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Biology

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

doi: 10.3791/55251 Published: March 8, 2017

Introduction

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bioenergética mitocondrial e capacidades respiratórias pode ser estudado, não só em células permeabilizadas ou fibras, mas também em mitocôndrias isoladas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias de músculo esquelético intactas utilizando centrifugação diferencial para medições de respirometria de alta resolução.

Para isolar mitocôndrias intactas para ventilometria, o tecido é homogeneizado e mitocôndrias são isoladas por um método de centrifugação diferencial convencional. O método de centrifugação diferencial baseia-se centrifugações sequenciais (em uma série de aumentar a velocidade) de homogeneizados de tecido foi introduzido pela primeira vez por Pallade e colegas de trabalho há quase 70 anos 1. O tecido é primeiro picada com uma tesoura e homogeneizada mecanicamente em um homogeneizador de vidro com um pilão folgadas. Em seguida, o homogeneizado é centrifugado a baixa velocidade e o sedimento resultante que contém o tecido intacto, celulardetritos e núcleos é descartado. Em seguida, o sobrenadante é centrifugada várias vezes a alta velocidade e a fracção enriquecida mitocondrial é recolhido. As vantagens do método de centrifugação diferencial para isolar as mitocôndrias são que: i) o método é rápido e mitocôndrias pode ser isolado dentro de 1-1,5 horas (experiências respiratórias deve ser feito tão rápido quanto possível); ii) é barato; e iii) é muito eficiente e as mitocôndrias obtidos por centrifugação diferencial são suficientemente puro para ensaios de respirometria. As desvantagens do método de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias são de que i) mitocôndrias podem ficar danificados e desacoplados durante a homogeneização; ii) a contaminação da mitocôndria com outros componentes celulares (poderia ser resolvido por lavagem adicional com o sedimento mitocondrial passos de centrifugação adicionais); iii) a possibilidade de selecionar diferentes subpopulações mitocondriais, por exemplo, durante centrifugações diferenciais etapas, mitochondria com menor densa pode ser excluída 7; e iv) a envolvente celular está ausente e só a respiração teórica máxima mitocondrial pode ser medido. Outro método para isolar as mitocôndrias para ensaios ventilometria é a densidade do gradiente de centrifugação 2. Nesta técnica, o extracto de tecido é colocado em camadas sobre uma solução de sacarose ou de um gradiente de Percoll (com uma densidade mais elevada na parte inferior do tubo de centrifugação) e centrifugou-se a uma determinada velocidade, fazendo com que as mitocôndrias para ser isolado a partir de outros componentes celulares de acordo com os seus densidades. Este método é frequentemente usado para isolar as mitocôndrias do cérebro com muito pouca contaminação por sinaptossomas. No entanto, as mitocôndrias isoladas de fígado de rato por centrifugação de gradiente de densidade são altamente contaminado com outros organelos celulares 3. Uma das limitações deste método é que o gradiente de sacarose presente no tubo de centrifugação pode romper tãome mitocôndrias (choque osmótico).

Dependendo do tipo de tecido; existem alguns fatores importantes a considerar para o isolamento de mitocôndrias intactas por centrifugação diferencial. A primeira necessidade é para homogeneizar tecidos de uma forma suave. tecidos moles, como rim, cérebro e fígado requerem forças mecânicas suaves aplicadas durante a homogeneização. Isto contrasta com os tecidos duros tais como o músculo cardíaco e esquelético que requerem forças mecânicas muito mais fortes. O tecido moído é geralmente tratada com proteinase antes da homogeneização para amaciar o tecido. Todos os tampões usados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol 4, 5.

Uma das vantagens de estudar isoladas bioenergética mitocondrial é que membranas plasmáticas celular não precisa ser permealized com detergentes, tais como digitonina ou saponina 4, 6, o que pode comprometer a integridade mitocondrial externa da membrana. Outra vantagem da mitocôndria isolada é a ausência de outros factores citosólicas, que podem interferir com a análise das funções mitocondriais, tais como o consumo de oxigénio. As desvantagens de usar as mitocôndrias isoladas são a possível selecção de determinadas populações mitocondriais durante os passos de centrifugação, os danos para a mitocôndria durante a homogeneização, e o requisito de grandes quantidades de amostras biológicas a fim de obter um bom rendimento de mitocôndrias isoladas 7, 8.

