Introduction
鞭毛马达使细胞通过旋转螺旋灯丝外游。转矩的电动机可产生用于鞭毛（ 即 ，粘性载荷）的给定长度的量决定了游泳速度。另一方面，其可切换旋转方向的能力控制响应于化学物质，被称为趋化处理细胞迁移。趋化和运动是毒力因子1-3，鞭毛马达已良好的特点，多年来4。越来越多的证据现在表明电动机充当mechanosensor -它机械地检测固体基材5,6的存在。这种能力可能有助于触发表面定植和感染5,7。其结果是，由此，电动机感应表面，并发起信令的机制意义8,9。
该鞭毛马达可通过圈养的flagell很容易研究微米到衬底上并观察细胞的旋转。这种束缚首先由西尔弗曼和Simon，谁在大肠杆菌 polyhook突变体，并成功地附着钩玻璃基板用抗钩抗体10的工作来实现。拴系细胞测定法使研究人员能够电动开关的响应研究的各种化学刺激。例如，西格尔和同事化学刺激的拴系细胞用离子电渗疗法移液器的助剂。在CW 偏置相应的变化（时间电机的部分按顺时针方向旋转，CW）使他们能够衡量网络的趋化性11,12适应的动力学。而拴系细胞测定是有效的学习开关响应，那也只是能提供分析上市马达力学上的粘性负载13的一个有限的范围内。为了克服这个问题，柳和同事拴球形，乳胶珠灯丝上粘到表面上的细胞存根。将珠然后使用后焦干涉与微弱光陷阱14跟踪。通过与不同大小的珠子时，研究人员可以研究电机在更宽的负载范围。此法后来被元和Berg，谁开发基于光电倍增管珠，跟踪技术与激光暗视场照明相结合的提高。他们的方法启用的系留黄金纳米珠说人话的小（〜60纳米），相比内部电阻粘稠旋转15,16外部电阻粘性较低的跟踪。这导致在大肠杆菌中可达到的最大速度（〜300赫兹）的测量结果。在溶藻弧菌 ，在中间的粘性负载（〜700赫兹）17启用类似珠检测纺纱率的测量。通过使电动机响应的测量结果在整个可能范围的粘性载荷（从零负载到近失速），珠的测定法提供了一个重要的生物物理工具来了解第torque生成过程18,19。
最近，我们修改了元伯格法包括使我们能够精确的机械刺激适用于单个电机6光学镊子。使用这种技术，我们发现，该旋转电机的力发电机是动态mechanosensors - 它们响应于粘性载荷变化重塑。这可能是这样的负荷感测触发细胞分化成蜂拥细菌，虽然机制尚不清楚。它也可能是在其他物种的鞭毛电机也机械敏感20，虽然直接的证据不足。在这里，我们讨论了跟踪拴鞭毛细丝15乳胶颗粒旋转基于光电倍增（PMT）的方法。相比于与超快摄像机跟踪，光电倍增管，设置是有利的，因为它是相对简单的实时和在长硬脑膜跟踪单个珠系统蒸发散。研究长期在鞭毛马达络合物重塑由于环境刺激21时，它是特别有用的。虽然专门为大肠杆菌我们详细介绍的协议，它们可容易地适用于其它物种研究鞭毛电机。
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Protocol
1.细胞的制备
- 生长所需的应变在胰蛋白胨肉汤（TB，1％胨，0.5％氯化钠），随后接种于1等位基因15,22携带粘的fliC的过夜培养物：100稀释在10mL新鲜结核病。生长的培养物在33℃下在摇床培养箱直到OD 600 = 0.5。
- 沉淀细胞在1500×g离心5 - 7分钟和重新分散沉淀大力在10mL过滤灭菌蠕动缓冲器（MB; 10mM磷酸盐缓冲液：0.05-0.06 M氯化钠，10 -4 M EDTA，1μM的蛋氨酸， pH为7.0）。
- 重复步骤1.2两次并重新分散于1mL MB为最终的沉淀。
- （ - 19厘米长，0.58内径7）由两个注射器之间来回传递〜75倍，由聚乙烯管连接21至23号的适配器剪切停牌。限制的总时间剪切到30 - 45秒。
