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Biology

L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

doi: 10.3791/55251 Published: March 8, 2017

Introduction

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bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione.

Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tessuti è stato introdotto da Pallade e collaboratori quasi 70 anni fa 1. Il tessuto viene prima tritata con le forbici e omogeneizzato meccanicamente in un omogeneizzatore di vetro con un pestello larghi. Successivamente l'omogenato viene centrifugato a bassa velocità e il pellet risultante che contiene tessuto ininterrotta, cellulardetriti e nuclei viene scartato. Poi, il surnatante viene centrifugato più volte ad alta velocità e la frazione arricchita mitocondriale viene raccolta. I vantaggi del metodo differenziale centrifugazione per isolare i mitocondri sono che: i) il metodo è veloce e mitocondri può essere isolato all'interno 1-1,5 h (esperimenti respiratorie devono essere eseguite più velocemente possibile); ii) è poco costoso; e iii) è molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale sono abbastanza puro per analisi respirometria. Gli svantaggi di metodo centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri sono che i) i mitocondri possano venire danneggiati e sganciato durante l'omogeneizzazione; ii) la contaminazione dei mitocondri con altri componenti cellulari (potrebbe essere risolto ulteriore lavaggio del pellet mitocondriale con fasi di centrifugazione accessorie); iii) la possibilità di selezionare differenti sottopopolazioni mitocondriali, per esempio, durante centrifugazioni differenziali gradini, mitochondria con denso inferiore può essere esclusa 7; e iv) l'mitocondriale circostante cellulare è mancante e solo la respirazione massimo teorico può essere misurata. Un altro metodo per isolare mitocondri per i saggi respirometria è il gradiente di centrifugazione densità 2. In questa tecnica, l'estratto tissutale è stratificato su una soluzione di saccarosio o un gradiente Percoll (con densità maggiore nella parte inferiore del tubo di centrifugazione) e centrifugati a una certa velocità, causando i mitocondri essere isolati da altri componenti cellulari secondo la loro densità. Questo metodo viene spesso utilizzato per isolare i mitocondri cerebrali con molto bassa contaminazione da sinaptosomi. Tuttavia, i mitocondri di fegato di ratto isolati dal gradiente di densità centrifugazione sono altamente contaminati con altri organelli cellulari 3. Uno dei limiti di questo metodo è che il gradiente di saccarosio presente nel tubo di centrifugazione può rompersi cosìMi mitocondri (shock osmotico).

A seconda del tipo di tessuto; ci sono alcuni fattori importanti da considerare per l'isolamento dei mitocondri intatti mediante centrifugazione differenziale. La prima necessità è di omogeneizzare i tessuti in un modo delicato. I tessuti molli come il rene, cervello e fegato richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l'omogeneizzazione. Questo contrasta con i tessuti duri come il muscolo cardiaco e scheletrico che richiedono forze meccaniche molto più forti. Il tessuto tritato è di solito trattato con proteinasi prima della omogeneizzazione per ammorbidire i tessuti. Tutti i buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione devono essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citosol 4, 5.

Uno dei vantaggi di studiare isolato bioenergetica mitocondriale è che le membrane plasmatiche cellulari non devono essere permeabilitàzato con detergenti quali digitonina o saponina 4, 6, che potrebbero compromettere l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Un altro vantaggio del mitocondri isolati è l'assenza di altri fattori citosolici, che possono interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno. Gli svantaggi di usare mitocondri isolati sono possibili selezione di alcune popolazioni mitocondriali durante le fasi di centrifugazione, danni ai mitocondri durante l'omogeneizzazione, e la necessità di elevate quantità di campioni biologici per ottenere una buona resa di mitocondri isolati 7, 8.

Dopo la procedura di isolamento, la frequenza respiratoria dei complessi mitocondriali I-, II- e IV-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per complesso I-guidato la respirazione, il glutammatoe malato sono aggiunti seguito da adenosina difosfato (ADP). Per complesso respirazione II-driven, succinato è aggiunto seguito da ADP. Per complesso IV-driven respirazione, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) sono aggiunti seguiti da ADP 9, 10, 11, 12. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza di substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l'esaurimento ADP. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è un indice di accoppiamento della produzione di ATP consumo di ossigeno e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e 4 dello stato 13, 15.

