Introduction
I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D'altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor - rileva meccanicamente la presenza di substrati solidi 5,6. Questa capacità aiuta probabilmente a scatenare la colonizzazione della superficie e le infezioni 5,7. Di conseguenza, i meccanismi per cui il motore individua automaticamente superfici e iniziati segnalazione sono di importanza 8,9.
Il motore flagellare può essere facilmente studiato da legare il flagellum ad un substrato e osservando la rotazione cellulare. Tale tethering è stato raggiunto prima da Silverman e Simon, che lavorava con un mutante polyhook in E. coli e ganci fissati con successo per substrati di vetro con anticorpi anti-gancio 10. Il test legato celle consentito ai ricercatori di studiare le risposte del motore interruttore ad una varietà di stimoli chimici. Ad esempio, Segall e collaboratori stimolati chimicamente le cellule in collegamento, con l'ausilio di pipette iontoforesi. I cambiamenti corrispondenti pregiudizi CW (la frazione dei motori tempo di rotazione in senso orario, CW) ha permesso loro di misurare le cinetiche di adattamento della rete chemiotassi 11,12. Mentre il test delle cellule legato è stato efficace nello studio delle risposte degli interruttori, è stato solo in grado di offrire intuizioni meccanica del motore su una gamma limitata di carichi viscosi 13. Per superare questo problema, Ryu e collaboratori impastoiati sferiche, sfere di lattice a filamento stub su cellule attaccate alle superfici. Le perle sono statipoi monitorati tramite interferometria back-focale con trappole ottiche deboli 14. Lavorando con perline di diverse dimensioni, i ricercatori possono studiare il motore su una gamma più ampia di carichi. Questo test è stato poi migliorato da Yuan e Berg, che ha sviluppato una tecnica di tallone-tracking fotomoltiplicatore a base combinata con illuminazione laser in campo scuro. Il loro metodo attivato il monitoraggio di nanobeads frenati d'oro che erano così piccola (~ 60 nm) che le resistenze viscose esterni sono stati inferiori rispetto alle resistenze viscose interne a rotazione 15,16. Ciò ha portato alle misure delle velocità massime ottenibili in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, simili saggi di perline attivate misure dei tassi di filatura a carichi intermedi viscosi (~ 700 Hz) 17. Consentendo misurazioni di risposte motorie sull'intera gamma possibile di carichi viscosi (da zero-carico quasi stallo), le perline-saggi fornito un importante strumento biofisico per comprendere il tprocesso orque generazione 18,19.
Recentemente, abbiamo modificato il dosaggio Yuan-Berg per includere pinzette ottiche che ci hanno permesso di applicare stimoli meccanici precisi per singoli motori 6. Usando questa tecnica, abbiamo dimostrato che la forza-generatori che ruotano il motore sono meccanosensori dinamici - si rimodellare in risposta ai cambiamenti di carichi viscosi. È possibile che tale load sensing innesca differenziazione cellulare nei batteri brulicanti, sebbene i meccanismi rimangono poco chiari. E 'anche probabile che i motori flagellare in altre specie sono anche meccanosensibili 20, anche se la prova diretta è carente. Qui, si discute l'approccio fotomoltiplicatore-based (PMT) per il monitoraggio della rotazione delle sfere di lattice impastoiati ai filamenti flagellari 15. Rispetto al monitoraggio con telecamere ultraveloci, il fotomoltiplicatore-setup è vantaggioso perché è relativamente semplice per tenere traccia delle singole perle in tempo reale e più a lungo durazioni. E 'particolarmente utile quando si studia a lungo tempo rimodellamento in complessi a motore flagellare a causa di stimoli ambientali 21. Anche se abbiamo protocolli dettaglio specifico per E. coli, che possono essere facilmente adattati per lo studio di motori flagellare in altre specie.
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Grow culture durante la notte del ceppo desiderato portando il appiccicoso flic allele 15,22 a triptone Broth (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) seguita da inoculo in diluizione 1: 100 in 10 ml TB fresco. Crescere la coltura a 33 ° C in un incubatore shaker fino OD 600 = 0.5.
- Agglomerare le cellule a 1500 xg per 5 - 7 min e ri-disperdere il pellet vigorosamente in 10 mL di tampone di filtro sterilizzato motilità (MB; 10 mM tampone fosfato: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionina, pH 7,0).
- Ripetere il punto 1.2 altre due volte e ri-disperdere il pellet finale in 1 ml MB.
- Tosare la sospensione passando avanti e indietro ~ 75 volte tra due siringhe con 21 a 23 adattatori calibro connesso con un tubo in polietilene (7 - 12 cm di lunghezza, diametro 0,58 mm interno). Limitare il tempo totale di taglio a 30 - 45 s.
- Centrifugare le cellule tranciate a 1.500 xg per 5-7 minuti e ri-disperdere lapellet in 100 - 500 ml di MB.
