Summary
تفاصيل هذا البروتوكول طريقة تخصيص لقياس الهجرة الخلية ردا على chemoattractants التي يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد معدل انتشار المخدرات من البوليمر.
Abstract
هجرة الخلايا هي جزء حيوي من الاستجابات المناعية، والنمو، والتئام الجروح. هجرة الخلية هي عملية معقدة تنطوي على تفاعلات بين الخلايا، المصفوفة خارج الخلية، والعوامل الكيميائية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (على سبيل المثال، chemoattractants). طرق معيارية لقياس الهجرة من الخلايا، مثل فحص غرفة بويدن، والعمل عن طريق عد الخلايا على جانبي الفاصل. هذه التقنيات هي سهلة الاستخدام. ومع ذلك، وأنها توفر القليل من التعديل الهندسي لمختلف التطبيقات. في المقابل، وأجهزة ميكروفلويديك يمكن استخدامها لمراقبة الهجرة الخلية مع التدرجات تركيز قابلة للتخصيص من العوامل القابلة للذوبان 1 و 2. ومع ذلك، يمكن أساليب لجعل فحوصات على microfluidics أساس أن يكون من الصعب معرفة.
هنا، نحن تصف طريقة سهلة لإنشاء غرف زراعة الخلايا لقياس الهجرة الخلية ردا على التدرجات تركيز الكيميائية. لدينا ميل خليةغرايشن طريقة الغرفة يمكن أن تخلق مختلفة التدرجات تركيز الخطية لدراسة الهجرة خلية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. هذه الطريقة سهلة نسبيا للاستخدام، وعادة ما يقوم بها طلاب المرحلة الجامعية.
تم إنشاء غرفة متناهية عن طريق وضع إدراج الاكريليك على شكل غرفة متناهية النهائية جيدا في طبق بيتري. بعد ذلك، تم صب بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) على رأس إدراج. سمح للPDMS لتتصلب ومن ثم تم إزالة إدراج. وهذا ما سمح لإنشاء الآبار في أي الشكل المطلوب أو الحجم. ويمكن إضافة الخلايا بعد ذلك إلى غرفة متناهية، ويمكن إضافة عوامل قابلة للذوبان في واحدة من الآبار عن طريق نقع كتلة الاغاروز في عامل المرجوة. يضاف كتلة الاغاروز إلى إحدى الآبار، والصور الوقت الفاصل يمكن اتخاذها للغرفة متناهية من أجل تحديد الهجرة الخلية. الاختلافات إلى هذا الأسلوب يمكن أن يتم لتطبيق معين، مما يجعل هذه الطريقة المهزومةHLY للتخصيص.
Protocol
1. إعداد وثيقة غرفة متناهية لإنشاء التدرج تركيز
- قطع العفن قطعة الاكريليك
- الحصول على قطعة من الاكريليك من العرض المطلوب. عادة ما تستخدم ورقة 1 الاكريليك / 16 بوصة سميكة. ورقة سميكة يصعب خفض جيدا ورقيقة جدا ورقة لم يكن لديك القوة الميكانيكية المطلوبة، مما يسبب لهم لكسر أو تشوه أثناء العملية.
- إنشاء ملف CAD مع الشكل المطلوب للقطعة الاكريليك لإنتاج تجويف داخل ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS). ضبط عرض القناة وطول لتحقيق التدرج المطلوب صلة البروتوكولات التجريبية الفردية.
- هنا، استخدم قطعة الاكريليك من الأبعاد التالية: مربعين (0،254 سم × 0.254 سم) متصلة بواسطة 0.127 سم قناة واسعة (0.254 سم) (الشكل 1).
- استيراد ملف CAD في الجهاز القطع بالليزر ووضع قطعة الاكريليك في قطع الليزر وفقا لمانوبروتوكول facturer و.
ملاحظة: بدلا من ذلك، 3D-طباعة قطعة من تصميم CAD. وميزة هذه الطريقة هي أن المواد بديلة يمكن استخدامها لالقالب. ومع ذلك، يمكن تخفيض هذا القرار، واستنساخ مع 3D الطباعة بالمقارنة مع القطع بالليزر.
