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Biology

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

doi: 10.3791/55251 Published: March 8, 2017

Introduction

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Mitochondriale Bioenergetik und Atemkapazitäten können in permeabilisierten Zellen oder Fasern nicht nur untersucht werden, sondern auch in isolierten Mitochondrien. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll intakten Skelettmuskel Mitochondrien mit differenzieller Zentrifugation für hochauflösende Respirometrie Messungen zu isolieren.

Zur Isolierung intakte Mitochondrien für Respirometrie wird das Gewebe homogenisiert und Mitochondrien werden durch ein herkömmliches Verfahren isoliert differentielle Zentrifugation. Die differentielle Zentrifugation Methode basiert auf sequenzielle Zentrifugationen basiert (in einer Reihe von zunehmenden Geschwindigkeit) von Gewebe - Homogenate wurde durch Pallade und Mitarbeiter zuerst eingeführt fast 70 Jahre vor 1. Das Gewebe wird zunächst mit einer Schere zerkleinert und mechanisch in einem Glas-Homogenisator mit einem locker sitzende Stößel homogenisiert. Danach wird das Homogenisat bei niedriger Geschwindigkeit und das resultierende Pellet zentrifugiert, das ununterbrochene Gewebe enthält, zelluläreTrümmer und Kerne wird verworfen. Dann wird der Überstand mehrmals mit hoher Geschwindigkeit und die mitochondriale angereicherte Fraktion wird gesammelt zentrifugiert. Die Vorteile der differentiellen Zentrifugationsverfahren zu isolieren Mitochondrien sind, dass: i) das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb 1-1,5 h (respiratorische Experimenten isoliert werden sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden); ii) es ist preiswert; und iii) es ist sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie Assays. Die Nachteile der differentielle Zentrifugation Methode zur Isolierung Mitochondrien sind, dass i) die Mitochondrien beschädigt werden könnte und abgekoppelt während der Homogenisierung; ii) die Verunreinigung der Mitochondrien mit anderen zellulären Komponenten (könnte die mitochondriale Pellet mit weiteren Zentrifugationsschritte) durch weiteres Waschen gelöst werden; iii) die Möglichkeit , verschiedene mitochondriale Subpopulationen von der Auswahl, zum Beispiel während einer differenziellen Zentrifugationen Schritte, mitochondria mit niedriger Dichte kann 7 ausgeschlossen werden; und iv) die mitochondriale Zell umgebenden fehlt und nur die theoretische maximale Atmung gemessen werden. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung Mitochondrien für Respirometrie Assays ist die Dichtegradientenzentrifugation 2. Bei dieser Technik wird der Gewebeextrakt über eine Lösung von Sucrose oder einem Percoll-Gradienten überlagert (mit höherer Dichte auf dem Boden des Zentrifugenröhrchen) und mit einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, die Mitochondrien verursacht von anderen zellulären Bestandteilen isoliert werden entsprechend ihrer Dichten. Diese Methode wird häufig verwendet, Gehirn Mitochondrien aus Synaptosomen mit sehr geringer Kontamination zu isolieren. Jedoch werden die Rattenleber - Mitochondrien isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit anderen Zellorganellen 3 stark verunreinigt. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens besteht darin, daß die vorliegende Sucrosegradienten in dem Zentrifugationsröhrchen bersten könnte somich Mitochondrien (osmotischer Schock).

Je nach der Art des Gewebes; gibt es einige wichtige Faktoren für die Isolierung von intakten Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu betrachten. Die erste Notwendigkeit ist Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weiches Gewebe wie Niere, Gehirn und Leber erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet. Dies steht im Gegensatz zu Hartgewebe wie Herz- und Skelettmuskel, die viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Das zerkleinerte Gewebe wird in der Regel mit Proteinase vor der Homogenisierung behandelt, um das Gewebe zu erweichen. Alle Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugation verwendet werden , sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt sein und haben 4, 5.

Einer der Vorteile von isolierten mitochondrialen bioenergetischen studieren ist, dass zelluläre Plasmamembranen brauchen nicht permeabi seinlized mit Detergenzien wie Saponin Digitonin oder 4, 6, die den mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen könnten. Ein weiterer Vorteil der isolierten Mitochondrien ist das Fehlen von anderen cytosolische Faktoren, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Die Nachteile der isolierten Mitochondrien verwenden , sind die mögliche Auswahl bestimmter mitochondrialer Populationen während der Zentrifugationsschritte, Schäden an den Mitochondrien während der Homogenisierung und die Voraussetzung für die hohe Mengen an biologischen Proben , um eine gute Ausbeute an isolierten Mitochondrien 7, 8 zu erhalten.