In sintesi, si descrive un protocollo per isolare i mitocondri dei muscoli scheletrici e funzionali intatti per centrifugazione differenziale e utilizzare questi isolati mitochondria per studi funzionali e bioenergetici, come ad alta risoluzione respirometria.

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Protocol

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La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera.

1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitocondriale

  1. Excise 5-10 esemplare g muscolo quadricipite da un maiale anestetizzato. Nel presente saggio, usare muscolo scheletrico suina. Questo protocollo può anche essere utilizzata per isolare mitocondri da altre specie (ad esempio, ratti, topi, umano, ecc.).
    NOTA: Questa fase viene eseguita da un medico specialista con esperienza in chirurgia.
    1. maiali sedare con ketamina intramuscolare (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), prima dell'anestesia è indotta con intramidazolam venosa (0,5 mg / kg, più atropina 0,02 mg / kg). Mantenere l'anestesia con continue infusioni endovenose di propofol (4-8 mg / kg per h) e fentanyl (30 mg / kg per h) durante l'intervento chirurgico.
  2. Immergere immediatamente il campione di tessuto in un becher contenente 20 mL di tampone isolamento mitocondriale ghiacciata (Tabella 1).
    NOTA: buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione dovrebbe essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citoplasma.
  3. Pesare il campione di tessuto nel becher su una bilancia analitica tarato. La tara con becher contenente 20 mL di tampone di isolamento.
  4. Porre il bicchiere in un secchio di ghiaccio.
    NOTA: eseguire tutti i passi successivi per la procedura di omogeneizzazione alla temperatura secchiello del ghiaccio e mantenere tutti i buffer sul secchiello del ghiaccio.
  5. Tritare il muscolo scheletrico nel bicchiere (tenere in ghiaccio) in 1-2 mm piccoli pezzi per 3-4 minuti utilizzando SCISS beneors.
  6. Risciacquare il tessuto tritato nel bicchiere due volte con ghiaccio buffer di isolamento a freddo (20 ml ciascuna fase di lavaggio).
  7. Sospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) contenente 5 mg proteasi / g di tessuto.
  8. Porre il becher in un bagno di ghiaccio sulla agitatore magnetico e agitare per 10 min.
  9. Diluire la sospensione nel becher con ulteriori 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% (peso / volume) di albumina di siero bovino sgrassata (BSA).
  10. Decantare tutto il buffer di isolamento integrato con 0,2% BSA e sciacquare il tessuto nel becher due volte con tampone di ghiaccio freddo isolamento integrato con 0,2% BSA (20 mL ciascuna fase di lavaggio).
  11. Risospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% BSA sgrassata.
  12. Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore di vetro semi-automatico (tenuti in ghiaccio) con un pestello larghi (10 colpi).
    NOTA: Homogenizall'e tessuto sempre nello stesso modo (lo stesso numero di colpi, ad esempio, 10 colpi). Un numero maggiore di colpi può danneggiare e disaccoppiare i mitocondri. Preferibilmente, omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore automatizzato. Manualmente (e soggettivamente) campioni di tessuto omogeneizzati in omogeneizzatori di vetro possono produrre diverse qualità di mitocondri isolati.
  13. Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 4 ° C per 10 min a 10.000 x g.
    NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite in centrifughe con rotori ad angolo fisso.
  14. Eliminare il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere il pellet in terreno di isolamento ghiacciata BSA-integrato (10 ml / g di tessuto).
  15. Centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 350 x g.
  16. Prenotate il surnatante con una pipetta sierologica e scartare il pellet (detriti cellulari).
  17. Filtrare il surnatante in un becher (tenuti in ghiaccio) attraverso due strati di garza (17 fili / cm 2) per rimuovere DEBR celluleè.
  18. Centrifugare la sospensione filtrata a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
  19. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale grezzo nel buffer di isolamento (5 mL / g di tessuto) supplementato con 0,2% (peso / volume) BSA e centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
  20. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio (tabella 1). Centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
  21. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio e centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g.
  22. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio in 1,0 ml di tampone di lavaggio.
  23. Determinare la concentrazione proteica della sospensione mitocondriale e mantenere la sospensione mitocondriale concentrata su ghiaccio.
    NOTA: la concentrazione di proteine ​​può essere misurata con qualsiasi metodo standard.
  24. Appena primaper Respirometria saggi, risospendere la sospensione mitocondriale nel buffer respirazione ad una concentrazione finale di 0,4 mg mL proteine ​​/ mitocondriale.

