Summary
该协议细节来测量响应于也可用于确定药物的扩散速度出聚合物基质的化学引诱物细胞迁移可定制方法。
Abstract
细胞迁移是免疫反应，生长和伤口愈合的重要组成部分。细胞迁移是一个复杂的过程，涉及到细胞，细胞外基质，和可溶的和不可溶的化学因素（ 例如 ，化学引诱物）之间的相互作用。标准方法测量细胞，如Boyden小室测定法中，通过在除法器的任一侧细胞计数工作的迁移。这些技术很容易使用;然而，他们提供针对不同应用的小几何修改。与此相反，微流体装置可用于观察与可溶性因子1,2定制浓度梯度细胞迁移。然而，用于制造基于微流体分析的方法是很困难的学习。
这里，我们描述用于创建细胞培养室，测量响应于化学浓度梯度细胞迁移的简单方法。我们的细胞英里格雷申室方法可以为了研究细胞迁移对于各种应用创建不同的线性浓度梯度。该方法是相对容易使用，并且通常由大学生进行。
所述微通道室通过将在最后的微腔的形状的丙烯酸插入井到培养皿创建。在此之后，聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）倒在刀片的顶部。将PDMS被允许硬化，然后除去插入件。这允许以任何所需的形状或尺寸的创作孔中。细胞可以随后添加到微室中，和可溶性剂可以通过在所需的剂浸泡琼脂糖块被加入到孔中的一个。琼脂糖块加入到孔中的一个，和时间推移的图片可以量化细胞迁移可采取微通道室。变化，以这种方法可以用于给定的应用进行，使得这种方法HIG溶血素可定制的。
Protocol
1，一种生产微通道室以产生浓度梯度
- 切割丙烯酸防霉片
- 获得一块所需宽度的丙烯酸。通常选用1/16英寸厚的压克力板材。较厚的片是难以切割好，非常薄的片材不具有必要的机械强度，使它们的过程中断裂或变形。
- 创建与丙烯酸片的所需形状的CAD文件到聚二甲基硅氧烷（PDMS）内产生的空腔。调节通道的宽度和长度，以实现相关的个别实验方案所需的梯度。
- 在这里，用丙烯酸片尺寸如下：由0.127厘米宽的通道连接（0.254厘米长）两个正方形（0.254厘米点¯x0.254厘米）（ 图1）。
- 根据马努在激光切割机导入CAD文件到激光切割设备，然后将一块亚克力厂家的协议。
注：另外，3D打印从CAD设计作品。这种方法的优点是，替代材料，可用于在模具中;但是，分辨率和重复性，可以用3D打印相比，激光切割下降。
图1：微通道商会计算机辅助设计（CAD）表示。该图像描述了创建微室所需的亚克力插入的CAD图纸。 1 A）CAD出图，1B）CAD的侧视图英寸的尺寸图，1C）CAD的顶视图英寸的尺寸图的顶视图，请点击此处查看该图的放大版本。
- 在一个称量船（重量）商业弹性体基的（ 如的Sylgard 184）与1重量份的商业橡胶固化剂（ 如的Sylgard 194）的混合10份。通常情况下，混合10克橡胶基地到1g弹性体固化剂。
- 搅用微量5分钟的基料和固化剂相结合。
- 设立一个真空钟，并将与PDMS中称量船在真空30分钟以除去截留的空气气泡。
- 关闭真空并取出称重舟。倒入一个小培养皿丙烯酸切出顶部的PDMS。确保PDMS完全覆盖刀片。
- 允许PDMS固化过夜（至少18小时）在室温下。
- 去除PDMS插入
- 固化的PDMS后，通过小心地切割PDMS周围的丙烯酸系片用手术刀取下刀片。
2.电镀细胞在微通道商会
- 灭菌电镀细胞室中。
注意：虽然PDMS可使用环氧乙烷或其他技术进行灭菌，快速UV处理是快速，廉价，并且足以用于细胞培养研究。短UV处理时间也没有损害的PDMS片的结构或机械完整性。- 在标准细胞培养柜，完全覆盖，用70％的乙醇的腔室。
- 把与所述盖子关闭层流罩的培养皿。
- 关闭引擎盖打开紫外线灯。暴露于UV光1-2小时。
- 打开层流罩，并等待15分钟重新建立流动。
- 除去70％的乙醇。
- 用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤腔室的两倍。使用1毫升的PBS每次洗涤。除去PBS并允许室与盖子关干通宵。
注：此外，相反使用层流罩中，使用的UV腔室箱灭菌如果有一个可用。通过将UV光源在一个纸箱用铝箔衬里的背面使紫外线框。铝箔反射光，以允许甚至照明样品。
- 在室内电镀细胞
- 使用计数台盼蓝和血球细胞。
- 加入100μL细胞悬液400微升0.4％台盼蓝，轻轻混匀。由玻璃盖玻片下轻轻填充两院应用100微升此解决方案血细胞计数仪。
- 使用显微镜用10倍的目标集中在血球电网。用一只手式计数器，以一组的血球16平方内计数活的未染色细胞。
- 在全体4套16平方的细胞。从4台16平方取平均细胞计数和由5×10 4繁殖。这个最后的数字是numbe在细胞悬浮液中细胞/ mL的河
- 添加2500细胞一个孔在每个室中。这转化为的〜30,000 / cm 2的近汇合的细胞密度。
- 允许细胞在腔室坐60分钟添加介质之前（Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素）。
- 使用计数台盼蓝和血球细胞。
3.浸泡葡聚糖琼脂糖块
- 创建琼脂糖块
- 琼脂糖倒3％到3D印刷模具（2毫米×2毫米×2mm）的。
- 允许琼脂糖在真空室内固化30分钟，以除去任何气泡。