Nach dem Isolierungsverfahren, die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I-, II- und IV-abhängige (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie ermittelt. Für komplexe I-driven Atmung, Glutamatund Malat werden zugegeben, gefolgt von Adenosindiphosphat (ADP), gefolgt. Für komplexe II-driven Atmung wird Succinat zugegeben, gefolgt von ADP gefolgt. Für komplexe IV gesteuerte Atmung, Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) zugegeben , gefolgt von ADP 9, 10, 11, 12. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von Substraten allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. Die Atemkontrolle Verhältnis (RCR) ist ein Index der Kopplung von ATP - Produktion Sauerstoffverbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand 4 13 berechnet, 15.

Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll funktionale und intakte Skelett-Muskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und verwenden diese isoliert mitochondria für funktionelle und bioenergetischen Studien wie hochauflösenden Respirometrie.

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Protocol

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Die Quadrizeps Muskelbiopsie aus einem narkotisierten Schwein genommen, aus denen Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden. Das Schwein wird danach für ein anderes Experiment verwendet. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Zustimmung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz durchgeführt.

1. Skelettmuskel Homogenisieren und Mitochondriale Isolation

  1. Excise 5-10 g Quadrizeps Probe von einem narkotisierten Schwein. Im vorliegenden Test verwenden Schweineskelettmuskel. Dieses Protokoll kann auch von anderen Spezies Mitochondrien zu isolieren , verwendet werden (zB Ratten, Mäuse, Mensch, etc.).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist von einem Facharzt mit Erfahrung in der Chirurgie durchgeführt wird.
    1. Sedate Schweine mit intramuskulär Ketamin (20 mg / kg) und Xylazin (2 mg / kg), vor der Narkose mit intra induziertvenöse Midazolam (0,5 mg / kg, sowie Atropin 0,02 mg / kg). Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit kontinuierlicher intravenöser Infusion von Propofol (4-8 mg / kg pro h) und Fentanyl (30 & mgr; g / kg pro h) während der Operation.
  2. Sofort tauchen in ein Becherglas mit 20 ml eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer (Tabelle 1) , um die Gewebeprobe.
    HINWEIS: Die Puffer während der Homogenisierung verwendet und Zentrifugationen sollte mit Cytosol kompatibel mit einer ionischen und osmotische Stärke eine physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein.
  3. Wiegen Sie die Gewebeprobe in das Becherglas auf einer analytischen tarierten Balance. Tarieren mit dem Becher 20 ml Isolationspuffer enthält.
  4. Das Becherglas auf einem Eiskübel.
    HINWEIS: alle nächsten Schritte aus, um für die Homogenisierung Verfahren bei der Eiskübel Temperatur und halten alle Puffer auf dem Eis Eimer.
  5. Mince die Skelettmuskulatur in den Becher (auf Eis halten) in 1-2 mm kleine Stücke für 3-4 min mit feinen scissors.
  6. Spülen Sie das zerkleinerte Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer (jeweils 20 ml Waschschritt).
  7. Suspendieren des Gewebes in 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), die 5 mg Protease / g Gewebe.
  8. Das Becherglas in einem Eisbad auf den Magnetrührer und unter Rühren für 10 min.
  9. Verdünne die Suspension in dem Becherglas mit zusätzlichen 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) entfettetes Rinderserumalbumin (BSA).
  10. Dekantieren alle der Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt und spülen das Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt war (jeweils 20 ml Waschschritt).
  11. Resuspendieren des Gewebes in 10 Volumina Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g) mit 0,2% BSA ergänzt mit entfetteter.
  12. Homogenisieren des Gewebes mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator (auf Eis gehalten) mit einem locker sitzende Stößel (10 Schläge).
    HINWEIS: Homogenize die Gewebe immer in der gleichen Weise (gleiche Anzahl von Schlägen, beispielsweise 10 Hübe). Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Vorzugsweise homogenisieren das Gewebe eines automatisierten Homogenisator. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren.
  13. Zentrifuge das homogenisierte Gewebe bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x g.
    HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden in Zentrifugen mit Festwinkelrotoren ausgeführt.
  14. Überstand verwerfen eine serologische Pipette und das Pellet in BSA-ergänzt eiskaltem Isolationsmedium (10 ml / g Gewebe).
  15. Zentrifugiere die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 350 x g.
  16. Reservieren Sie den Überstand eine serologische Pipette und verwerfen das Pellet (Zelltrümmer).
  17. Filtriere den Überstand in einen Becher (auf Eis gehalten) durch zwei Lagen Gaze (17 Fäden / cm 2) zu entfernen Zelle DEBRist.
  18. Zentrifuge die filtrierte Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g.
  19. Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in dem Isolationspuffer (5 ml / g Gewebe), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) BSA und zentrifugiert die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g.
  20. Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer (Tabelle 1). Zentrifugiere die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g.
  21. Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer und Zentrifugieren Sie die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7000 x g.
  22. Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in 1,0 ml Waschpuffer.
  23. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Mitochondrien-Suspension und halten Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension auf Eis.
    HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann mit jedem Standard-Methode gemessen werden.
  24. Grade bevorzu Respirationstest Assays resuspendieren in dem Atmungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 mg / mL mitochondrialen Protein die mitochondriale Suspension.

