Introduction
motores flagelares permiten a las células a nadar girando filamentos helicoidales extracelulares. La cantidad de par de torsión que el motor puede generar para una longitud dada del flagelo (es decir, la carga viscosa) determina las velocidades de natación. Por otro lado, su capacidad para cambiar el sentido de giro controla la migración de células en respuesta a productos químicos, un proceso conocido como la quimiotaxis. La quimiotaxis y la motilidad ser factores de virulencia 1-3, motores flagelares han sido bien caracterizado en los años 4. La evidencia creciente sugiere ahora que el motor actúa como un MechanoSensor - detecta mecánicamente la presencia de sustratos sólidos 5,6. Esta capacidad ayuda a probable en el desencadenamiento de la colonización de la superficie y las infecciones de 5,7. Como resultado, los mecanismos por los que el motor sentidos superficies e iniciados de señalización son de importancia 8,9.
El motor flagelar se puede estudiar fácilmente por la inmovilización del flagellum a un sustrato y la observación de la rotación de la célula. Dicha inmovilización se logró por primera vez por Silverman y Simon, que trabajó con un mutante polyhook en E. coli y ganchos conectados correctamente a sustratos de vidrio con anticuerpos anti-gancho 10. El ensayo de células tethered permitió a los investigadores estudiar las respuestas del motor-switch a una variedad de estímulos químicos. Por ejemplo, Segall y compañeros de trabajo estimularon células químicamente atados con la ayuda de pipetas iontoforéticos. Los cambios correspondientes en el sesgo de CW (la fracción de los motores giran las manecillas del reloj de tiempo, CW) les permitió medir la cinética de la adaptación en la red quimiotaxis 11,12. Si bien el ensayo de células tethered fue eficaz en el estudio de las respuestas de conmutación, sólo fue capaz de ofrecer una visión de la mecánica de motor en un intervalo limitado de cargas viscosos 13. Para superar este problema, Ryu y compañeros de trabajo conectado al ordenador, perlas de látex esféricas al filamento talones en las células pegadas a las superficies. Las perlas sea continuación, seguido utilizando interferometría de back-focal con trampas ópticas débiles 14. Al trabajar con los granos de diferentes tamaños, los investigadores pudieron estudiar el motor a través de una gama mucho más amplia de cargas. Este ensayo fue mejorada por Yuan y Berg, quien desarrolló una técnica de talones de seguimiento basado en fotomultiplicador combinado con iluminación láser de campo oscuro. Su método de seguimiento habilitado de nanobeads atados de oro que eran tan pequeña (~ 60 nm) que las resistencias externas viscosos eran más bajos en comparación con las resistencias internas viscosos a la rotación 15,16. Esto dio lugar a las mediciones de las velocidades máximas alcanzables en E. coli (~ 300 Hz). En V. Alginolyticus, ensayos de cuentas habilitadas similares mediciones de las velocidades de giro en cargas intermedias viscosos (~ 700 Hz) 17. Al permitir que las mediciones de las respuestas motoras sobre toda la gama posible de cargas viscosas (de carga cero a casi parada), el cordón-ensayos proporcionados en una importante herramienta de biofísico para entender la torque proceso de generación 18,19.
Recientemente, hemos modificado el ensayo de Yuan-Berg incluir pinzas ópticas que nos permitieron aplicar estímulos mecánicos precisos para motores individuales 6. Usando esta técnica, hemos demostrado que la fuerza de los generadores que giran el motor son mechanosensors dinámicos - se remodelan en respuesta a los cambios en las cargas viscosas. Es posible que tal de detección de carga provoca la diferenciación celular en bacterias que pululan, aunque los mecanismos no están claros. También es probable que los motores flagelares en otras especies también son mechanosensitive 20, aunque se carece de evidencia directa. A continuación, se discute el enfoque basado en el fotomultiplicador (PMT) para el seguimiento de la rotación de cuentas de látex atados a los filamentos flagelares 15. En comparación con el seguimiento con cámaras ultrarrápidos, el fotomultiplicador-configuración es ventajosa debido a que es relativamente sencillo para realizar el seguimiento perlas individuales en tiempo real y más largo duraciones. Es particularmente útil en el estudio de la remodelación a largo tiempo en los complejos de motor flagelar debido a los estímulos del medio ambiente 21. A pesar de que los protocolos de detalle específicamente para E. coli, que pueden adaptarse fácilmente para el estudio de motores flagelares en otras especies.