2. ad alta risoluzione respirometria

  1. Pipettare 2.1 mL di tampone respirazione (Tabella 1) 16 in una camera oxygraph ad alta risoluzione e mescolare il buffer continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C per 1 h fino a quando un segnale di ossigeno flusso stabile di il sensore di ossigeno polarografico si ottiene.
    NOTA: gli elettrodi di ossigeno polarografici all'interno di ciascuna camera oxygraph misurano la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno (flusso) all'interno di ciascuna camera. La concentrazione di ossigeno e tassi di consumo di ossigeno (flusso) sono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Inoltre, al fine di garantire risultati accurati e affidabili, ossigeno strumentale correzione del fondo dovrebbe essereeseguite in conformità alle istruzioni del produttore.
    NOTA: Accurato 2.1 mL di tampone di respirazione viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi.
  2. Eseguire una taratura dell'aria del sensore di ossigeno polarografico secondo protocolli 17 del produttore.
    NOTA: Durante la taratura dell'aria, con una fase gassosa presente, la concentrazione di ossigeno media sarà equilibrare dell'ordine di 15-20 min. A seconda della temperatura, pressione barometrica, e la solubilità della concentrazione dei media -oxygen può essere calcolato.
  3. Dopo la calibrazione dell'aria, aspirare il terreno respirazione dalla camera oxygraph e aggiungere 2,1 ml di sospensione mitocondriale isolata (0,4 mg / ml proteina mitocondriale) dal passaggio 1,24 a una sezione del oxygraph.
    NOTA: Il volume di tampone respirazione dipende dallo strumento impostare e produttore. Per respirometria alta risoluzione, i 2,1 ml di bu respirazioneffer viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi.
  4. Chiudere la camera oxygraph mediante inserimento del tappo.
  5. Mescolare la sospensione mitocondriale continuo mediante una barra magnetica agitazione presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C e registrare la respirazione cellulare al basale per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
    NOTA: la concentrazione di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno vengono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati 17.
  6. Successivamente, iniettare substrati e inibitori della respirazione mitocondriale attraverso i fori di iniezione di titanio dei tappi utilizzando i seguenti protocolli standard.

3. Complesso respirazione I-dipendente

  1. Preparare una camera oxygraph contenente la sospensione isolata mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 eattendere un segnale stabile.
  2. Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camera ed registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
    NOTA: Tutte le iniezioni nei seguenti operazioni vengono eseguite attraverso i fori di iniezione titanio di tappi che utilizzano siringhe.
  3. Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione mitocondriale fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
    NOTA: L'altopiano della respirazione dopo l'aggiunta di ADP indica che la concentrazione di ADP era alto e saturazione. A seconda della quantità di mitocondri utilizzati durante la respirazione, concentrazione ADP deve essere titolatoper uno stato 3 il consumo di ossigeno stabile (respirazione massima). L'aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l'ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione).

4. Complesso respirazione II-dipendente

  1. Preparare una camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 e attendere un segnale stabile.
  2. Iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 pM) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo della camera con una siringa e registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto.
    NOTA: Rotenone è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana.
  3. Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mm) nel ch oxygraphambra e registrare la respirazione mitocondriale per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile si ottiene.
  4. Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione cellulare fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, stabilizza, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
    NOTA: L'aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l'ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione).