الشكل 1: (CAD) التمثيل بمساعدة الحاسوب تصميم غرفة متناهية. هذه الصورة يصور الرسم CAD من إدراج الاكريليك اللازمة لإنشاء غرفة متناهية. 1 أ) أعلى نظرا CAD الرسم، 1B) منظر جانبي من CAD الرسم مع أبعاد بوصة، 1C) أعلى نظرا CAD الرسم مع أبعاد بوصة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- في وزن القارب، مزيج 10 أجزاء وزنا من قاعدة المرنة التجارية (مثل Sylgard 184) مع 1 جزء وزنا من وكيل علاج التجارية المرنة (على سبيل المثال Sylgard 194). عادة، مزج 10 غراما من قاعدة المرنة إلى 1 غرام من وكيل علاج المرنة.
- يحرك المزيج حتى الجمع بين القاعدة وكيل علاج مع micropipette لمدة 5 دقائق.
- اقامة جرس فراغ ووضع وزن القارب مع PDMS في فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء المحاصرين.
- إيقاف الفراغ وإزالة وزن القارب. صب PDMS على أعلى من الاكريليك خفض التدريجي في طبق بيتري صغيرة. تأكد من أن PDMS يغطي كامل إدراج.
- السماح للPDMS لعلاج بين عشية وضحاها (لا يقل عن 18 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة إدراج من PDMS
- بعد الشفاء من PDMS، وإزالة إدراج عن طريق قطع بعناية PDMS حول قطعة الاكريليك مع مشرط.
2. تصفيح خلايا في غرفة متناهية
- تعقيم الغرفة لخلايا الطلاء.
ملاحظة: في حين PDMS يمكن تعقيمها باستخدام أكسيد الإثيلين أو غيرها من التقنيات، والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية سريعة سريعة وغير مكلفة، والكافية لدراسات ثقافة الخلية. وقال إن مدة العلاج بالأشعة فوق البنفسجية قصيرة لا يؤثر سلبا على هيكل أو الميكانيكية سلامة قطعة PDMS.- في خزانة زراعة الخلايا القياسية، وتغطي تماما الغرفة مع 70٪ من الإيثانول.
- وضع طبق بتري في غطاء تدفق الصفحي مع الأغطية قبالة.
- اغلاق غطاء محرك السيارة وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. فضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1-2 ساعة.
- فتح غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي وانتظر 15 دقيقة لإعادة التدفق.
- إزالة الايثانول 70٪.
- غسل غرف مرتين مع العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). استخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل غسل. إزالة برنامج تلفزيوني والسماح غرف لتجف بين عشية وضحاها مع الأغطية قبالة.
ملاحظة: بدلا من ذلك، بدلا من ذلكاستخدام تدفق غطاء محرك السيارة الصفحي، استخدم مربع غرفة للأشعة فوق البنفسجية لتعقيم إذا كان متوفرا. جعل مربع الأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في الجزء الخلفي من صندوق من الورق المقوى مبطنة بورق الألمنيوم. رقائق الألومنيوم يعكس ضوء للسماح حتى الإضاءة من العينة.
- طلاء الخلايا في الغرفة
- عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
- إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 400 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق وتخلط بلطف. تطبيق 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى عدادة الكريات عن طريق ملء بلطف مجلسي تحت ساترة الزجاج.
- استخدام المجهر مع الهدف 10X للتركيز على الشبكة على عدادة الكريات. استخدام عداد اليد رصيده إلى عدد الخلايا غير ملوثين الحية داخل مجموعة واحدة من 16 الساحات على عدادة الكريات.
- عدد الخلايا في كل مجموعات 4 من 16 الساحات. أخذ متوسط عدد خلايا من 4 مجموعات من 16 الساحات وضرب من قبل 5X10 4. هذا العدد النهائي هو العدد. dص من خلية / مل في التعليق الخلية.
- إضافة 2500 الخلايا لبئر واحدة في كل غرفة. هذا يترجم إلى كثافة الخلايا شبه متموجة من ~ 30000 / سم 2.
- تسمح للخلايا للجلوس في الغرفة لمدة 60 دقيقة قبل إضافة وسائل الإعلام (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين).
- عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
3. كتل الاغاروز ديكستران غارقة
- إنشاء كتلة الاغاروز
- صب 3٪ الاغاروز في قالب 3D المطبوعة (2 مم × 2 مم × 2 مم).
- السماح للالاغاروز ليصلب في فراغ الغرفة لمدة 30 دقيقة لإزالة أي فقاعات.