2. Hochauflösende Respirationstest

  1. Pipette 2,1 ml Atmungspuffer (Tabelle 1) 16 in eine hochauflösende Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 h , bis eine stabile Sauerstofffluss Signal der polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird.
    HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer, um die Sauerstoffkonzentration zu messen und den Sauerstoffverbrauch (Fluss) in jeder Kammer zu berechnen. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt. Darüber hinaus, um genaue und zuverlässige Ergebnisse, instrumental Sauerstoff Hintergrundkorrektur sollte, um sicherzustellen seinnach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
    HINWEIS: Genau 2,1 ml Atmungspuffer wird für die Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen.
  2. Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers 17.
    HINWEIS: Während der Luftkalibrierung, mit einer Gasphase vorhanden ist, die Medien Sauerstoffkonzentration in der Größenordnung von 15-20 min ins Gleichgewicht wird. Je nach Temperatur, Luftdruck und die Löslichkeit von Medien -Sauerstoff-Konzentration kann berechnet werden.
  3. die Atmung Medium aus der Oxygraph Kammer Nach Luftkalibrierung, absaugen und 2,1 ml isolierter Mitochondrien-Suspension (0,4 mg / ml mitochondriale Protein) aus Schritt 1.24 zu einer Kammer des Oxygraph hinzuzufügen.
    HINWEIS: Das Volumen der Atmungspuffer ist abhängig von der Geräteeinstellung und Hersteller. Für hochauflösende Respirometrie, die 2,1 ml der Atmung buffer zur Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen.
  4. Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens.
  5. Rühren Sie die mitochondriale Suspension kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer (700 Umdrehungen pro Minute) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung zu Beginn der Studie unter Verwendung von 3-5 min, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
    HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss - Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyse 17.
  6. Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Standardprotokolle verwenden.

3. Komplexe I-abhängige Respiration

  1. Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer die isolierte mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren enthält, in den Schritten von 2,1 bis 2,5 undwarten auf ein stabiles Signal.
  2. Injizieren von 12,5 & mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 & mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Oxygraph enthaltenden Kammer getrennt mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung der Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
    Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden.
  3. Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen erhöht mitochondrialen Atmung, bis die Sauerstoffflusssignal, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min).
    HINWEIS: Das Plateau der Atmung nach ADP hinaus zeigt an, dass ADP-Konzentration hoch und sättigenden war. Je nach der Menge der Mitochondrien während der Atmung verwendet wird, sollte ADP-Konzentration titriert werden,für einen stabilen Zustand 3 Sauerstoffverbrauch (maximale Atmung). Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht (Zustand 3 Atmung) induzieren. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern.

4. Komplexe II-abhängige Respiration

  1. Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem in den Schritten beschriebenen Verfahren 2,1-2,5 und für ein stabiles Signal warten.
  2. Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Stopfens unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 3-5 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal aufzuzeichnen erreicht.
    HINWEIS: Rotenon ist ein gefährliches Gift und kann erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben.
  3. Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Oxygraph chBernstein und Rekord mitochondriale Atmung für 3-5 Minuten, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  4. Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal ansteigt, stabilisiert, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min).
    HINWEIS: Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal auslösen wird (Zustand 3 Atmung) erhöhen. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern.