5. Complesso respirazione IV-dipendente

  1. Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile.
  2. Poi iniettare 2,5 ml di 0,8 mm ascorbato (1 mm). Subito dopo l'iniezione di 2,5 ml di 0,2M TMPD (0,25 mM) e 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza (3-5 min).
  3. Infine iniettare 10 ml di 1 M sodio azide (5 mm) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
    NOTA: Sodio azide è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana.

6. citocromo C test

  1. Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile.
  2. Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camerae registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
  3. Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo camera e registrare respirazione mitocondriale fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min).
  4. Infine, iniettare 5 ml di 4 mM citocromo c (10 pM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

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Representative Results

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Complesso I-dipendente respirazione

Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l'aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l'esaurimento ADP. RCR è un indice del giunto di consumo di ossigeno per la produzione di ATP e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e stato 4. Come mostrato in figura 1, dopo l'aggiunta di ADP, aumenta il tasso di respirazione mitocondriale immediatamente (stato 3 della respirazione), e poi diminuisce (stato 4 della respirazione) a livelli molto sanaloghe sui a quella di stato 2. Questo indica un elevato RCR e che l'integrità mitocondriale è ben conservato durante la procedura di isolamento. La figura 2 è uno schema rappresentativo di misurazione di uno stato 3 basso tasso di respirazione e RCR, con un alto stato 4 tasso di respirazione, indicando contenuti e fallimentare isolamento mitocondriale. Un alto tasso di respirazione allo stato 4 è un indicatore di protonica mitocondriale leakiness 15.

Figura 1
Figura 1: isolamento mitocondriale di successo: mitocondriale integrità è ben conservato durante la procedura di isolamento. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando il glutammato e malato come substrati (complesso I-dipendente la respirazione). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). la Oxyconcentrazione gen diminuisce nel tempo, come i mitocondri isolati utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: non riuscita isolamento mitocondriale: mitocondriale integrità non è ben conservato durante la procedura di isolamento che indica inadeguato isolamento mitocondriale. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando il glutammato e malato come substrati (complesso I-dipendente la respirazione). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo, come i mitocondri isolati utilizzano il disponibille ossigeno. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Complesso respirazione II-dipendente

Isolato mitocondriale complessi frequenza respiratoria II-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (Figura 3, un diagramma rappresentante). Per questo test, il complesso I mitocondriale è inibita dall'aggiunta di rotenone, quindi succinato (substrato II complesso) viene aggiunto seguito da ADP. La figura 3 mostra che in seguito all'aggiunta di ADP, respirazione mitocondriale aumenta immediatamente, e quindi diminuisce a livelli molto simili a quella di stato 2, indicando mitocondri ben accoppiati e cheintegrità mitocondriale è ben conservato durante la procedura di isolamento. Il valore RCR calcolato per questo esperimento tipico è 4,23, che è in stretto accordo con i valori riportati in letteratura disponibile 10, 11, 23). La figura 4 è uno schema rappresentativo di misurazione di uno stato 3 basso tasso di respirazione e RCR, con un alto stato 4 tasso respiratorio indicando isolamento appropriato.

Figura 3
Figura 3: isolamento mitocondriale di successo: mitocondriale integrità è ben conservato durante la procedura di isolamento. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando succinato come substrato (complesso respirazione II-dipendente). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenzaconcentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come mitocondri isolati utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: non riuscita isolamento mitocondriale: mitocondriale integrità non è ben conservato durante la procedura di isolamento che indica l'isolamento inadeguato. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando succinato come substrato (complesso respirazione II-dipendente). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come Mitoc isolatohondria utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Complesso IV-dipendente respirazione

Isolati tassi IV-dipendente complessi respiratoria mitocondriale (stati 2, 3) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 5, un diagramma rappresentante). Per questo test ascorbato / TMPD e ADP sono aggiunti, seguito da azide di sodio per inibire complesso IV.

La differenza tra il consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide viene interpretato come il vero IV respirazione complesso. La figura 5 è uno schema rappresentativo di measurement di un elevato stato di 3 tasso di respirazione IV-dipendente complesso che indica che l'integrità mitocondriale è ben conservato durante la procedura di isolamento. In contrasto, la figura 6 è uno schema rappresentativo di misura di un basso stato 3 indica isolamento appropriato.