Após o procedimento de isolamento, as taxas respiratórias de complexos mitocondriais I-, II- e IV-dependentes (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando-alta resolução respirometria. Para complexo impulsionado-I respiração, glutamatoe malato são adicionados seguindo-se adenosina difosfato (ADP). Para complexo respiração impulsionado-II, succinato é adicionado, seguido pela ADP. Para complexo impulsionado-IV respiração, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) são adicionados, seguidos pela ADP 9, 10, 11, 12. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de substratos sozinho. Estado 3 se refere ao consumo de oxigénio, na presença de substratos e ADP. Estado 4 refere-se ao consumo de oxigênio após a depleção ADP. A relação de controle respiratório (RCR) é um índice de acoplamento da produção de ATP consumo de oxigênio e é calculado como a relação entre o estado 3 e 4 estado 13, 15.

Em resumo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias musculares esqueléticas e funcionais intactos por centrifugação diferencial e utilizá-los mitochon isoladodria para estudos funcionais e bioenergéticos como respirometria de alta resolução.

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Protocol

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A biópsia do músculo quadriceps é retirado de um porco anestesiado, a partir do qual as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. O porco é usado depois para uma outra experiência. O estudo é realizado de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados Animal do cantão Berna, Suíça.

1. A homogeneização músculo esquelético e mitocondrial Isolamento

  1. Excise 5-10 espécime g músculo quadríceps de um porco anestesiado. No presente ensaio, utilizam porcina músculo esquelético. Este protocolo pode também ser utilizada para isolar as mitocôndrias a partir de outras espécies (por exemplo, ratazanas, ratos, humanos, etc.).
    NOTA: Este passo é realizado por um médico especialista com experiência em cirurgia.
    1. sedar porcos com cetamina intramuscular (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), antes da anestesia é induzida com intramidazolam venoso (0,5 mg / kg, mais atropina 0,02 mg / kg). Manter a anestesia com infusões contínuas intravenosas de propofol (4-8 mg / kg por hora) e fentanilo (30 ug / kg por hora) durante a cirurgia.
  2. Mergulhar imediatamente a amostra de tecido em um copo contendo 20 ml de tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocondrial (Tabela 1).
    NOTA: Os tampões utilizados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol.
  3. Pesa-se a amostra de tecido no béquer tarado numa balança analítica. Tarar a balança com o copo contendo 20 ml de tampão de isolamento.
  4. Colocar o copo em um balde de gelo.
    Observação: executar todos os próximos passos para o processo de homogeneização a uma temperatura de balde de gelo e manter todos os buffers no balde de gelo.
  5. Picar o músculo esquelético no copo (manter em gelo) em pequenos pedaços de 1-2 mm para 3-4 min usando sciss finaRUP.
  6. Lavar o tecido moído no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo (20 mL de cada passo de lavagem).
  7. Suspende-se o tecido em 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), contendo 5 mg de protease / g de tecido.
  8. Colocar o copo num banho de gelo sobre o agitador magnético e agitou-se durante 10 min.
  9. Dilui-se a suspensão no recipiente com mais 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% (peso / volume) de albumina de soro bovino a desengordurada (BSA).
  10. Decantar todo o tampão de isolamento completado com 0,2% de BSA e enxaguar o tecido no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo suplementado com 0,2% de BSA (20 mL de cada passo de lavagem).
  11. Ressuspender o tecido em 10 volumes de tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% de BSA com desengordurada.
  12. Homogeneizar o tecido com um homogeneizador de vidro semi-automático (mantido em gelo) com um pilão folgada (10 golpes).
    NOTA: HomogenizÊ O tecido sempre da mesma forma (o mesmo número de acidentes vasculares cerebrais, por exemplo, 10 cursos). Um maior número de acidentes vasculares cerebrais podem danificar e desacoplar as mitocôndrias. De um modo preferido, homogeneizar o tecido utilizando um homogeneizador automatizado. Manualmente (e subjetivamente) amostras de tecido homogeneizado em homogeneizadores de vidro podem produzir diferentes qualidades de mitocôndrias isoladas.
  13. Centrifugar o tecido homogeneizado a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g.
    NOTA: Todos os passos de centrifugação são realizados em centrífugas com rotores de ângulo fixo.
  14. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e ressuspender o sedimento em meio de isolamento arrefecido em gelo suplementado com BSA (10 ml / g de tecido).
  15. Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 350 x g.
  16. Reservamo-nos o sobrenadante utilizando uma pipeta sorológica e descartar o pellet (restos celulares).
  17. Filtra-se o sobrenadante para uma proveta (mantido em gelo) por meio de duas camadas de gaze (17 fios / cm 2) para remover células debré.
  18. Centrifugar a suspensão foi filtrada a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
  19. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto no tampão de isolamento (5 mL / g de tecido) suplementado com 0,2% (peso / volume) de BSA e centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
  20. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem (Tabela 1). Centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
  21. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem e centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g.
  22. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em 1,0 ml de tampão de lavagem.
  23. Determinar a concentração de proteína da suspensão mitocondrial e manter a suspensão mitocondrial concentrado em gelo.
    NOTA: A concentração de proteína pode ser medido utilizando qualquer método padrão.
  24. Somente o interiorpara Respirometria ensaios, ressuspender a suspensão mitocondrial no buffer de respiração para uma concentração final de 0,4 mg de proteína mitocondrial / mL.