5. Komplex IV-abhängige Respiration

  1. Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal.
  2. Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM). Unmittelbar danach 2,5 & mgr; l von 0,2 injizierenM TMPD (0,25 mM) und 10 & mgr; l von 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Oxygraph Kammer und Aufzeichnung der Zellatmung, bis das Signal erhöht Sauerstofffluss und stabilisiert (3-5 min).
  3. injizieren schließlich 10 & mgr; l von 1 M Natriumazid (5 mM) "Vorsicht" in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert.
    HINWEIS: Natriumazid ein gefährliches Gift ist und einen erheblichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben kann.

6. Cytochrome C-Test

  1. Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal.
  2. Injizieren von 12,5 & mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 & mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Kammer Oxygraph isoliert mitochondriale Suspension mit (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer stopperund notieren Sie die Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.
  3. Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung mitochondrialen Atmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min).
  4. Schließlich injizieren 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 & mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird.

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Representative Results

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Komplexe I-abhängige Atmung

Isolierte mitochondrialer Komplex I abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 1 ist ein repräsentatives Diagramm). Mitochondriale Komplex I Substrate, Glutamat und Malat, werden durch die Zugabe von ADP zugegeben. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. RCR ist ein Index für die Kopplung von Sauerstoff zu ATP - Produktion Verbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand berechnet 4. Wie bei der Zugabe von ADP in Abbildung 1 gezeigt, sind die mitochondriale Atmungsrate steigt sofort (Zustand 3 Atmung), und dann sinkt (Zustand 4 Atmung) auf ein Niveau, sehr similar, die der Zustand 2. Dies deutet auf eine hohe RCR und dass die mitochondriale Integrität ist gut bei Isolierungsverfahren erhalten. 2 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 Atmungsrate und RCR, mit einem hohen Zustand 4 Atmungsrate, was darauf hinweist ungeeignet und erfolglose mitochondrialen Isolation. Eine hohe Atmungsrate bei Zustand 4 ist ein Indikator für die mitochondriale Proton leakiness 15.

Abbildung 1
Abbildung 1: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat und Malat als Substrate (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die oxygen Konzentration nimmt im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt ungeeignet mitochondrialen Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat und Malat als Substrate (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien die availab verwendenle Sauerstoff. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Komplexe II-abhängige Atmung

Isolierte mitochondrialer Komplex II abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 3 ist ein repräsentatives Diagramm). Für diesen Test wird die mitochondriale Komplex I durch Zugabe von Rotenon inhibiert, und dann Succinat (Komplex II Substrat) zugesetzt, gefolgt von ADP. 3 zeigt , dass bei Zugabe von ADP, die mitochondriale Atmung steigt sofort an und sinkt dann auf Werte sehr ähnlich der Zustand 2, was anzeigt , gut gekoppelten Mitochondrien und dassmitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Der berechnete RCR - Wert für dieses typischen Experiment ist 4,23, die mit den Werten in enger Übereinstimmung ist 10 in der Literatur gezeigt, 11, 23). 4 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 Atmungsrate und RCR, mit einem hohen Zustand 4 Atemfrequenz anzeigt , unangemessene Isolation.

Figur 3
Abbildung 3: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Succinat als Substrat (Komplex II-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Steigung vonSauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt , unangemessene Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Succinat als Substrat (Komplex II-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondria verwenden, um die verfügbaren Sauerstoff. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Komplex IV-abhängige Atmung

Isolierte mitochondrialer Komplex IV abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3) bestimmt unter Verwendung von hochauflösenden Respirometrie (Abbildung 5, ein repräsentatives Diagramm). Für diesen Test Ascorbat / TMPD und ADP werden zugegeben, gefolgt von Natriumazid, gefolgt Komplex IV zu inhibieren.

Der Unterschied zwischen der Sauerstoffverbrauch vor und nach Zugabe von Natriumazid wird als der reale Komplex IV Atmung interpretiert. 5 ist ein repräsentatives Diagramm measurement eines hohen Komplex IV-abhängige Atmungsrate Zustand 3 anzeigt, dass die mitochondriale Integrität auch bei Isolierungsverfahren erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu ist Figur 6 ist ein repräsentatives Diagramm der Messung einer niedrigen Zustand 3 anzeigt unangemessene Trennung.