Figura 5
Figura 5: isolamento mitocondriale di successo: mitocondriale integrità è ben conservato durante la procedura di isolamento. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando ascorbato / TMPD come substrato (complesso respirazione IV-dipendente). Complesso IV respirazione (stato 3) viene interpretato sottraendo il consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide. La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come mitocho isolatondria utilizzare l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: non riuscita isolamento mitocondriale: mitocondriale integrità non è ben conservato durante la procedura di isolamento che indica l'isolamento inadeguato. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando ascorbato / TMPD come substrato (complesso respirazione IV-dipendente). Complesso IV respirazione (stato 3) viene interpretato sottraendo il consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide. La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). Il conce ossigenontration diminuisce nel tempo, come i mitocondri isolati utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Valutazione dell'integrità membrana esterna mitocondriale utilizzando citocromo c

Per valutare la qualità della preparazione mitocondriale, prova citocromo c è eseguita per determinare l'integrità della membrana esterna mitocondriale, mediante misurazione della respirazione mitocondriale dopo la successiva aggiunta di glutammato e malato, ADP e citocromo c (ADP stimolato complesso II-dipendente stato 3 della respirazione nel presenza di citocromo c). Come mostrato in figura 7, citocromo c non aumentare complesso stato 3 ri I-dipendente spirazione dei mitocondri isolati, che indica che non vi era alcuna perdita di citocromo c dalla membrana mitocondriale esterna e l'integrità mitocondriale è conservato.

Figura 6
Figura 7: Citocromo c non migliora la respirazione del mitocondriale isolato: l'integrità mitocondriale è ben conservato durante la procedura di isolamento. Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando glutammato / malato come substrato (complesso I-dipendente la respirazione). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno. La linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come mitocondri isolati utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (proteina mitocondriale sx mg).m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Buffer di isolamento mitocondriale
chimico Concentrazione
KCl 100 mM
MgSO 4 10 mM
solfonico morpholinopropane (MOPS) 50 mm
L'acido etilendinitrilotetracetico (EGTA) 1,0 mm
ATP 1.1 mM
pH 7.4
Tampone di lavaggio mitocondriale
chimico Concentrazione
KCl 100 mM
MOPS 50 mm
EGTA 0,5 mm
pH 7.4
Buffer di respirazione mitocondriale 16
chimico Concentrazione
Saccarosio 110 mm
EGTA 0,5 mm
MgCl 2 3,0 mm
KCl 80 mM
K-lattobionato 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
Taurina 20 mm
Hepes 20 mm
BSA 1,0 g / L
pH 7,1

Tabella 1: La composizione di buffer.

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Discussion

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Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria.

Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all'interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolamento mitocondriale ghiacciato. Tutte le fasi di centrifugazione devono essere effettuate a 4 ° C e la sospensione mitocondriale devono essere tenuti sempre in ghiaccio durante l'isolamento. La procedura di isolamento deve essere fatto il più rapidamente possibile. L'omogeneizzato dovrebbe essere immesso in provette da centrifuga senza detergente pulito. Al termine della procedura, la sospensione mitocondriale dovrebbe essere mantenuto concentrato e diluito immediatamente prima respirometria. Dal momento che i dati sono espressi come respirometria pmol al secondo per milligrammo di proteina mitocondriale, è importante utilizzare una buona tecnica per misurare con precisione la concentrazione proteica mitocondriale dopo l'isolamento.