2. High-resolution Respirometria

  1. Pipetar 2,1 mL de tampão de respiração (Tabela 1) 16 para dentro de uma câmara de oxygraph de alta resolução e agita-se o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h até que um sinal de fluxo de oxigénio estável de o sensor de oxigénio é obtido polarográfica.
    NOTA: eletrodos de oxigênio Polarográfico dentro de cada câmara oxygraph medir a concentração de oxigênio e calcular o consumo de oxigênio (fluxo) dentro de cada câmara. A concentração de oxigénio e as taxas de consumo de oxigênio (de fluxo) são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados. Além disso, a fim de garantir resultados precisos e fiáveis, oxigénio instrumental correcção de fundo deve serrealizada de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: com exactidão 2,1 ml de tampão de respiração é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas.
  2. Executar uma calibração de ar do sensor de oxigénio polarográfico de acordo com os protocolos do fabricante 17.
    Nota: Durante a calibração do ar, com uma fase de gás presente, a concentração de oxigénio meios irá equilibrar na ordem de 15-20 minutos. Dependendo da temperatura, a pressão barométrica e a solubilidade da concentração dos meios -oxygen pode ser calculada.
  3. Após a calibração de ar, aspirar o meio da respiração da câmara oxygraph e adicionar 2,1 ml de suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg de proteína mitocondrial / mL) do passo 1,24 para uma câmara do oxygraph.
    NOTA: O volume de tampão respiração depende do instrumento criado e fabricante. Para respirometria de alta resolução, os 2,1 ml de bu respiraçãoffer é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas.
  4. Fechar a câmara de oxygraph por inserção da rolha.
  5. Agita-se a suspensão mitocondrial continuamente usando uma barra magnética de agitação presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C e ficha respiração celular na linha de base para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: A concentração de oxigênio e sinal de fluxo de oxigênio são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados 17.
  6. Em seguida, injectar substratos e inibidores para a respiração mitocondrial através dos orifícios de injecção de titânio das rolhas, utilizando os seguintes protocolos padrão.

3. Complexo Respiração-I dependente

  1. Prepara-se uma câmara de oxygraph contendo o isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos e 2,1-2,5esperar por um sinal estável.
  2. Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: Todas as injeções nas seguintes etapas são realizadas através dos portos de injeção de titânio de rolhas usando seringas.
  3. Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e a respiração mitocondrial gravar até que o sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
    NOTA: O planalto da respiração após a adição de ADP indica que a concentração de ADP foi elevada e saturação. Dependendo da quantidade de mitocôndrias utilizados durante a respiração, concentração de ADP deve ser tituladapara um consumo de oxigênio estado 3 estável (respiração máxima). A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração).