Abbildung 5
Abbildung 5: Erfolgreiche mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Ascorbat / TMPD als Substrat (Komplex IV abhängigen Atmung). Komplex IV Atmung (Zustand 3) wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte mitochondria den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Erfolglose mitochondrialen Trennung: mitochondriale Integrität während des Isolierungsverfahrens anzeigt , unangemessene Isolation nicht gut erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Ascorbat / TMPD als Substrat (Komplex IV abhängigen Atmung). Komplex IV Atmung (Zustand 3) wird durch Subtrahieren des Sauerstoffverbrauchs vor und nach Zugabe von Natriumazid interpretiert. Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Der Sauerstoff concentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Auswertung der mitochondrialen Außenmembran Integrität Cytochrom c unter Verwendung von

Auszuwerten ist die Qualität der mitochondrialen Präparation, Cytochrom-c-Test durchgeführt, um die mitochondriale äußeren Membranintegrität bestimmen, durch Messung der mitochondrialen Atmung nach der anschließenden Zugabe von Glutamat und Malat, ADP und Cytochrom c (ADP stimuliert Komplex II-abhängigen Zustand 3 Atmung in der Anwesenheit von Cytochrom c). Wie in 7 gezeigt, ist Cytochrom c nicht komplex I-abhängigen Zustand 3 re verbessern spiration der isolierten Mitochondrien, was darauf hinweist, dass es aus der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Integrität erhalten bleibt kein Verlust von Cytochrom c war.

Figur 6
Abbildung 7: Cytochrome c erhöht nicht die Atmung des isolierten mitochondrialen: mitochondriale Integrität ist gut während des Isolierungsverfahren erhalten. Kurven von der hochauflösenden Respirometrie Verwendung Glutamat / Malat als Substrat (Komplex I-abhängige Atmung). Die blaue Linie stellt die Sauerstoffkonzentration. Die rote Linie stellt den Sauerstofffluss (Neigung der Sauerstoffkonzentration). Die Sauerstoffkonzentration verringert sich im Laufe der Zeit als isolierte Mitochondrien den verfügbaren Sauerstoff verwenden. Der Sauerstoffverbrauch wird als pmol / (sx mg mitochondrialen Protein) ausgedrückt.m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Mitochondriale Isolationspuffer
Chemisch Konzentration
KCl 100 mM
MgSO 4 10 mM
morpholinopropan sulfonsäure (MOPS) 50 mM
Ethylendinitrilotetraessigsäure (EGTA) 1,0 mM
ATP 1,1 mM
pH 7,4
Mitochondriale Waschpuffer
Chemisch Konzentration
KCl 100 mM
MOPS 50 mM
EGTA 0,5 mM
pH 7,4
Mitochondriale Atmung Puffer 16
Chemisch Konzentration
Sucrose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl 2 3,0 mM
KCl 80 mM
K-Lactobionat 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
Taurin 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1,0 g / L
pH 7,1

Tabelle 1: Die Zusammensetzung von Puffern.

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Discussion

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In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll hoher Qualität, intakt und eng gekoppelten Skelettmuskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden, die für funktionelle Studien wie hochauflösenden Respirometrie verwendet werden kann.

Um intakt und eng gekoppelten Mitochondrien zu isolieren, gibt es einige kritische Punkte im Rahmen der vorliegenden Protokoll berücksichtigt werden. Nach dem Skelettgewebe Ernte, sollte es sofort in eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer eingetaucht werden. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 4 ° C und mitochondriale Suspension durchgeführt werden sollte immer auf Eis während der Isolierung zu halten. Die Isolationsverfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Das Homogenat sollte in sauberen Waschmittel freien Zentrifugenröhrchen zentrifugiert werden. Am Ende des Verfahrens sollte die mitochondriale Suspension konzentriert werden aufbewahrt und unmittelbar vor verdünnt werden, um Respirationstest. Da Respirometrie Daten sind als pmol pro Sekunde pe ausgedrücktr Milligramm mitochondrialen Protein, ist es wichtig, eine gute Technik zu verwenden, um genau die mitochondriale Proteinkonzentration nach der Isolation messen.