In alcune procedure di isolamento mitocondriali, può accadere che i mitocondri sono disaccoppiati o non consumano l'ossigeno correttamente utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per superare questi problemi, il tessuto deve sempre essere omogeneizzato nello stesso modo (lo stesso numero di colpi) usando l'omogeneizzatore con il pestello larghi (passo 1.12). Qui, abbiamo sempre omogeneizzare il tessuto muscolare scheletrico utilizzando un omogeneizzatore automatizzata con 10 colpi. Un numero maggiore di colpi può danneggiare e disaccoppiare i mitocondri. Manualmente (e soggettivamente) campioni di tessuto omogeneizzati in omogeneizzatori di vetro possono produrre diverse qualità di mitocondri isolati. Congelamento dei mitocondri può anche provocare mitocondri disaccoppiati e si deve fare in modo che centrifugazioni sono fatte a 4 ° C e non sotto questo temperature. L'integrità mitocondriale può essere compromessa anche se il pH delle soluzioni tampone è corretto o tubi centrifugazione non sono pulite. Si dovrebbe fare in modo che i tubi di centrifugazione sono privi di detergente e adeguatamente lavate.

Uno dei primi importanti fattori da considerare durante l'isolamento è omogeneizzare tessuti in un modo delicato. I tessuti molli richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l'omogeneizzazione, mentre i tessuti duri richiedono forze meccaniche molto più forti. Buffer utilizzati durante l'omogeneizzazione e centrifugazione dovrebbe essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citoplasma. Per tessuti duri come i muscoli scheletrici, dopo omogeneizzazione meccanica, proteasi quali tripsina possono essere aggiunti disaggregare ulteriormente il tessuto 4, 5.

Alcune delle limitazioni di mitocondri isolati, sulla base dcentrifugazione ifferenziale sono i) i mitocondri eventualmente danneggiato durante la procedura di omogeneizzazione e di isolamento 19, ii) la grande quantità di campioni di tessuto necessari per l'isolamento mitocondriale, iii) l'eventuale perdita e alterazioni in alcuni elettroni mitocondriale complessi della catena di trasporto subunità durante l'omogeneizzazione e centrifugazione i passaggi 18, e iv) l'aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno durante l'omogeneizzazione e centrifugazione passi, che possono interferire con la funzione mitocondriale 18. I vantaggi della omogeneizzazione Dounce e il metodo centrifugazione differenziale per isolare mitocondri greggio per esperimenti respiratorie rispetto ai metodi esistenti quali centrifugazione in gradiente di densità 20 sono che il metodo è veloce e mitocondri sono isolati in un breve periodo di tempo. Pertanto esperimenti respiratori possono essere eseguite all'interno di 1h. Inoltre, la procedura è poco costoso, molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale può essere utilizzato per i test respirometria. L'indagine del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando mitocondri isolati offre diversi vantaggi rispetto alle fibre o cellule permeabilizzate: nessuna interferenza significativa con le proteine ​​citosoliche che possono interferire con la funzione mitocondriale e bioenergetica; nessuna necessità di permeabilizzazione cellulare; e substrati dei complessi della catena respiratoria mitocondriale possono essere aggiunti direttamente ai mitocondri isolati.

Uno dei metodi alternativi per misurare muscolo scheletrico respirazione mitocondriale è l'uso permeabilizzate fibre muscolari 9. Alcuni dei vantaggi delle fibre muscolari permeabilizzate oltre mitocondri isolati sono i) non è necessaria alcuna fase di omogeneizzazione meccanica e, ii) piccole quantità di tessuto (pochi mg) sono necessari per saggi respirometria. Lo svantaggio di pfibra muscolare ermeabilized è la diffusione di ossigeno inferiore ai mitocondri nel fascio di fibre. Questa restrizione diffusione richiede grandi quantità di ADP durante saggi respirometria. Un altro metodo alternativo è l'uso di omogenati di tessuti interi 22, che è un metodo molto semplice e non richiede fasi di centrifugazione differenziale per isolare mitocondri. Uso di tutta omogenato tissutale può prevenire la perdita di alcuni mitocondri durante il loro isolamento, ma vi possono essere altri fattori citosolici presenti, che possono interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno.

Dopo aver imparato la centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri greggio per le analisi delle vie respiratorie, una futura applicazione è quello di indagare le capacità respiratorie dei mitocondri isolati tramite tecniche emergenti come l'utilizzo della membrana mitocondriale esterna anti-TOM22 (traslocasi di mitocondriale esterna della membrana 22 omologo) anticorpo-copsfere magnetiche eD 21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

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References

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L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure
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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

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