2. Far scorrere Preparazione
- Preparare una camera di imaging da sandwich due nastri adesivi doppia faccia tra una copertura antiscivolo e un vetrino da microscopio. Per i saggi di chemiotassi, impiegare qualsiasi camera di microfluidica che consente lo scambio di MB e stimolanti chimici.
- Aggiungere 0,01% soluzione di poli-L-lisina nella camera e dopo 5 min risciacquare delicatamente le superfici con MB (80 - 100 l).
- Aggiungere 40 ml di sospensione cellulare nella camera e consentire un tempo sufficiente per il fissaggio alla superficie di vetro (7 - 8 min). Defluire cellule scollate aggiungendo 100 microlitri MB su un lato della camera, mentre traspirante la soluzione con un filtro di carta dal lato opposto.
- Aggiungere 10 - 15 ml di perle di lattice nella camera e consentire le perle tempo sufficiente per risolvere e allegare alle cellule (7-8 min). Lavare delicatamente con 100 ml di MB, come descritto al punto 2.3, per rimuovere scollarsi perline. Utilizzare un intervallo di bead-SIzes per gli esperimenti così a lungo come un buon contrasto è disponibile.
3. Monitoraggio Bead
- Posizionare il campione su un palco microscopio e la scansione della superficie per perline attaccate ai motori. Utilizzare un obiettivo 40X fase per fare osservazioni anche se la microscopia di fase non è necessario. In alternativa, utilizzare l'imaging in campo chiaro fino a quando un sufficiente contrasto è mantenuto per distinguere chiaramente una perlina luminoso su uno sfondo scuro.
- Una volta selezionato un tallone, spostare la fase lateralmente per posizionare il tallone in un angolo predeterminato, come mostrato in Figura 1B. perline posizione alla stessa corner per garantire che il senso di rotazione del tallone è correttamente noto. Il tallone traiettoria ideale è approssimativamente circolare, ma ellittica traiettorie sono ricevibili.
- Mantenere la frequenza di campionamento superiore al doppio della frequenza di rotazione del motore per evitare errori associati aliasing. In questo lavoro, utilizzare un motore che ruotava a50 Hz e il campione a frequenze che erano 10 volte superiore (500 Hz), per ottenere un segnale liscia.
Analisi 4. I dati
- Centro e scalare le tensioni di uscita PMT e corretta ellitticità nelle traiettorie con trasformazioni affini, se necessario 23. Utilizzare l'analisi di potenza spettro per determinare i tassi di rotazione 17.
- Determinare angoli polari, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinare le variazioni di velocità del motore e la commutazione nel tempo calcolando ω
14. - Impiegare un filtro mediano per lisciare i dati di velocità del motore. Una finestra di filtro più di due giri completi si raccomanda 23,24.
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Representative Results
La configurazione fotomoltiplicatore è mostrato nella Figura 1A. È importante che i PMT hanno alte sensibilità nel range di lunghezze d'onda sparse dalle perline di interesse. Le PMT impiegati qui operano nelle gamme visibile e vicino infrarosso, e sono stati in grado di rilevare la luce diffusa dalla perle illuminate da una sorgente di luce alogena. Le condizioni di luce ottimali e tensioni di alimentazione variano da una configurazione all'altra. Per la configurazione utilizzata in questo lavoro, un guadagno di PMT ~ 10 aprile - 10 maggio si è rivelata adeguata. Ogni fotomoltiplicatore è stato coperto tranne una fessura 3 x 1 mm posizionato davanti al fotomoltiplicatore. Le fessure limitano regione nella cella campione da cui la luce può entrare fotomoltiplicatori, e le due fenditure sono ortogonali tra loro. Quando una perlina rotante è posizionato nella posizione corretta (Figura 1B), la quantità di luce che entra aumenti fotomoltiplicatori come il tallone vienenella vista e diminuisce come percorso circolare prende lontano dalla vista. Le frequenze delle uscite sinusoidali di tensione PMT indicano la velocità di rotazione e le differenze di fase tra i due segnali indicano il senso di rotazione. L'uso di un oscilloscopio per visualizzare i risultati PMT consente la visualizzazione delle traiettorie tallone in tempo reale.
I segnali PMT tempo-varianti, y (t) e x (t), da un motore rappresentante sono mostrati nella Figura 2A. L'ortogonalità dei due fenditure introduce un ritardo di fase tra i due segnali. Le ampiezze dei segnali dipende dal rapporto segnale-rumore e l'eccentricità di rotazione. Le corrispondenti traiettorie del tallone sono indicati nella Figura 2B.
Un istogramma delle velocità misurate da un motore rappresentativo in uno Chey - ceppo soppresso è mostrato in Figura 3A 25. Il tallone è stato posizionato nell'angolo inferiore destro, come visto nello schema in Figura 1B. La corrispondente velocità angolare è mostrato nella Figura 3B (pannello superiore). Posizionando il tallone verso l'angolo inferiore sinistro adiacente ha provocato l'inversione del segno sulle velocità del motore (pannello inferiore). Quindi, muovendo il tallone a un angolo adiacente cambierà la direzione osservata di rotazione del motore. A questo proposito, angoli diagonalmente opposti sono identici. È pertanto fondamentale conoscere la posizione del tallone durante le misurazioni per determinare correttamente le dinamiche di commutazione. Figura 3C mostra ripetuti passaggi di un motore wild-type tra i due sensi di rotazione.