- 离心剪切细胞以1500 xg离心5-7分钟，并再分散的颗粒在100 - 500μLMB的。
2.将准备
- 由盖防滑和显微镜载玻片之间夹在2张双面粘合带制备的成像室中。对于趋化性测定法，使用任何微流体室，使MB的和化学刺激物的交换。
- 添加0.01％聚-L-赖氨酸溶液在腔室中，5分钟后轻轻冲洗以MB为表面（80 - 100微升）。
- 添加细胞悬浮液的40微升到室中，并允许有足够的时间用于附着到玻璃表面（7 - 8分钟）。通过在腔室的一侧加入100微升MB的，而芯吸距离的另一侧用滤纸将溶液流出粘住细胞。
- 添加10 - 的胶乳珠15微升到室中，并允许珠粒足够的时间来解决，并连接到细胞中（7 - 8分钟）。用100微升MB的轻轻冲洗，如在步骤2.3中所述，以除去未粘住珠。使用范围珠硅ZES的实验，只要一个良好的对比度是可用的。
3.珠跟踪
- 放置在显微镜载物台上的样本和扫描表面为连接至马达珠。使用40X阶段目标进行观察，虽然相差显微镜是没有必要的。另外，采用亮场成像，只要足够的对比度保持明确区分一个黑暗的背景上用亮珠。
- 一旦珠已被选择，移动台横向以预定的角胎圈定位为如图1B所示。在相同的角位置珠，以确保胎圈的旋转方向正确知的。理想的珠轨迹近似圆形的椭圆形，但轨迹是受理。
- 保持采样频率的两倍的马达，以避免与混叠相关联的错误的旋转频率高。在这项工作中，使用的是在旋转的电机在该均高10倍（500赫兹）的频率50 Hz和样品，以获得平滑的信号。
4.数据分析
- 中心，如果需要23缩放轨迹的PMT输出电压和正确的椭圆与仿射变换。使用功率谱分析，以确定旋转速率17。
- 确定的极角，θ（T）= ATAN（Y（T）/ X（t））。确定变化的电动机速度和通过计算ω切换时间
14。 - 采用中值滤波器平滑电动机速度数据。在两整圈的过滤器窗口，推荐23,24。
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Representative Results
的光电倍增管设置示于图1A。重要的是，所述光电倍增管具有在由所感兴趣的珠散落的波长范围内的高灵敏度。这里使用的光电倍增管在可见光和近红外范围内工作，并能够检测由被卤素光源照射珠散射光。最佳的照明条件和电源电压的变化会从一个设置到另一个。对于在这项工作中所使用的安装，一个PMT增益〜4月10日至5月10日被证明足够。每个光电倍增管覆盖除位于光电倍增管的前面有一个3×1毫米的切口。狭缝限制从该光可以进入光电倍增管的细胞样品中的区域上，并且两个狭缝是彼此正交。当一个旋转胎圈被定位在正确的位置（ 图1B），光的进入光电倍增管的量增加为胎圈来在视图中，并减少其圆形路径采取它远离视图。正弦PMT电压输出的频率表示旋转速度和两个信号之间的相位差表示旋转方向。显示的PMT输出使用示波器能够实时珠轨迹的可视化。
随时间变化的光电倍增管的信号，Y（t）和X（t）的，从一个代表电动机示于图2A。两个缝隙的正交介绍了两个信号之间的相位滞后。的信号幅度依赖于信噪比以及旋转的偏心。胎圈的相应的轨迹在图2B中被指示。
从在一个崔泰源一个代表电机测量的速度的直方图-缺失株在图3A所示25马达以前的报告一致。珠首先定位在右下角，如在图1B中示意性所示。相应的角速度如图3B（顶面板）。定位珠到相邻的左下角导致在电动机速度的符号（底部面板）的反转。因此，胎圈移动到相邻的角将改变电机旋转观测方向。在这方面，对角是相同的。因此，至关重要的过程中测量知道珠的位置来正确地确定开关动力学。 图3C示出旋转的两个方向之间的野生型电动机的重复转换。