- إزالة كتلة agarose من العفن.
ملاحظة: بدلا من ذلك، صب 3٪ الاغاروز في طبق بيتري صغيرة في سمك 2 مم. قطع 2 مم كتلة × 2 مم × 2 مم باستخدام مشرط أو غيرها من أدوات القطع. هذه ليست دقيقة مثل نظام العفن ولكن يمكن أن يكون أسهل قليلا للقيام به.
- submerg تماماه كتلة الاغاروز في إيجاد حل للتركيز المطلوب من العامل الكيميائي. لتقييم تشكيل التدرج التركيز، وتدفق الغرفة الأولى مع ديكستران الفلورسنت. تركيز والوزن الجزيئي للديكستران يجب أن تتطابق أن عامل للذوبان أو المخدرات من اهتمام.
- نقع كتلة بين عشية وضحاها الاغاروز.
4. وقت الفاصل بين نشر دكستران لتقييم تركيز التدرج القابلة للذوبان عامل
- وضع ديكستران غارقة كتلة الاغاروز في بئر مربع صغير من غرفة متناهية.
- ضع دائرة متناهية في نظام التصوير الخلية أو استخدام المجهر الفلورسنت آخر مع القدرة على مرور الزمن. بدء مرور الزمن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
تؤخذ نتائج تظهر مع مرشح GFP، وعلى ضوء 50٪، 10/04 درجة الحموضة، و4X التكبير: ملاحظة.
5. الوقت الفاصل بين نمو الخلايا
- لوحة الخلايا في غرفة متناهية في واحدة من نهايةغرفة. هنا، استخدم 3T3 الخلايا الليفية. إضافة 2500 الخلايا لبئر واحدة في غرفة متناهية. عدد الخلايا كما هو موضح في 2.2.1.
- تسمح للخلايا للجلوس في الغرفة لمدة 60 دقيقة قبل إضافة وسائل الإعلام (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين). الحفاظ على غرفة متناهية مع خلايا مطلي عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. هجرة الخلايا من خلال قناة ويمكن الاطلاع مع المجهر.
- إضافة علامة أو استخدام خلل المجهري في غرفة كعلامة لتكون بمثابة مكان الانطلاق لتحديد المسافة التي قطعتها خلية الجبهة.
- إنشاء التدرج عن طريق وضع agarose هلام (8 مم 3 كتلة) التي تحتوي على عامل النمو المركزة، والكيماوي جاذبة، المخدرات، أو العوامل الأخرى التي يجري اختبارها (هنا، و 40٪ يستخدم FBS كمثال) في واحدة من نهاية متناهية غرفة.
- خذ الوقت الفاصل بين الصور من أمام خلية تتحرك. هنا، فقد بينت النتائج صور من الخلية جيئة وذهاباالإقليم الشمالي التي تم اتخاذها كل 12 ساعة باستخدام نظام التصوير.
- استخدام الصور من أمام خلية لتحديد معدل نمو الخلايا. حساب معدل النمو أولا باستخدام وظيفة polyfit MATLAB (roipoly) لإنشاء قناع المضلعة التي حددها أمام الزنزانة، جدران القناة، وعلامة مرجعية. أبعاد هذا القناع تسفر عن بعد الهجرة من الجبهة التي يتم احتساب متوسط سرعة خلية الجبهة. وقد استخدمت دراسات أخرى طريقة مشابهة 8.
ملاحظة: مقارنة حافة الجبهة نمو الخلايا على كل إطار لتركيز عامل للذوبان في تلك المسافة نفسها. ويحسب للذوبان التدرج تركيز عامل باستخدام 1D نموذج نشر التقريب. - التقاط صور الفلورسنت من الخلايا باستخدام Phalloidin وتلطيخ دابي.
- إصلاح الخلايا قبل تلطيخ مع Phalloidin.
- دافئ 4٪ امتصاص العرق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة ما يكفي من 4٪ لامتصاص العرق لتغطية الخلايا. إبقاء الخلايا فيامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة.
- شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في كل مرة. استخدام ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا.
- إزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا وإضافة حل permeabilizing ما يكفي من (0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لتغطية الخلايا. ترك حل لمدة 10 دقيقة.
- يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في كل مرة. استخدام ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا.
- إزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا وإضافة عرقلة الحل (1٪ ألبومين المصل البقري في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة.
- إزالة حل الحجب وغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في كل مرة. استخدام ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا.
- من هذه النقطة، وحماية الخلايا من الضوء بورق الألمنيوم عندما لم يتم استخدامها. إزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا وإضافة Phalloidin 488 المخفف 01:50 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
- غسل 2 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل يغسل. استخدام ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا. ثم إزالة برنامج تلفزيوني من الخلايا.
- إضافة دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) المخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني إلى الخلايا لمدة 15 دقيقة.
- إزالة دابي وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل يغسل.
- إزالة غسل الماضي وإضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا. ويمكن الآن خلايا يمكن تصوير مع المجهر مضان.
- إصلاح الخلايا قبل تلطيخ مع Phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 حركة الجبهة الخلية عبر القناة ردا على التدرج من المصل البقري الجنين وضعت في الطرف المقابل من القناة من حيث مطلي الخلايا. يظهر أمام الخلية في 48 ساعة (الشكل 2A)، 72 ساعة (الشكل 2B)، 96 ساعة (الشكل 2C)، و 120 ساعة (الشكل 2D) وظيفة الطلاء. وقد تتبعت حركة أمام الزنزانة مع هذه الصور الوقت الفاصل بين، وحسبت معدل المسافة الهجرة والنمو من خلال وظيفة polyfit MATLAB. من هذا، فقد وجد أن متوسط سرعة خلية الجبهة لتكون 13.4 ميكرون / ساعة (الشكل 3). ويبين الشكل 4 التدرج الفلورسنت التي وضعتها وضع كتلة الاغاروز غارقة ديكستران في واحدة من نهاية القناة والسماح ديكستران أن ينتشر من خلال القناة لمدة 12 ساعة. أجري صورة مرور الزمن في كل ساعة، ومضان عبر مسافة وقد تم قياس القناة وتآمر كما هو مبين في الشكل (4) وبالمقارنة مع النموذج نشر 1D.
الشكل 2: خلية حركة الجبهة. الصور الوقت الفاصل بين الجبهة خلية في غرفة متناهية تتحرك من خلال القناة. الجبهة خلية ملحوظ في خطوط برتقالية اللون، ويتم تضمين بعد الهجرة. وقد تم قياس هذه المسافة الهجرة من العلامات الموجودة على لوحة إلى الجزء الأمامي من الجبهة الخلية كما هو مبين. ويظهر شريط مقياس رسم 1 مم باللون الأبيض. أ) 48 ساعة بعد الطلاء، B) 72 ساعة بعد الطلاء، C) 96 ساعة بعد الطلاء، D) 120 ساعة بعد الطلاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ه 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
الشكل (3): معدل النمو حساب. الخلية الحركة الأمامية تعقب مع الصور الوقت الفاصل بين. تم احتساب معدل النمو باستخدام وظيفة polyfit MATLAB (roipoly) لانتاج متوسط سرعة خلية الجبهة 13.4 ميكرون / ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التدرج الفلورسنت مع ديكستران. كثافة الفلورسنت قياس عبر مسافة القناة حيث يمثل كل سطر التدرج في ساعة معينة. وقد استخدم يماغيج لحساب كثافة مضان. ويمكن القيام بذلك باستخدام تحليل | أداة قياس. أولا، اختيار القياسات المحددة في إطار تحليل وتحديد كثافة. ثم اختر قياس تحليل تحت من أجل الحصول افيالغضب بكسل الكثافة. هذا يمكن رسم مقابل المسافة في ميكرون كما هو موضح في هذا الشكل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام لدينا غرفة متناهية للعديد من الأغراض، بما في ذلك تحديد معدل هجرة الخلايا استجابة لعوامل النمو وchemoattractants وقياس معدل انتشار المخدرات من البوليمر. ومن الممكن الاستفادة من غرفة متناهية لدينا لزراعة الخلايا ووضع جاذب كيميائي في واحدة من نهاية الغرفة. تنمو الخلايا في الاستجابة للجاذب كيميائي، وهجرة الخلايا يمكن كميا من خلال اتخاذ الوقت الفاصل بين الصور التي يمكن تحليلها من أجل تحديد معدل الهجرة الخلية. وتظهر نتائج تمثيلية لهذه الطريقة في الشكل 3، حيث تم تحديد معدل النمو إلى أن 13.4 ميكرون / ساعة باستخدام وظيفة polyfit MATLAB.