Codici personalizzati per il software di acquisizione dati sono stati adattati dal lavoro prima di registrare i dati su un computer 15. L'uscita PMT è accoppiato in AC e filtro passa-basso con frequenza di taglio di 100 Hz. il monitoraggio in tempo reale è stato attivato collegando le uscite filtrate a un oscilloscopio.
Figura 1: Impostazione Bead-tracker. A) Schema di impostazione del monitoraggio PMT-based. B) La posizione ideale del tallone (sfera nera) rispetto ai due fessure ortogonali. La traiettoria è indicata dalle linee tratteggiate. L'eccentricità e è il raggio del cerchio tratteggiato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: PMT uscite. A) passa-basso uscite filtrato dai due fotomoltiplicatori, dopo il centraggio / ridimensionamento. B) Le traiettorie tallone ottenuti dai dati PMT, campionati più di 3 s. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Traiettorie tallone. A) Istogramma di velocità CCW solo di un motore rappresentativo. B) velocità di rotazione di un motore CCW solo ripreso in basso a destra (pannello superiore). velocità di rotazione dello stesso motore quando posizionati in basso a sinistra (pannello inferiore). C) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l'errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentricità strettamente distribuiti (<diametro tallone 14). Risultati tranciatura improprie in traiettorie ostinati, quali composti errori nel monitoraggio e nel calcolo delle boccate viscosi, nonché con conseguente scarsa rapporto segnale-rumore. L'uso di un oscilloscopio permette una rapida eliminazione di tali dati. Dal momento che le proprietà biomeccaniche di filamenti flagellari potranno variare con specie, sarà probabilmente necessario adattare i metodi di taglio al fine di garantire un adeguato taglio in tegli batteri di interesse. Un modo efficace per ridurre gli errori associati alla tosatura è quello di lavorare con le cellule che mancano i geni che codificano le proteine del filamento. perline sonda può poi essere collegato direttamente al gancio tramite anticorpi anti-gancio.
Trovare un cordolo che viene opportunamente legato può essere impegnativo. Questo è perché la maggior parte perline nel campo visivo sarà o essere bloccato ai corpi cellulari o la superficie del vetro. Tali sfere possono essere facilmente portati a fuoco. Altre perle appariranno a vibrare o ruotare visibilmente con grandi ampiezze o grandi eccentricità (> 1,5 - diametro 2x tallone). Questi sono tipicamente legato a flagellare filamenti che non sono stati completamente tranciati o ruotare in un piano inclinato rispetto al piano focale. Il campionamento di tali perle in genere causare rumore più elevato, e di tempo variazioni di carichi viscosi può comportare una sottostima di motori coppie per una data tallone-size. Una piccola frazione di perline frenati subirà casualemovimento; Questi sono solo in fase di rotazione browniano. Una frazione dei branelli apparirà sfocato e non possono essere portati a fuoco facilmente. Questi sono più probabilità di essere i motori che sono stati impastoiati in modo appropriato e sono i motori di interesse.
Tra i limiti del monomotore monitoraggio come quello descritto qui è l'incapacità di condurre esperimenti high throughput. Una telecamera ad alta velocità che immagini una regione più grande di interesse può essere vantaggioso in questo senso. Altre limitazioni sono errori associati con più segnali derivanti da perline rotanti strettamente distanziati nel campo di vista dei PMT. Infine, errori nella determinazione della corretta posizione del tallone registrato rispetto ai due fenditure fotomoltiplicatori comporterà stima imprecisa della dinamica di commutazione.
Vantaggi della configurazione descritta qui includono la possibilità di monitorare la rotazione delle sfere su lunghe durate e in tempo reale. Questopermette la rapida eliminazione delle traiettorie soggette a errori, cosa che forse difficile da raggiungere con le fotocamere ultraveloci. Inoltre, con alcune modifiche questa configurazione può essere integrato con saggi intese a sottoporre le cellule ad una varietà di stimoli. Combinato con raffreddamento termoelettrico 26, la tecnica può essere utilizzata per misurare le risposte dei singoli motori a stimoli termici. Integrazione con pinzette ottiche può attivare le misurazioni di rimodellamento dei singoli motori in risposta a stimoli meccanici, come è stato fatto recentemente 6. Infine, l'adattamento del motore stimolanti chimici può essere misurata con l'uso di una camera di perfusione adeguata e pompe 11.
La maggior parte delle specie batteriche conosciute sono mobili e flagellare mediata motilità è predominante in natura. I metodi dimostrato qui si prevede di continuare a contribuire allo sviluppo di intuizioni strutturali-rimodellamento e l'adattabilità of il motore flagellare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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