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Protocol
1. Preparación de la célula
- Crecer cultivos de una noche de la cepa deseada que lleva el alelo pegajosa fliC 15,22 en triptona Broth (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguido de la inoculación a 1: 100 dilución en 10 ml de TB fresco. Mantener el cultivo a 33 ° C en un incubador con agitación hasta una DO600 = 0,5.
- Sedimentar las células a 1500 x g durante 5-7 min y re-dispersar el sedimento vigorosamente en 10 ml de tampón de motilidad filtro esterilizado (MB; tampón fosfato 10 mM: NaCl 0,05 a 0,06 M, 10 -4 M EDTA, 1 mM de metionina, pH 7,0).
- Repita el paso 1.2 dos veces más y volver a dispersar el sedimento final en 1 ml MB.
- Cizallar la suspensión mediante el paso de ida y vuelta ~ 75 veces entre dos jeringas con 21 a 23 adaptadores de calibre conectados por un tubo de polietileno (7 - 12 cm de largo, 0,58 mm de diámetro interno). Limitar el tiempo total para cizallar a 30 - 45 s.
- Centrifugar las células cortadas a 1.500 xg durante 5-7 minutos y volver a dispersar elprecipitado en 100 - 500 l de MB.
2. Preparación de los portaobjetos
- Preparar una cámara de imágenes intercalando dos cintas adhesivas de doble cara entre un cubre y un portaobjetos de microscopio. Para los ensayos de quimiotaxis, emplear cualquier cámara de microfluidos que permite el intercambio de MB y estimulantes químicos.
- Añadir 0,01% de solución de poli-L-lisina en la cámara y después de 5 min enjuagar suavemente las superficies con MB (80 - 100 L).
- Añadir 40 l de la suspensión celular en la cámara y permitir el tiempo suficiente para la unión a la superficie de vidrio (7-8 min). Flujo de salida células unstuck mediante la adición de 100 l MB en un lado de la cámara, mientras que absorbe la solución con un papel de filtro desde el otro lado.
- Añadir 10 - 15 l de perlas de látex en la cámara y permitir que las perlas de tiempo adecuado para asentarse y unirse a las células (7 - 8 min). Enjuague suavemente con 100 l de MB, tal como se describe en el paso 2.3, para eliminar los granos despegarse. Use una variedad de grano-sizes para los experimentos tan largos como un buen contraste está disponible.
3. Seguimiento del grano
- Coloque la muestra en una platina del microscopio y escanear la superficie de los granos unidos a motores. Utilice un objetivo de 40X fase para hacer observaciones a pesar de la microscopía de fase no es necesario. Alternativamente, emplear imágenes de campo brillante, siempre que suficiente contraste se mantiene distinguir claramente un cordón brillante sobre un fondo oscuro.
- Una vez que una perla ha sido seleccionado, mover la etapa de posicionar lateralmente el cordón en una esquina predeterminado como se muestra en la Figura 1B. perlas de posición en la misma esquina para asegurar que la dirección de rotación de la perla se conoce correctamente. La trayectoria del grano ideal es aproximadamente circular, pero las trayectorias elípticas son admisibles.
- Mantener la frecuencia de muestreo superior al doble de la frecuencia de rotación del motor para evitar los errores asociados con aliasing. En este trabajo, utilizar un motor que estaba girando a50 Hz y la muestra en las frecuencias que eran 10 veces más alta (500 Hz), para obtener una señal lisa.
Análisis 4. Datos
- Centro y escalar las tensiones de salida del PMT y elipticidad correcta en las trayectorias con transformaciones afines si es necesario 23. Use un análisis de espectro de potencia para determinar las tasas de rotación 17.