In einigen Mitochondrien-Isolierungsverfahren kann es vorkommen, dass die Mitochondrien entkoppelt sind oder nicht verbrauchen Sauerstoff richtig hochauflösende Respirometrie verwenden. Um diese Probleme zu überwinden, sollte das Gewebe stets in der gleichen Weise homogenisiert werden (dieselbe Anzahl von Strichen) unter Verwendung des Homogenisators mit der lose sitzende Stößel (Schritt 1.12). Hier wir homogenisieren immer das Skelettmuskelgewebe mit 10 Hüben eines automatisierten Homogenisator. Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren. Das Einfrieren der Mitochondrien kann auch in abgekoppelt Mitochondrien führen und man sollte darauf achten, dass Zentrifugationen bei 4 ° C durchgeführt werden und nicht unter dieser temperatur. Die mitochondriale Integrität kann auch beeinträchtigt werden, wenn der pH der Pufferlösungen ist falsch oder die Zentrifugationsröhrchen sind nicht sauber. Man sollte sicherstellen, dass die Zentrifugenröhrchen sind Waschmittel frei und richtig gewaschen.

Einer der ersten wichtigen Faktoren bei der Isolierung betrachtet werden soll, Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weichteile erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet, während Hartgewebe viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugationen verwendet werden, sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein. Für harte Gewebe, wie Skelettmuskel, nach mechanischer Homogenisierung können Proteasen wie Trypsin zugegeben werden , um das Gewebe 4, 5 disaggregieren.

Einige der Einschränkungen der isolierten Mitochondrien, basierend auf dDifferenzweg Zentrifugation sind i) die möglicherweise beschädigten Mitochondrien während der Homogenisierung und Isolationsprozedur 19, ii) die großen Mengen der Gewebeproben für die mitochondriale Isolierung erforderlich ist , iii) der mögliche Verlust und Veränderungen in bestimmten mitochondrialen Elektronentransportkette Komplexe Untereinheiten während der Homogenisierung und Zentrifugationsschritte 18 und iv) die erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies während der Homogenisierung und Zentrifugationsschritte, die mit mitochondrialen Funktion 18 stören können. Die Vorteile der Dounce Homogenisierung und dem Differential Zentrifugationsverfahren , um rohe Mitochondrien für Atmungs Experimente in Bezug auf bestehende Verfahren wie Dichtegradientenzentrifugation 20 sind zu isolieren , dass das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb eines kurzen Zeitraums isoliert. Daher kann Atem Experimente innerhalb von 1 durchgeführt werden,h. Darüber hinaus ist das Verfahren preiswert, sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien können Respirometrie Assays verwendet werden. Die Untersuchung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung von isolierten Mitochondrien bietet mehrere Vorteile gegenüber permeabilisierten Fasern oder Zellen: keine signifikante Interferenz mit cytosolischen Proteinen, die mit mitochondrialen Funktion und Bioenergetik stören können; keine Notwendigkeit für zellulare Permeabilisierung; und Substrate der mitochondrialen Atmungskette Komplexe können direkt in den isolierten Mitochondrien hinzugefügt werden.

Eine der alternativen Methoden mitochondrialen Skelettmuskel Atmung zu messen , ist die Verwendung permeabilisierten Muskelfasern 9. Einige der Vorteile der permeabilisierten Muskelfasern über isolierte Mitochondrien sind i) keine mechanische Homogenisierung Schritt ist erforderlich, und ii) sehr kleine Mengen an Gewebe (wenige mg) für Respirometrie Assays erforderlich sind. Der Nachteil permeabilized Muskelfaser ist die geringere Sauerstoffdiffusion in die Mitochondrien in das Faserbündel. Diese Diffusionsbeschränkung erfordert größere Mengen an ADP während Respirometrie Assays. Ein weiteres alternatives Verfahren ist die Verwendung von Voll Gewebehomogenaten 22, die ein sehr schnelles Verfahren und erfordert keine differentielle Zentrifugationsschritte Mitochondrien zu isolieren. Verwendung von ganzen Gewebehomogenat kann den Verlust einiger Mitochondrien während der Isolierung zu verhindern, aber es können auch andere cytosolische Faktoren vorliegen, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können.

Nachdem die differentielle Zentrifugation Mastering rohe Mitochondrien für Atemtests zu isolieren, eine zukünftige Anwendung ist es, die Atem Kapazitäten der Mitochondrien über neue Techniken wie mit der mitochondrialen Außenmembran anti-TOM22 (Translokase der äußeren Membran der Mitochondrien 22 Homolog) Antikörper-coupl isoliert zu untersuchened magnetische Kügelchen 21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

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References

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Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest
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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

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