4. Respiração II-dependente Complexo

  1. Prepara-se uma câmara contendo oxygraph isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nas etapas 2,1-2,5 e esperar por um sinal estável.
  2. Injectar 2 mL de rotenona 0,2 mM (0,2 uM) 'CUIDADO "para dentro da câmara oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha de câmara usando uma seringa e gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: rotenona é um veneno perigosa e pode ter um impacto significativo na saúde humana.
  3. Injectar 20 mL de 1 M de succinato (10 mM) em CH oxygraphâmbar e registro respiração mitocondrial para 3-5 min até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado.
  4. Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar até que a respiração celular sinal aumenta o fluxo de oxigénio, estabiliza, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
    NOTA: A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração).

5. Respiração Complexo-dependentes IV

  1. Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável.
  2. Em seguida, injectam 2,5 mL de ascorbato 0,8 mM (1 mM). Imediatamente depois injectar 2,5 mL de 0,2H TMPD (0,25 mM) e 10 uL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para dentro da câmara e oxygraph ficha respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza (3-5 min).
  3. Finalmente injectar 10 mL de azida de sódio 1 M (5 mM) "CUIDADO" para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigénio e estabiliza.
    NOTA: A azida sódica é um veneno perigoso e pode ter um impacto significativo sobre a saúde humana.

6. citocromo C Teste

  1. Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável.
  2. Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmarae gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  3. Injectar 10 mL de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha e câmara de registo respiração mitocondrial até sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min).
  4. Finalmente, injectar 5 mL de 4 mM de citocromo c (10 pM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.

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Representative Results

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Complexo I-dependente respiração

Taxas isoladas complexo mitocondrial dependente da I respiratórias (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 1, um diagrama representativo). substratos complexo I mitocondrial, glutamato e malato, são adicionados, seguidos pela adição de ADP. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de só os substratos. Estado 3 se refere ao consumo de oxigénio, na presença dos substratos e ADP. Estado 4 refere-se ao consumo de oxigênio após a depleção ADP. RCR é um índice do acoplamento do consumo de oxigénio para produção de ATP e é calculado como a razão entre o estado 3 e o estado 4. Como mostrado na Figura 1, após a adição de ADP, a taxa de respiração mitocondrial aumenta imediatamente (estado 3 da respiração), e em seguida, diminui (estado 4 da respiração) a níveis muito similar ao de estado 2. Isto indica uma alta RCR e que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. A Figura 2 é um diagrama representativo da medição de uma baixa taxa de respiração e o estado 3 RCR, com um elevado estado de 4 a taxa de respiração, indicando inadequado e vencida mitocondrial isolamento. A alta taxa de respiração de estado 4 é um indicador de prótons mitocondrial leakiness 15.

figura 1
Figura 1: Bem sucedido isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução, utilizando o glutamato e malato como substratos (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). o oxiconcentração gen diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado mitocondrial isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução, utilizando o glutamato e malato como substratos (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o available oxigênio. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Respiração complexa dependente da II

Isolado mitocondrial complexos taxas respiratórias II-dependentes (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 3, um diagrama representativo). Para este ensaio, o complexo I mitocondrial é inibida pela adição de rotenona, e depois succinato (substrato complexo II) é adicionado seguido pela ADP. A Figura 3 mostra que após a adição de ADP, os aumentos da respiração mitocondrial imediatamente, e, em seguida, diminui para níveis muito semelhantes à do estado 2, indicando mitocôndrias bem acoplados e queintegridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. O valor RCR calculada para esta experiência típica é 4,23, o que está em estreita concordância com os valores apresentados na literatura disponível 10, 11, 23). A Figura 4 é um diagrama representativo da medição de uma baixa taxa de respiração e o estado 3 RCR, com um elevado estado 4 ritmo respiratório indicando inadequado de isolamento.