استخدام آخر من غرفة متناهية لدينا هو لقياس معدل انتشار المخدرات من البوليمر. وديكستران الموسومة fluorescently من الوزن الجزيئي مماثل للدواء من الفائدة يمكن أن تستخدم في تصميم نموذج لنشر ودروغرام من الفائدة. من المهم أن نلاحظ أن العينات يجب أن يتم التعامل معها بعناية وكمية كبيرة من الحمل الحراري سيؤدي إلى اختلال التدرج. وتظهر نتائج ممثلة لهذه الطريقة في الشكل (4). ميزة هذا النموذج بالمقارنة مع فحص بويدن غرفة هو أنه أكثر قابلية للتطبيق على أنواع الخلايا الملتصقة بسبب سطح مستو. في حين، يجب أن الخلايا تقع من خلال أنبوب صغير في غرفة بويدن قبل الانضمام. الحد آخر من فحص بويدن غرفة هو أنه هو فحص نقطة النهاية. وبالتالي، الكيميائي لا يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. في المقابل، مع أسلوبنا، لوحظ الكيميائي من خلال الصور الوقت الفاصل بين 9. كما استخدمت استخدام بال micropipettes التي تحتوي على chemoattractants وسيلة لمراقبة الهجرة الخلية. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو انخفاض الإنتاجية 10. غرفة الكيميائي دان هو فحص آخر يستخدم جنبا إلى جنب مع الوقت الفاصل بين التصوير مثل الطريقة البريد بالتفصيل هنا 11 و 12. وتتكون الغرفة من اثنين من دوائر متحدة المركز منحوتة على وجه الشريحة الزجاجية من أجل إنشاء بئر الداخلي والخارجي، وجسر يفصل بين البئرين. يتم وضع جاذب كيميائي في البئر الخارجي، ويسمح للخلايا للهجرة من البئر الداخلي إلى البئر الخارجي. وكميا هذا الترحيل باستخدام الوقت الفاصل بين الصور التي يتم تحليلها باستخدام برمجيات تحليل الصور. على غرار فحص بويدن، واحدة من القيود المفروضة على غرفة الفحص دن هو أنه لا يمكن تعديلها بسهولة لخلق القابلة للذوبان مخصصة التدرجات تركيز عامل.
تقنية بسيطة أخرى لتقييم الهجرة الخلية في المختبر الصفر (13). هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة لأنها تتطلب فقط خلق نقطة الصفر في أحادي الطبقة الخلية والتقاط الصور الوقت الفاصل بين الهجرة الخلية على مقربة من نقطة الصفر التي تم إنشاؤها مسبقا. Howevإيه، والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو أنه ليست مناسبة لقياس ردود على عامل كيميائي تركيز الانحدار. يوفر طريقة لدينا القدرة على إنشاء معامل الكيميائية وتحديد الهجرة الخلية بالنسبة إلى التدرج الكيميائية. ويمكن الجمع بين أسلوب لدينا مع أسلوب الصفر التي قد تم إنشاؤها في أحادي الطبقة خلية الصفر، في حين أن العامل الكيميائي موجود في إحدى الآبار في غرفة متناهية. وهذا ما يسمح لتقدير ونمذجة التئام الجروح. تطبيق آخر محتمل في الجهاز لدينا هو تحديد استجابة الخلايا السرطانية إلى العوامل التي تمنع نمو الخلايا.
كما تم استخدام أنظمة أخرى على microfluidics استنادا لدراسات الهجرة الخلية 14 و 15. هذه الدراسات تستخدم تقنيات الطباعة الحجرية مع غرف نظيفة لإنشاء القوالب الرئيسية في السيليكون و / أو بالقطع الليزر لخلق قنوات ميكروفلويديك في رقائق السليكون. wafe السيليكونص الصغيرة بالقطع يمكن أن تكون مكلفة بالمقارنة مع أسلوبنا التي تستخدم مواد أرخص (PDMS والاكريليك) لتصنيع غرفة متناهية. لدينا جهاز يتغلب على الحد من PDMS أخرى تقوم الأجهزة ميكروفلويديك التي لم يكن من الممكن لخلق قنوات 3D صغيرة 15. مع أسلوبنا، وقد انشأنا بنجاح جهاز PDMS مقرها مع قنوات صغيرة قطرها. وقد استخدمت دراسات أخرى جهاز ميكروفلويديك القائم PDMS مع طبقتين من microchannels وخلاط الغاز متعدد القنوات التي يتم التحكم الكمبيوتر من أجل خلق التدرجات التعسفية من الأكسجين لدراسة هجرة الخلايا تحت تدرجات مختلفة من الأكسجين 16. وهناك إمكانية لدينا جهاز لاستخدامها بطريقة مماثلة مع إضافة غرفة خلط الغاز في واحدة من نهاية الغرفة متناهية.
