Introduction
Flagel motorer aktiverer celler til at svømme ved roterende spiralformede ekstracellulære filamenter. Mængden af moment motoren kan generere for en given længde af flagel (dvs. den tyktflydende belastning) bestemmer svømning hastigheder. På den anden side, dets evne til at skifte rotationsretning styrer cellemigrering som respons på kemikalier, en proces kendt som kemotaksi. Kemotaksis og motilitet er virulensfaktorer 1-3, flagel motorer er blevet godt karakteriseret årene 4. Montering tyder nu at motoren fungerer som en mechanosensor - det mekanisk detekterer tilstedeværelsen af faste substrater 5,6. Denne evne sandsynligvis hjælper i udløsning overflade kolonisering og infektioner 5,7. Som et resultat heraf de mekanismer, hvorved motoren sanser overflader og initierer signalering er af betydning 8,9.
Den flagellært motor kan let studeres ved tethering den flagellum til et substrat og observere celle rotation. Opbindingen blev først opnået ved Silverman og Simon, der arbejdede med en polyhook mutant i E. coli og held knyttet kroge til glassubstrater med anti-hook antistoffer 10. Den bundne-celle-assay aktiveret forskere til at studere svarene fra motor-kontakten til en række forskellige kemiske stimuli. For eksempel Segall og medarbejdere kemisk stimuleret tøjrede celler ved hjælp af iontoforetiske pipetter. De tilsvarende ændringer i CW bias (den del af den tid motorerne spinde med uret, CW) muligt for dem at måle kinetikken af tilpasning i kemotaksi netværket 11,12. Mens den tøjret celle assay var effektiv i at studere switch svar, det var kun i stand til at tilbyde indsigt i motor mekanik i et begrænset udvalg af viskose belastninger 13. For at overvinde dette problem, Ryu og medarbejdere tøjret sfæriske, latex perler til at filament stubbe på celler fast til overflader. Perlerne blevderefter spores ved hjælp back-fokal interferometri med svage optiske fælder 14. Ved at arbejde med perler i forskellige størrelser, kunne forskerne studere motoren over et meget bredere vifte af belastninger. Dette assay blev senere forbedret af Yuan og Berg, som udviklede en fotomultiplikator-baserede perle-sporing teknik kombineret med belysning laser mørk-felt. Deres metode sporing af tøjrede guld nanobeads, der var så lille (~ 60 nm), at de eksterne viskøse modstand var lavere i forhold til de interne viskose modstande mod rotation 15,16. Dette førte til målingerne af de bedst mulige hastigheder i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, lignende perle analyser aktiveret målinger af spinning satser ved mellemliggende viskose belastninger (~ 700 Hz) 17. Ved at aktivere målinger af motoriske respons over hele mulige udvalg af tyktflydende belastninger (fra nul-belastning til nær-stall), de perle-analyser forudsat et vigtigt biofysisk værktøj til at forstå torque generation proces 18,19.
For nylig har vi ændret Yuan-Berg analysen til også at omfatte optisk pincet, der gjorde det muligt at anvende præcise mekaniske stimuli til individuelle motorer 6. Med denne teknik, viste vi, at kraft-generatorer, der roterer motoren er dynamiske mechanosensors - de remodel som reaktion på ændringer i viskose belastninger. Det er muligt, at en sådan selvjusterende udløser celle differentiering til sværmende bakterier, selv om de mekanismer fortsat uklare. Det er også sandsynligt, at de flagel motorer i andre arter er også mekanosensitive 20, selv om der mangler direkte bevis. Her diskuterer vi fotomultiplikator-baserede (PMT) tilgang til sporing af rotation af latexperler tøjret til flagel filamenter 15. I forhold til sporing med ultrahurtig kameraer, fotomultiplikator-setup er fordelagtigt, fordi det er relativt ligetil at spore enkelt perler i realtid og over lang durationer. Det er især nyttigt, når man studerer lang tid remodeling i flagel motordrevne komplekser på grund af miljømæssige stimuli 21. Selvom vi detalje protokoller specifikt for E. coli, kan de let tilpasses til at studere flagel motorer i andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Fremstilling
- Vokse natten kulturer af den ønskede stamme, som bærer sticky FLIC allel 15,22 i trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl) efterfulgt af podning ved 1: 100 fortynding i 10 ml frisk TB. Grow kulturen ved 33 ° C i en rysteinkubator, indtil OD600 = 0,5.
- Pelletere cellerne ved 1.500 xg 5 - 7 min og re-dispergere pelleten kraftigt i 10 ml filtersteriliseret motilitet puffer (MB; 10 mM phosphatbuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 pM methionin, pH 7,0).
- Gentag trin 1.2 to gange mere og re-dispergere endelige pellet i 1 ml MB.
- Forskyde suspensionen ved at passere frem og tilbage ~ 75 gange mellem to sprøjter med 21 til 23 gauge adaptere forbundet af polyethylenrør (7 - 12 cm lange, 0,58 mm indre diameter). Begræns den samlede tid for klipning til 30 - 45 s.