- Determinar ángulos polares, θ (t) = atan (Y (t) / x (t)). Determinar las variaciones en las velocidades del motor y el cambio en el tiempo mediante el cálculo de ω
14. - Emplear un filtro de mediana para suavizar los datos de velocidad del motor. Una ventana de filtro más de dos rotaciones completas se recomienda 23,24.
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Representative Results
La configuración fotomultiplicador se muestra en la Figura 1A. Es importante que los PMT tienen altas sensibilidades más de la gama de longitudes de onda dispersas por las perlas de interés. Los EGP empleadas aquí operan en los rangos visible e infrarrojo cercano, y fueron capaces de detectar la luz dispersada por bolas iluminadas por una fuente de luz halógena. Las condiciones de iluminación óptimas y tensiones de alimentación varían de una configuración a otra. Para la configuración utilizada en este trabajo, una ganancia PMT ~ 04 10-05 10 resultó adecuada. Cada fotomultiplicador se cubrió con excepción de una hendidura 3 x 1 mm colocada en frente del fotomultiplicador. Las ranuras limitan la región en la célula-muestra de la que la luz puede entrar en los fotomultiplicadores, y las dos ranuras son ortogonales entre sí. Cuando un cordón de rotación se coloca en la ubicación correcta (Figura 1B), la cantidad de luz que entra en los aumentos fotomultiplicadores como viene el rebordeen la vista y disminuye a medida que su trayectoria circular se la quita de la vista. Las frecuencias de las salidas de voltaje PMT sinusoidales indican la velocidad de rotación y las diferencias de fase entre las dos señales indican la dirección de rotación. El uso de un osciloscopio para mostrar las salidas PMT permite la visualización de las trayectorias de talón, en tiempo real.
Las señales PMT variables en el tiempo, y (t) y x (t), a partir de un motor representativo se muestran en la Figura 2A. La ortogonalidad de las dos rendijas introduce un retardo de fase entre las dos señales. Las amplitudes de señal dependen de la relación de señal a ruido, así como la excentricidad de rotación. Las trayectorias correspondientes de la perla se indican en la Figura 2B.
Un histograma de las velocidades medidas a partir de un motor de representación en un Chey - cepa eliminado se muestra en la Figura 3A 25 granos. El cordón se coloca primero en la esquina inferior derecha, como se ve en el esquema de la Figura 1B. La velocidad angular correspondiente se muestra en la Figura 3B (panel superior). Posicionar el talón a la esquina izquierda inferior adyacente dio lugar a la inversión de la señal en las velocidades del motor (panel inferior). Por lo tanto, moviendo el talón a una esquina adyacente cambiará la dirección observada de rotación del motor. En este sentido, esquinas diagonalmente opuestas son idénticos. Por lo tanto, es crucial para conocer la ubicación de la perla durante las mediciones para determinar correctamente la dinámica de conmutación. La Figura 3C muestra las transiciones repetidas de un motor de tipo salvaje entre los dos sentidos de giro.
Códigos personalizados para el software de adquisición de datos han sido adaptados de trabajo antes de grabar los datos en un ordenador 15. La salida del PMT fue AC-acoplado y filtra paso bajo con una frecuencia de corte de 100 Hz. Seguimiento en tiempo real se ha habilitado mediante la conexión de las salidas filtradas a un osciloscopio.