Figura 3
Figura 3: Sucesso isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Traçados da respirometria de alta resolução usando succinato como substrato (complexo respiração II-dependente). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação deconcentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado isolamento. Traçados da respirometria de alta resolução usando succinato como substrato (complexo respiração II-dependente). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como Mitoc isoladohondria usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complexo IV-dependente respiração

Isoladas mitocondrial complexos taxas respiratórias dependente de IV (estados 2, 3) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 5, um diagrama representativo). Para este ensaio de ascorbato / TMPD e ADP são adicionados, seguido de azida de sódio para inibir o complexo IV.

A diferença entre o consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio é interpretado como a respiração complexo IV real. A Figura 5 é um diagrama representativo de MEASURement de um elevado estado 3 taxa de respiração dependentes do complexo IV indicando que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. Em contraste, a Figura 6 é um diagrama representativo da medição de um estado de baixo 3 indicando inadequado de isolamento.

Figura 5
Figura 5: sucesso isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução utilizando ascorbato / TMPD como substrato (respiração complexo dependente de IV). Complexo IV respiração (estado 3) é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocho isoladondria usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução utilizando ascorbato / TMPD como substrato (respiração complexo dependente de IV). Complexo IV respiração (estado 3) é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). O conce oxigêniontration diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da integridade da membrana mitocondrial externa usando citocromo c

Para avaliar a qualidade da preparação mitocondrial, ensaio do citocromo c é realizado para determinar a integridade da membrana mitocondrial externa, por medição da respiração mitocondrial após a subsequente adição de glutamato e malato, ADP e citocromo C (ADP estimulado complexo II dependente de estado 3 da respiração no presença de citocromo c). Como mostrado na Figura 7, o citocromo c não aumenta complexo dependente do estado eu 3 re spiration do mitocôndrias isoladas, o que indica que não houve perda de citocromo c a partir da membrana exterior mitocondrial e integridade mitocondrial é preservada.

Figura 6
Figura 7: Citocromo c não melhora a respiração do mitocondrial isolado: a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução usando glutamato / malato como substrato (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol.m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tampão de isolamento mitocondrial
Químico Concentração
KCl 100 mM
MgSO4 10 mM
ácido sulfónico morfolinopropano (MOPS) 50 mM
ácido etilenodiaminotetraacético (EGTA) 1,0 mM
ATP 1,1 mm
pH 7,4
Tampão de lavagem mitocondrial
Químico Concentração
KCl 100 mM
MOPS 50 mM
EGTA 0,5 mM
pH 7,4
A respiração mitocondrial tampão 16
Químico Concentração
sacarose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl2 3,0 mm
KCl 80 mM
K-lactobionato 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
taurina 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1,0 g / L
pH 7,1

Tabela 1: A composição de buffers.

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Discussion

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No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar de alta qualidade, intactas e fortemente acoplados mitocôndrias do músculo esquelético através de centrifugação diferencial, que podem ser utilizadas para estudos funcionais tais como ventilometria de alta resolução.

Para isolar mitocôndrias intactas e fortemente acoplados, há alguns pontos críticos a serem considerados no presente protocolo. Após a colheita do tecido esquelético, deve ser imediatamente imersas em tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocondrial. Todos os passos de centrifugação deve ser realizado a 4 ° C e a suspensão mitocondrial deve ser mantido sempre em gelo durante o isolamento. O processo de isolamento deve ser realizado tão rapidamente quanto possível. O homogeneizado deve ser centrifugada em tubos de centrífuga limpo sem detergente. No final do processo, a suspensão deve ser mantida mitocondrial e concentrado ser diluído imediatamente antes de Respirometria. Como os dados de respirometria são expressos como pmol por segundo peR miligrama de proteína mitocondrial, é importante utilizar uma boa técnica para medir com precisão a concentração de proteína mitocondrial após o isolamento.

