할뿐만 아니라 열악한 신호 대 잡음비의 결과에 오류를 화합물 제멋대로 궤적 부적절한 전단 결과. 오실로스코프의 사용은 이러한 데이터를 신속하게 제거 할 수 있습니다. 편모 필라멘트의 생체 역학적 특성은 종에 따라 다양 할 것으로 예상되기 때문에, 전단 방법 가능성 t에 충분한 전단력을 보장하도록 구성 될 필요그는 관심의 박테리아. 셔링과 연관된 에러를 감소시키는 효과적인 방법은 필라멘트 단백질을 인코딩하는 유전자를 결여 세포에서 작동한다. 프로브 비드 다음 방지 훅 항체 통해 고리에 직접 부착 될 수있다.
적절 어려울 수 있습니다 닿는되는 구슬을 찾기. 시야 가장 비드 어느 균체 또는 유리 표면에 부착되기 때문이다. 이러한 구슬은 쉽게 날카로운 초점을하게 될 수있다. 다른 구슬 진동 나타나거나 큰 진폭 또는 대형 기발로 눈에 띄게 회전합니다 (> 1.5 - 2 배 비드 직경). 이들은 일반적으로 완전히 전단 또는 초점면에 기울어 진 평면에서 회전되지 않은 필라멘트를 편모에 닿는입니다. 이러한 구슬의 샘플링은 일반적으로 높은 잡음이 발생할 것이며, 점성 부하의 시간 변화는 주어진 비드 크기의 모터 토크의 과소 평가 될 수 있습니다. 곁에 구슬의 작은 부분은 임의 받게 될 것이다운동; 이 단지 브라운 회전을 겪고있다. 구슬의 비율은 흐리게 표시되며 쉽게 초점 상태로 만들 수 없습니다. 이 적절하게 닿는 관심있는 모터입니다 된 모터가 될 가능성이 높습니다.
여기에 설명 된 바와 같은 추적 단일 모터의 한계 중 높은 처리량 실험을 수행 할 수 없다는 것이다. 그 이미지 고속 카메라는 관심의 큰 영역이 점에서 유리할 수있다. 다른 제한은 여러 신호가의 PMT의 시야에 밀접하게 이격 된 회전 구슬 인해 발생과 관련된 오류를 포함한다. 마지막으로, 두 개의 광전자 슬릿에 대하여 기록 된 비드의 정확한 위치 결정에 오차가 스위칭 역학의 부정확 한 추정을 초래한다.
여기에 설명 된 설정의 장점은 오랜 기간 동안 실시간으로 비드의 회전을 추적 할 수있는 능력을 포함한다. 이오류가 발생하기 쉬운 궤도의 신속한 제거, 아마 어려운 초고속 카메라를 달성하기 위해 뭔가를 할 수 있습니다. 또한 약간의 수정이 설정은 다양한 자극에 세포를 환자에게 설계된 분석법으로 통합 될 수있다. 열전기 냉각 (26)이 결합 된 기술은 열 자극에 대한 개별 모터의 응답을 측정하기 위해 사용될 수있다. 최근 6 완료 한 바와 같이 광학 핀셋과의 통합, 기계적 자극에 반응하여 개별 모터의 리모델링의 측정을 활성화 할 수 있습니다. 최종적으로, 화학적 자극에 모터의 적응 적절한 관류 챔버를 이용하여 측정하고, 11 펌프 될 수있다.
알려진 박테리아 종의 대부분은 운동성이 있고 편모 매개 운동은 자연 지배적이다. 여기서 보여준 방법의 구조적 리모델링 통찰력 개발 및 적응성 O 돕기 계속 예상편모 모터 (F).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
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