غالبا ما تكون مصنوعة أجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة. هذه يمكن تكييفها لخلق chambe الهجرة الخليةروبية. هذه الأساليب تشمل الطباعة قناع مع أنماط قناة مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). ثم من المتوقع هذه الأقنعة على القالب الرئيسي المغلفة مع حساسية ومقاومة من خلال الطباعة الحجرية الضوئية. بعد إجراء القالب الرئيسي، يتم سكب PDMS على الشريحة الرئيسية وسمح لتتصلب من أجل إنشاء قالب PDMS التي يمكن استخدامها للدراسات الموائع الدقيقة 17 و 18 و 19. وتوضع المركبات جاذب كيميائي أو chemorepulsive في غرفة في تركيز عال في واحدة من الخزانات لإنشاء تدرجات 17. في حين أن هذه التقنيات هي مماثلة لمجموعة لدينا ما يصل، وأنها يمكن أن تكون مكلفة نظرا لارتفاع تكلفة إنشاء القالب الرئيسي للنظام، واستخدام غرف نظيفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الأساليب أن يكون صعبا للطلاب أن يتعلموا في بيئة أساس طبقي. يدرج المستخدمة في لدينا مجموعة المتابعة لإنشاء قنوات يمكن أن تنشأ مع مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك العلاقات العامة 3Dinting والقطع بالليزر. وبالتالي، يسمح النظام لدينا لخلق طائفة واسعة من القوالب لتكلفة منخفضة نسبيا وخصوصا تصبح الطباعة 3D أكثر بأسعار معقولة ومتاحة على نطاق واسع.
وقد استخدمت PDMS مقرها الأجهزة ميكروفلويديك لقياس هجرة الخلايا والنمو لمجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، في علم الأعصاب البحوث والدراسات 20، ملفقة الأجهزة باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة التي وضعت المكون PDMS على طبق زراعة الأنسجة أو الزجاج من أجل تشكيل اثنين من مقصورات التي تم فصلها من قبل حاجز مادي مع الأخاديد ميكرون الحجم للسماح لل الخلايا العصبية في النمو عبر المقصورات. وقد أخذت صور مرور الزمن لإظهار الخلايا العصبية عبور الحاجز. طريقة micropatterning تستخدم لانتاج هذا الجهاز معقد، في حين أن أسلوب الإنتاج لدينا جهاز بسيط، ويمكن استخدامها من قبل الباحثين في جميع المستويات. تستخدم دراسة أخرى أيضا وسيلة سهلة منخفضة التكلفة لإنتاج الاشتراكيةجهاز ميكروفلويديك MILAR PDMS باستخدام القالب الرئيسي إنشاؤها من الاسكتلندي بهدف خلق انطباع في PDMS لإنتاج microchannels. ميزة لنهجنا على وصفها في هذه الطريقة التي يتم ملفقة القنوات في أسلوبنا في خطوة واحدة، في حين يتطلب هذا البروتوكول التصاق بين PDMS طبقات مما يخلق مشاكل مع تدفق المتوسط إلى الخلايا 21.
في الختام، طريقة لدينا غرفة متناهية للتخصيص، ويمكن استخدامه للحصول على نتائج مختلفة. يسمح طريقة لإنشاء التدرج تركيز لكي يتلاءم مع احتياجات المستخدم. وعلاوة على ذلك، لدينا جهاز يوفر ميزة على الأجهزة الحالية نظرا لانخفاض التكلفة نسبيا وسهولة الاستخدام للباحثين في جميع المستويات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب يقر البرنامج الإبداعي رسالتك جامعة كليمسون وجبهة الخلاص الوطني CBET1254609 لتوفير التمويل اللازم لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