- Centrifuger klippede celler ved 1.500 xg i 5-7 min og re-dispergerepellet i 100 - 500 pi MB.
2. Skyd Forberedelse
- Forbered en imaging kammer ved sandwich to dobbeltsidede klæbebånd mellem et cover-slip og et objektglas. For kemotaksiassays, anvender nogen mikrofluid kammer, som muliggør udveksling af MB og kemiske stimulanser.
- Tilføj 0,01% poly-L-lysin opløsning i kammeret og efter 5 min forsigtigt skylle overfladerne med MB (80 - 100 pi).
- Tilsæt 40 pi af cellesuspensionen ind i kammeret og give tilstrækkelig tid til fastgørelse til glasoverfladen (7 - 8 min). Strømme ud galt celler ved tilsætning af 100 pi MB på den ene side af kammeret, mens vægevirkning af opløsningen med et filtrerpapir fra den anden side.
- Tilsæt 10 - 15 uL af latexperler ind i kammeret og tillade perlerne tilstrækkelig tid til at bosætte sig og knytte til cellerne (7 - 8 min). Forsigtigt skylles med 100 pi MB, som beskrevet i trin 2.3, til fjernelse galt perler. Brug en række perle-sizes for eksperimenterne så længe en god kontrast er tilgængelig.
3. Bead Tracking
- Anbring prøven på et mikroskop scene og scanne overfladen for perler knyttet til motorer. Brug en 40X fase målsætning at fremsætte bemærkninger, selvom fase mikroskopi ikke er nødvendig. Alternativt kan ansætte lyse-field imaging, så længe tilstrækkelig kontrast er vedligeholdt til klart at skelne en lys perle på en mørk baggrund.
- Når en perle er blevet valgt, flytte scenen lateralt at placere vulsten i en forudbestemt hjørne som vist i figur 1B. Position perler på samme hjørne for at sikre, at rotationsretningen af perlen er korrekt kendt. Den ideelle perle bane er omtrent cirkulær men elliptiske baner kan realitetsbehandles.
- Oprethold samplingfrekvensen højere end to gange rotationsfrekvens motoren for at undgå fejl i forbindelse med aliasing. I dette arbejde, anvende en motor, der blev roterer med50 Hz og prøve ved frekvenser, der var 10 gange højere (500 Hz) til opnåelse af en glat signal.
4. Data Analysis
- Center og skalere PMT udgangsspændinger og korrekte ellipticitet i baner med affine transformationer, hvis nødvendigt 23. Brug en strømforsyning spectrum analyse for at bestemme rotationshastigheder 17.
- Bestem polære vinkler, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestem variationerne i motorhastigheder og skifte over tid ved at beregne ω
14. - Ansætte en median filter til at udjævne data motorhastighed. Et filter vindue over to fulde omdrejninger anbefales 23,24.
14. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opsætningen fotomultiplikator er vist i figur 1A. Det er vigtigt, PMT'erne har høje følsomheder over området af bølgelængder spredes af perlerne af interesse. PMT'erne her benyttede operere i det synlige og nær-infrarøde område, og var i stand til at detektere lys spredt af perler belyst af en halogen lyskilde. De optimale lysforhold og forsyningsspændinger vil variere fra opsætningen til en anden. For opsætningen anvendes i dette arbejde, en PMT gevinst ~ 10 April - 10 Maj viste sig tilstrækkelig. Hver fotomultiplikator blev dækket med undtagelse af en 3 x 1 mm spalte anbragt foran fotomultiplikator. Slidserne begrænse regionen i celle- prøve fra hvilken lys kan komme ind fotomultiplikatorerne, og de to slidser er ortogonale til hinanden. Når en roterende kugle er anbragt på den korrekte placering (figur 1B), mængden af lys ind fotomultiplikatoren stiger, perlen kommeri visningen og falder som sin cirkulære bane tager det væk fra visningen. Hyppigheden af de sinusformede PMT spændingsudgange indikerer rotationshastigheden og faseforskellene mellem de to signaler angiver rotationsretningen. Anvendelsen af et oscilloskop for at vise PMT udgangene muliggør visualisering af perle baner i realtid.
De tidsvarierende PMT-signaler, y (t) og x (t), fra en repræsentativ motor er vist i figur 2A. Ortogonaliteten af de to spalter indfører en faseforsinkelse mellem de to signaler. Signalamplituderne afhænger af signal-til-støj-forhold samt excentricitet rotation. De tilsvarende baner vulsten er angivet i figur 2B.
Et histogram af de hastigheder, målt fra et repræsentativt motoren i en Chey - deleterede stamme er vist i figur 3A 25. Perlen blev først placeret i nederste højre hjørne, som det ses i den skematiske i figur 1B. Den tilsvarende vinkelhastighed er vist i figur 3B (øverste panel). Positionering perlen til den tilstødende nederste venstre hjørne resulterede i inversion af tegnet på motorhastigheder (nederste panel). Således vil flytte vulsten til en tilstødende hjørne ændre den observerede omløbsretningen. I denne henseende diagonalt modsatte hjørner er identiske. Det er derfor afgørende at kende placeringen af perlen under målingerne til at bestemme skifte dynamik korrekt. Figur 3C viser gentagne overgange af en vildtype motor mellem de to omdrejningsretninger.