Figura 1: Configuración del grano-tracker. A) Esquema de la configuración del seguimiento basado en la PMT. B) La posición ideal del cordón (esfera negro) con relación a las dos ranuras ortogonales. La trayectoria se indica mediante las líneas de puntos. La excentricidad e es el radio del círculo de puntos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Salidas PMT. A) filtrada en paso bajo las salidas de los dos fotomultiplicadores, después de centrado / escalado. B) Las trayectorias de perlas obtenidas a partir de los datos incluidos en la muestra de PMT, de más de 3 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Trayectorias del grano. A) Histograma de velocidades CCW sólo de un motor representativo. B) Las velocidades de rotación de un motor de sólo CCW reflejado en la esquina inferior derecha (panel superior). velocidades de rotación del mismo motor cuando se lo coloca en la esquina inferior izquierda (panel inferior). DO) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con el fin de facilitar el atado de talones de seguimiento y correcta estimación de los pares de motor, la siguiente información debe ser revisada. Al realizar estas mediciones con células flageladas, esquila es un paso crítico. Shearing reduce el filamento flagelar a un simple trozo, garantizando de este modo que la carga viscosa en el motor se debe principalmente a la perla y se puede estimar dentro del 10% de error 16. Shearing también mejora las posibilidades de encontrar trayectorias circulares con excentricidades bien distribuidos (<diámetro del grano 14). Los resultados de cizallamiento indebidos en las trayectorias caprichosos, compuestos errores en el seguimiento y en el cálculo de los lastres viscosos, así como lo que resulta en relaciones señal-ruido pobres. El uso de un osciloscopio permite la rápida eliminación de dichos datos. Dado que se espera que las propiedades biomecánicas de filamentos flagelares a variar con la especie, probablemente tendrá que ser adaptados métodos de cizallamiento para asegurar cizalla adecuada en tque las bacterias de interés. Una manera eficaz de reducir los errores asociados con cizallamiento es trabajar con células que carecen de los genes que codifican las proteínas de los filamentos. perlas de sonda pueden entonces ser unidos directamente al gancho a través de anticuerpos anti-gancho.
Encontrar a un cordón que está amarrado apropiadamente puede ser un reto. Esto es porque la mayoría de los granos en el campo de visión o bien se pegan a los cuerpos de las células o la superficie de vidrio. Dichas cuentas pueden ser llevados fácilmente en un enfoque nítido. Otras cuentas aparecerán a vibrar o rotar de forma visible con grandes amplitudes o grandes excentricidades (> 1.5 - 2x diámetro del grano). Estos son normalmente atados a flagelar filamentos que no han sido completamente cortadas o girar en un plano que está inclinado con respecto al plano focal. El muestreo de tales perlas normalmente dará lugar a ruido más alto, y los tiempos de las variaciones en las cargas viscosas puede dar lugar a una subestimación de motores pares para un cordón de tamaño dado. Una pequeña fracción de los granos atados se someterá al azarmovimiento; Estos son sólo sometidos a la rotación browniano. Una fracción de los granos aparecerá borrosa y no puede ser traído en foco fácilmente. Estos son más propensos a ser motores que han sido atados apropiadamente y son los motores de interés.
Entre las limitaciones de un solo motor de seguimiento como el que se describe aquí es la incapacidad para llevar a cabo experimentos de alto rendimiento. Una cámara de alta velocidad que las imágenes una región más grande de interés puede ser ventajoso en este sentido. Otras limitaciones incluyen los errores asociados con múltiples señales derivadas de los granos giratorios estrechamente espaciados en el campo de visión de los PMT. Por último, los errores en la determinación de la posición correcta del talón grabadas con respecto a las dos ranuras fotomultiplicadores resultarán en la estimación imprecisa de la dinámica de conmutación.
Ventajas de la configuración descrita aquí incluyen la capacidad de realizar un seguimiento de la rotación de las perlas más largos períodos de tiempo y en tiempo real. Estapermite la rápida eliminación de las trayectorias propensos a errores, algo que tal vez difícil de lograr con cámaras ultrarrápidas. Además, con algunas modificaciones de esta configuración se puede integrar con ensayos diseñados para someter las células a una variedad de estímulos. Combinado con termoeléctrico de refrigeración 26, la técnica se puede emplear para medir las respuestas de los motores individuales a los estímulos térmicos. La integración con las pinzas ópticas pueden efectuar las medidas de remodelación de motores individuales en respuesta a estímulos mecánicos, como se ha hecho recientemente 6. Por último, la adaptación del motor a los estimulantes químicos se puede medir con el uso de una cámara de perfusión adecuada y bombas 11.
La mayoría de las especies bacterianas conocidas son móviles y la motilidad flagelar mediada es predominante en la naturaleza. Se espera que los métodos demostrados aquí para continuar para ayudar en el desarrollo de conocimientos sobre-estructural remodelación y la adaptabilidad of del motor flagelar.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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