对于数据采集软件的定制代码是从以前的工作适于记录在计算机15上的数据。光电倍增管输出被交流耦合和低通带100赫兹的截止频率滤波。实时跟踪由滤波输出连接到示波器启用。
图1： 珠跟踪器设置。 A）基于PMT跟踪设置示意图。 B）的胎圈（黑球）相对于两个正交狭缝的理想位置。轨迹由虚线指示。偏心量e为虚线圆的半径。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：PMT 输出。 A）低通来自两个光电倍增管滤波输出，定心/缩放后。 B）从PMT的数据，取样超过3秒获得的珠轨迹。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 珠轨迹。 A）有代表性的电机只CCW-速度直方图。 B）在右下角（上图）成像仅CCW-电机的旋转速度。同一电动机的旋转速度，当位于左下角（底部面板）。 C） 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
为了便于拴珠跟踪和电机扭矩的正确估计，下面的信息进行审查。当与有鞭毛的细胞执行这些测量，剪切是一个关键步骤。剪切降低了鞭毛丝到仅仅存根，从而确保电机的粘性载荷主要是由于胎圈和可在10％的误差16内进行估计。剪切还改善寻找具有紧密分布的偏心（<珠粒径14）的圆形轨迹的机会。不当的剪切导致任性轨迹，这在跟踪和粘阻力的计算，以及导致差信号噪声比化合物误差。利用示波器允许这些数据的快速消除。由于鞭毛长丝的力学性能，都可与物种而变化，剪切方法将很可能需要适应以确保在T足够剪切他感兴趣的细菌。减少与剪切相关联的错误的有效方法是使用缺乏编码的丝蛋白的基因的细胞来工作。探针珠粒然后可以直接连接到通过抗钩抗体钩。
发现适当拴是具有挑战性的珠。这是因为，在视场最珠粒要么被粘贴到细胞体或玻璃表面。这样的珠可以很容易地进入大家关注的焦点。其他珠子会出现振动或大振幅或大偏心旋转明显（> 1.5 - 2珠子直径）。这些都是典型的拴鞭毛尚未完全地剪切或在倾斜于焦平面的平面旋转的长丝。这种珠粒采样典型地将导致更高的噪声，并在粘性负载时间的变化，可能会导致在电机转矩的一个给定的珠尺寸的低估。的拴珠一小部分将进行随机运动;这些仅仅是正在进行布朗转动。珠子一小部分会出现模糊，无法在重点轻易提起。这些最有可能是已经适当地拴和感兴趣的电动机的电动机。
间单马达的跟踪如这里所描述的一个局限性是不能进行高通量实验。一个高速相机拍摄的图像的兴趣更大区域可以在这方面是有利的。其它限制包括与多个信号中的视图中的光电倍增管的领域所产生的紧密间隔开的旋转珠相关的错误。最后，在判定所记录的胎圈的正确位置的误差相对于两个光电倍增狭缝将导致开关动力学的不精确估计。
此处描述的设置的优点包括跟踪珠的旋转在长持续时间和实时时间的能力。这个使容易出错的轨迹快速消除，而这可能难以实现的超快摄像机。此外，一些简单修改这个设置可以与旨在受到细胞对各种刺激的测定结合。与热电冷却26相结合，该技术可以被用来测量单个电机来热刺激的反应。光学镊子集成可以使各个电动机的重构的测量响应于机械性刺激，因为最近已经6完成。最后，马达化学兴奋剂的适配可以通过使用适当的灌注腔的被测量和泵11。
大多数已知的细菌种类能运动和鞭毛介导的运动在本质上是占主导地位。预计这里展示的方法来继续见解发展成为结构重塑和适应性Ò帮助F中的鞭毛马达。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
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