Em alguns procedimentos de isolamento mitocondrial, pode acontecer que as mitocôndrias são desacoplada ou não consomem oxigênio corretamente usando de alta resolução respirometria. Para superar estes problemas, o tecido deve sempre ser homogeneizada na mesma forma (o mesmo número de acidentes vasculares cerebrais), utilizando o homogeneizador com o pilão folgada (passo 1.12). Aqui, nós sempre homogeneizar o tecido muscular esquelético usando um homogeneizador automatizado com 10 tacadas. Um maior número de acidentes vasculares cerebrais podem danificar e desacoplar as mitocôndrias. Manualmente (e subjetivamente) amostras de tecido homogeneizado em homogeneizadores de vidro podem produzir diferentes qualidades de mitocôndrias isoladas. Congelação das mitocôndrias também pode resultar em mitocôndrias desacoplados e deve-se certificar de que são feitas as centrifugações a 4 ° C, e não inferior a esta temperatura. A integridade mitocondrial pode ser comprometida, bem como se o pH das soluções tampão é incorrecta ou os tubos de centrifugação não são limpos. Um deve certificar-se de que os tubos de centrifugação são livres de detergente e devidamente lavados.

Um dos primeiros fatores importantes a serem considerados durante o isolamento é para homogeneizar tecidos de uma forma suave. tecidos moles requerem forças mecânicas suaves aplicadas durante a homogeneização, enquanto que tecidos duros exigem forças mecânicas muito mais fortes. Buffers usados ​​durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol. Para tecidos duros tais como o músculo esquelético, após homogeneização mecânica, proteases tais como a tripsina pode ser adicionado para desagregar ainda mais o tecido 4, 5.

Algumas das limitações de mitocôndrias isoladas, com base em dcentrifugação ifferential são: i) as mitocôndrias possivelmente danificados durante o procedimento de homogeneização e isolamento 19, ii) as grandes quantidades de amostras de tecido necessárias para o isolamento mitocondrial, iii) a possível perda e alterações em certos complexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial subunidades durante a homogeneização e centrifugação os passos 18, e iv) o aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio durante as etapas de homogeneização e centrifugação, o que pode interferir com a função mitocondrial 18. As vantagens da homogeneização de Dounce e o método de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias em bruto para experiências respiratórias em relação a métodos existentes, tais como a centrifugação em gradiente de densidade 20, são que o método é rápido e mitocôndrias são isoladas dentro de um curto período de tempo. Portanto experiências respiratórias pode ser realizada dentro de umh. Além disso, o processo é barato, muito eficiente e as mitocôndrias obtidos por centrifugação diferencial pode ser utilizada para ensaios de ventilometria. A investigação do consumo de oxigênio mitocondrial utilizando mitocôndrias isoladas oferece várias vantagens sobre fibras ou células permeabilizadas: nenhuma interferência significativa com proteínas citosólicas que podem interferir com a função mitocondrial e bioenergética; não há necessidade de permeabilização celular; e substratos de os complexos da cadeia respiratória mitocondrial pode ser adicionado directamente às mitocôndrias isoladas.

Um dos métodos alternativos para medir músculo esquelético respiração mitocondrial é o uso permeabilizadas fibras musculares 9. Algumas das vantagens das fibras musculares permeabilizadas sobre mitocôndrias isoladas são i) nenhum passo de homogeneização mecânica é necessária e, ii) são necessárias quantidades muito pequenas de tecido (algumas mg) em ensaios ventilometria. A desvantagem de pfibra muscular ermeabilized é a difusão de oxigênio inferior para as mitocôndrias do feixe de fibras. Esta restrição de difusão requer grandes quantidades de ADP durante ensaios de respirometria. Outro método alternativo é a utilização de homogenatos de tecido integrais 22, que é um método muito rápido e não necessita de passos de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias. A utilização de todo homogeneizado de tecido pode evitar a perda de algumas mitocôndria durante o seu isolamento, mas podem existir outros factores citosólicas presentes, que podem interferir com a análise das funções mitocondriais, tais como o consumo de oxigénio.

Depois de dominar a centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias bruto para ensaios respiratórias, uma aplicação futuro é investigar as capacidades respiratórias de mitocôndrias isoladas através de técnicas emergentes, tais como a utilização de membrana externa mitocondrial anti-TOM22 (translocase de mitocondrial externa da membrana 22 homólogo) anticorpo-coupled esferas magnéticas 21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

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References

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Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução
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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

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