Brugerdefinerede koder for data-erhvervelse software blev tilpasset fra tidligere arbejde til at registrere data på en computer 15. PMT output blev AC-koblet og lavpasfiltreres med en afskæringsfrekvens på 100 Hz. Real-time tracking blev aktiveret ved at forbinde de filtrerede udgange til et oscilloskop.
Figur 1: Bead-tracker Setup. A) Skematisk af PMT-baseret sporing setup. B) Den ideelle position af vulsten (sort område) i forhold til de to ortogonale spalter. Bane er angivet ved de punkterede linjer. Excentriciteten e er radius af den stiplede cirkel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PMT udgange. A) lavpasfiltreres udgange fra de to fotomultiplikatorer, efter centrering / skalering. B) vulsten baner opnået fra PMT data, indsamlet i løbet 3 s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bead Trajectories. A) Histogram af CCW-only hastigheder på en repræsentativ motor. B) rotationshastigheder af en CCW kun motor afbildet på nederste højre hjørne (øverste panel). Rotationshastigheder af samme motor, når placeret i nederste venstre hjørne (nederste panel). C) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at lette tøjret perle-sporing og korrekt vurdering af motor-momenter, skal følgende oplysninger revideres. Når der udføres disse målinger med pisket celler, klipning er et afgørende skridt. Klipning reducerer filament flagellært til en simpel stub, hvorved det sikres, at den viskose belastning på motoren skyldes overvejende perlen og kan estimeres inden for 10% fejl 16. Shearing også forbedrer chancerne for at finde cirkulære baner med tæt fordelte særheder (<perle diameter 14). Forkert klipning resultater i egensindige baner, hvilke forbindelser fejl i sporing og i beregningen af tyktflydende sug, samt resulterer i dårlige signal-støj-forhold. Brugen af et oscilloskop muliggør hurtig eliminering af sådanne oplysninger. Da forventes biomekaniske egenskaber af flagel filamenter at variere med arter, klipning metoder vil sandsynligvis skal være indrettet til at sikre tilstrækkelig forskydning i than bakterier af interesse. En effektiv måde at reducere fejl i forbindelse med forskydning er at arbejde med celler, som mangler gener, der koder for endeløse proteiner. Probe perler kan derefter fastgøres direkte på krogen via anti-hook-antistoffer.
At finde en perle, der er passende tøjret kan være udfordrende. Dette er fordi de fleste perler i synsfeltet enten vil blive hængende til cellelegemer eller glasoverfladen. Sådanne perler kan let bringes i skarp fokus. Andre perler vil synes at vibrere eller rotere synligt med store amplituder eller store særheder (> 1,5 - 2x perle diameter). Disse er typisk bundet til flagel filamenter, der ikke er fuldt klippede eller roterer i et plan, som er skråtstillet til brændplanet. Sampling af sådanne perler vil typisk resultere i højere støj, og tid-variationer i viskose belastninger kan resultere i en undervurdering af motorer momenter for en given perle-størrelse. En lille del af tøjrede perler vil undergå tilfældigbevægelse; disse er blot undergår brownske rotation. En brøkdel af perlerne vil blive vist sløret, og kan ikke indbringes i fokus nemt. Disse er mest sandsynligt, at motorer, som er blevet bindes hensigtsmæssigt og er motorerne af interesse.
Blandt de begrænsninger af enkelt-motor sporing såsom den er beskrevet her, er den manglende evne til at udføre høj-throughput eksperimenter. En højhastigheds-kamera, der billeder et større område af interesse kan være fordelagtigt i denne henseende. Andre begrænsninger omfatter fejl i forbindelse med flere signaler, der udspringer af tætliggende roterende perler i synsfeltet af PMT'erne. Endelig vil fejl i bestemmelsen af den korrekte position af det optagede vulst med hensyn til de to fotomul- slidser resultere i upræcise skøn over switching dynamik.
Fordele ved opsætningen beskrevet her omfatter evnen til at spore rotation af perlerne over lange varigheder og i realtid. Dennemuliggør hurtig eliminering af fejlbehæftede baner, noget der måske vanskeligt at opnå med ultrahurtige kameraer. Derudover, med et par ændringer denne opsætning kan integreres med analyser udformet til at underkaste celler til en række stimuli. Kombineret med termoelektrisk afkøling 26 kan teknikken anvendes til at måle responser af individuelle motorer til termiske stimuli. Integration med optisk pincet kan aktivere målingerne af ombygning af individuelle motorer som reaktion på mekaniske stimuli, som det er sket for nylig 6. Endelig kan tilpasningen af motoren til kemiske stimulanser måles med anvendelse af en passende perfusionskammeret og pumper 11.
Et flertal af kendte bakteriearter er bevægelige og flagellært-medieret motilitet er fremherskende i naturen. Metoderne demonstreret her forventes at fortsætte for at hjælpe med udviklingen af indsigt i strukturel-remodellering og tilpasningsevne of den flagellært motor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
