Isolering av Intakt Mitokondrier från skelettmuskulatur genom differentialcentrifugering för Högupplösta respirometri Mätningar

Summary

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Abstract

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Introduction

Mitokondriella bioenergetik och andningskapacitet kan studeras inte bara i permeabiliserade celler eller fibrer utan även i isolerade mitokondrier. I den aktuella studien beskriver vi ett protokoll för att isolera intakta skelettmuskel mitokondrier med hjälp av differentialcentrifugering för hög upplösning respiration mätningar.

För att isolera intakta mitokondrier för respiration är vävnaden homogeniseras och mitokondrier isoleras genom en konventionell differentialcentrifugeringsmetoden. Differentialcentrifugeringsmetoden är baserad på sekventiella centrifuge (i en serie ökande hastighet) av vävnadshomogenat infördes först av Pallade och medarbetare nästan 70 år sedan ^en. Vävnaden först malet med sax och homogeniseras mekaniskt i en glashomogenisator med en löst sittande mortelstöt. Efteråt homogenatet centrifugeras vid låg hastighet och den resulterande pelleten som innehåller obruten vävnad, cellulärskräp och kärnor kastas. Sedan, supernatanten centrifugerades flera gånger med hög hastighet och den mitokondriella anrikad fraktion uppsamlas. Fördelarna med differentialcentrifugeringsmetoden för att isolera mitokondrierna är att: i) Metoden är snabb och mitokondrier kan isoleras inom 1-1,5 h (experiment andnings bör utföras så snabbt som möjligt); ii) det är billigt, och iii) det är mycket effektiv och mitokondrier erhålls genom differentiell centrifugering är tillräckligt ren för respiration analyser. Nackdelarna med differentiell centrifugering metod för att isolera mitokondrierna är att i) mitokondrier kan skadas och okopplade under homogenisering; ii) kontaminering av mitokondrierna med andra cellulära komponenter (skulle kunna lösas genom ytterligare tvättning den mitokondriella pelletten med ytterligare centrifugeringssteg); iii) möjligheten att välja olika mitokondriella subpopulationer, t.ex. under differentialcentrifuge steg, mitochondria med lägre tät kan uteslutas ^7; och iv) mitokondriella cellulära omgivningen saknas och endast teoretisk maximal andning kan mätas. En annan metod för att isolera mitokondrier för respiration analyser är densitetsgradientcentrifugering ^två. I denna teknik är vävnadsextraktet skiktad över en lösning av sackaros eller en Percoll gradient (med högre densitet i botten av centrifugeringsröret) och centrifugerades vid en viss hastighet, vilket gör att mitokondrierna att vara isolerad från andra cellulära komponenter i enlighet med deras densiteter. Denna metod används ofta för att isolera hjärn mitokondrier med mycket låg förorening från synaptosomer. Emellertid är mitokondrier från råttlever isolerades genom densitetsgradientcentrifugering höggradigt förorenade med andra cellulära organeller ^3. En av begränsningarna med denna metod är att den sackarosgradient närvarande i centrifugeringsröret kan brista såmig mitokondrier (osmotisk chock).

Beroende på vilken typ av vävnad; det finns några viktiga faktorer att tänka på för isolering av intakt mitokondrier genom differentialcentrifugering. Den första nödvändighet är att homogenisera vävnaden på ett skonsamt sätt. Mjuka vävnader såsom njure, hjärna och lever kräver milda mekaniska krafter som tillämpas under homogenisering. Detta står i kontrast med hårda vävnader, såsom hjärt- och skelettmuskler som kräver mycket starkare mekaniska krafter. Den malda vävnaden behandlas vanligen med proteinas före homogeniseringen för att mjuka vävnaden. Alla buffertar som används under homogenisering och centrifugering bör vara iskall och har ett fysiologiskt relevant pH med en jonisk och osmotisk styrka kompatibel med cytosolen ^{4, 5.}

En av fördelarna med att studera isolerade mitokondrie bioenergetik är att cellplasmamembran behöver inte vara permeabiseras med detergenter såsom digitonin eller saponin ^{4, 6,} som kan äventyra den mitokondriella yttermembranintegritet. En annan fördel med den isolerade mitokondrier är frånvaron av andra cytosoliska faktorer som kan störa analysen av mitokondriella funktioner som syreförbrukning. Nackdelarna med att använda de isolerade mitokondrier är möjliga urval av vissa mitokondriella populationer under centrifugeringsstegen, skada på mitokondrier under homogenisering, och kravet på stora mängder av biologiska prover för att få en bra avkastning på isolerade mitokondrier ^{7, 8.}

Efter isoleringsförfarandet, andnings andelen mitokondriella komplex I-, II- och IV-beroende (stater 2, 3 och 4) bestäms med hjälp av hög upplösning respiration. För komplexa I driven andning, glutamatoch malat tillsättes följt av adenosindifosfat (ADP). För komplexa II driven andning, är succinat följt av ADP. För komplexa IV driven andning, askorbat och tetramethylphenylendiamine (TMPD) tillsätts följt av ADP ^{9, 10, 11, 12.} State 2 avser syreförbrukning i närvaro av enbart substrat. Tillstånd 3 avser syreförbrukning i närvaro av substrat och ADP. State 4 avser syreförbrukning efter ADP utarmning. Den respiratoriska kontrollen förhållandet (RCR) är ett index av koppling av syreförbrukning ATP-produktion och beräknas som förhållandet mellan tillstånd 3 och stat 4 ^{13, 15.}

Sammanfattningsvis beskriver vi ett protokoll för att isolera funktionella och intakta skelettmuskel mitokondrier genom differentiell centrifugering och använda dessa isolerade mitochonDRIA för funktionella och bioenergetiska studier såsom hög upplösning respiration.

Protocol

Quadricepsmuskeln biopsi tas från en bedövad gris, från vilken mitokondrier isoleras genom differentialcentrifugering. Grisen används efteråt för ett annat experiment. Studien genomförs i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och med godkännande av Animal Care kommittén i kantonen Bern, Schweiz. 1. Skelettmuskel homogenisering och Mitokondriell Isolering Punkt 5-10 g quadriceps muskelprov från en bedöva…

Representative Results

Komplex I-beroende andning Isolerade mitokondriella komplexa I-beroende andningsfrekvens (stater 2, 3 och 4) bestäms med hjälp av hög upplösning respiration (Figur 1, ett representativt diagram). Mitokondriella komplexa I- substrat, glutamat och målat, tillsättes följt av tillsats av ADP. Tillståndet 2 hänför sig till syreförbrukningen i närvaro av de ensamma substrat. Tillstånd 3…

Discussion

I den aktuella studien beskriver vi ett protokoll för att isolera hög kvalitet, intakta och tätt kopplade skelettmuskel mitokondrier genom differentiell centrifugering som kan användas för funktionella studier såsom hög upplösning respiration.

För att isolera intakta och tätt kopplade mitokondrier, det finns några kritiska punkter som skall beaktas inom det nuvarande protokollet. Efter skörd av benvävnad, bör det omedelbart ned i iskall mitokondriell isoleringsbuffert. Alla cen…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
ATP	Sigma	A 7699	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
EGTA	fluka	3779	Chemical
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)	Merck	1.06129	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial	Sigma	P 8038	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser	schuett-biotec GmbH	3.201 011	Tissue homogenizer
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical