Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.
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Artigo de método
Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução
Neste artigo
Resumo
Resumo
As mitocôndrias estão envolvidas no metabolismo energético celular e usam oxigênio para produzir energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP). A centrifugação diferencial em baixa e alta velocidade é comumente usada para isolar mitocôndrias de tecidos e células cultivadas. Frações mitocondriais brutas obtidas por centrifugação diferencial são usadas para medidas de respirometria. A técnica de centrifugação diferencial é baseada na separação de organelas de acordo com seu tamanho e velocidade de sedimentação. O isolamento das mitocôndrias é realizado imediatamente após a coleta do tecido. O tecido é imerso em meio de homogeneização gelado, picado com tesoura e homogeneizado em homogeneizador de vidro com pilão solto. A técnica de centrifugação diferencial é eficiente, rápida e barata e as mitocôndrias obtidas por centrifugação diferencial são puras o suficiente para ensaios de respirometria. Algumas das limitações e desvantagens das mitocôndrias isoladas, baseadas na centrifugação diferencial, são que as mitocôndrias podem ser danificadas durante o procedimento de homogeneização e isolamento e que grandes quantidades de biópsia de tecido ou células cultivadas são necessárias para o isolamento mitocondrial.
Introdução
bioenergética mitocondrial e capacidades respiratórias pode ser estudado, não só em células permeabilizadas ou fibras, mas também em mitocôndrias isoladas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias de músculo esquelético intactas utilizando centrifugação diferencial para medições de respirometria de alta resolução.
Para isolar mitocôndrias intactas para ventilometria, o tecido é homogeneizado e mitocôndrias são isoladas por um método de centrifugação diferencial convencional. O método de centrifugação diferencial baseia-se centrifugações sequenciais (em uma série de aumentar a velocidade) de homogeneizados ....
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Protocolo
A biópsia do músculo quadriceps é retirado de um porco anestesiado, a partir do qual as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. O porco é usado depois para uma outra experiência. O estudo é realizado de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados Animal do cantão Berna, Suíça.
1. A homogeneização músculo esquelético e mitocondrial Isolamento
- Excise 5-10 espécime g músculo quadríceps de um porco anestesiado. No presente ensaio, utilizam porcina músculo esquelético. Este protocolo pode também ser utilizada pa....
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Resultados
Complexo I-dependente respiração
Taxas isoladas complexo mitocondrial dependente da I respiratórias (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 1, um diagrama representativo). substratos complexo I mitocondrial, glutamato e malato, são adicionados, seguidos pela adição de ADP. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de só os substratos........
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Discussão
No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar de alta qualidade, intactas e fortemente acoplados mitocôndrias do músculo esquelético através de centrifugação diferencial, que podem ser utilizadas para estudos funcionais tais como ventilometria de alta resolução.
Para isolar mitocôndrias intactas e fortemente acoplados, há alguns pontos críticos a serem considerados no presente protocolo. Após a colheita do tecido esquelético, deve ser imediatamente imersas em tampão de isolame.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimicina química A | Sigma | A 8674 | Química, dissolver em etanol |
| Ascorbato | Merck | 1.00127 | ATP químico |
| Sigma | A 7699 | Química | |
| BSA | Sigma | A 6003 | Química |
| EGTA | fluka | 3779 | Química |
| Glutamato | Sigma, | G 1626 | Hepes Químico |
| Sigma | H 7523 | Químico | |
| KCl | Merck | 1.04936 | Químico |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Merck | 1.04873 | Químico |
| K-lactobionato | Sigma | L 2398 | Químico |
| MgCl2< / sub> | Sigma | M 9272 | |
| Ácido sulfônico morfolinopano químico (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Instrumentos Oroboros | 10000-02 | Instrumento de respirometria de alta resolução |
| Proteinase, bacteriana | Sigma | P 8038 | Azida |
| sódio | Sigma | S2002 | |
| Rotenona | Sigma | R 8875 | Química, dissolver em etanol |
| Succinato | Sigma | S 2378 | Químico |
| Schuett homogen-plus homogeneizador semiautomático | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Homogeneizador de tecidos |
| Taurina | Sigma | T 8691 | Químico |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Químico |
Referências
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R.
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Reimpressões e permissões