- 除去从模具琼脂糖块。
注意：可替换地，琼脂糖倒3％成小培养皿在厚度为2毫米。切使用手术刀或者其它切割工具2毫米×2mm的×2mm的块。这不是作为模具系统那样精确，但是它可以更容易一点做。
- 完全submergE在趋化因子的所需浓度的溶液琼脂糖块。为了评估浓度梯度的形成，荧光右旋糖酐第一冲洗室。葡聚糖的浓度和分子量应匹配的可溶性因子或感兴趣的药物。
- 浸泡琼脂糖块过夜。
葡聚糖扩散4.时间推移，评估可溶性因子浓度梯度
- 将葡聚糖浸泡琼脂糖块在微室的小方井。
- 放置所述微通道室中的细胞成像系统，或使用其他荧光显微镜与时间推移的能力。根据制造商的说明开始的时间推移。
注：显示的结果采取GFP过滤器，50％的光，pH值4/10和放大4倍。
细胞生长5.定时
- 板中的细胞微通道室中的一端室。在这里，使用3T3成纤维细胞。添加2500细胞一个孔在所述微通道室中。在2.2.1中描述计数细胞。
- 允许细胞在腔室坐60分钟添加介质之前（Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，10％胎牛血清，1％青霉素 - 链霉素）。保持与铺板的细胞在微室中于37℃在5％CO 2。通过信道细胞迁移可以用显微镜观察。
- 添加标记或使用在腔室作为标记的显微缺陷，以作为一个起点，以量化的距离的小区前移动。
- 通过将琼脂糖凝胶（8 mm 3的块）包含建立梯度浓缩生长因子，趋化引诱剂，药物，或者被测试其他因子（这里，40％的FBS被用作一个例子）在所述微通道的一端室。
- 就拿移动单元前的时间推移图像。在此，结果表明，该细胞的图像来回核苷酸已采取使用成像系统每12小时。
- 使用电池前的照片来量化细胞的生长速度。计算由第一利用MATLAB polyfit功能（roipoly）来创建由细胞前，通道壁，和参考标记限定的多边形掩模的增长率。该掩模的尺寸，得到由此计算平均电池锋速度前的迁移距离。其他研究已经利用类似的方法8。
注：在该相同的距离进行比较的细胞生长前面各帧的可溶因子的浓度上的边缘。可溶性因子的浓度梯度是使用一维扩散模型近似计算。 - 采取用鬼笔环肽和DAPI染色的细胞的荧光图像。
- 与鬼笔环肽染色之前修复细胞。
- 在37℃的温水4％多聚甲醛。
- 补充足够的4％多聚甲醛覆盖细胞。保持在细胞中多聚甲醛10分钟。
- 用PBS冲洗两次，每次15分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
- 从细胞中除去PBS中并添加足够的透化溶液（0.1％的Triton X-100的PBS），以覆盖细胞。离开溶液10分钟。
- 用PBS洗两次，每次5分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
- 从细胞中除去PBS中并添加20分钟阻断溶液（在PBS中1％牛血清白蛋白）。
- 除去阻断溶液并用PBS洗涤2次，每次5分钟。使用足够的PBS覆盖细胞。
- 从这点来说，在不使用时保护细胞免受光用铝箔。从细胞中除去PBS中并在PBS中添加鬼笔环肽488 1:50稀释1小时。
- 洗2次在PBS中5分钟，每次洗涤。使用足够的PBS覆盖细胞。然后从细胞中移除PBS。
- 在PBS 1000细胞15分钟：加入DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基）稀释1。
- 删除和DAPI洗涤细胞两次，用PBS进行5分钟，每次洗涤。
- 删除最后一次洗涤和补充足够的PBS覆盖细胞。细胞现在可以用荧光显微镜成像。
- 与鬼笔环肽染色之前修复细胞。
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Representative Results
图2示出横跨通道的细胞前的响应于放置在信道的从细胞接种，其中相对端胎牛血清的梯度的运动。小区前示出在48小时（ 图2A），72小时（ 图2B），96小时（ 图2C），和120小时（ 图2D）交电镀。小区前的运动用这些时间推移图象跟踪，和迁移距离和生长率分别由MATLAB polyfit函数计算。由此看来，平均气泡锋速度被发现是13.4微米/小时（ 图3）。 图4示出通过在通道的一端放置葡聚糖浸泡琼脂糖块并允许葡聚糖通过信道扩散12小时建立的荧光梯度。一时间推移图像摄于每一小时，横跨的距离的荧光信道测量并绘制成图4所示相比，一维扩散模型。
图2：细胞前运动。小区前的微腔通过通道移动延时图像。小区前橙色标记线，并且被包括在迁移距离。此迁移距离从作为显示在板的单元前方的前部的打标进行测定。 1毫米的比例尺示出了白色。 A）48小时后电镀，B）72小时后电镀，C），96小时后电镀，D），120小时后电镀。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3：增长率计算。细胞随着时间的推移图片追踪前方运动。增长速度是使用MATLAB polyfit功能（roipoly）得到13.4微米/ h的平均细胞锋速度计算。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：荧光梯度葡聚糖。荧光强度跨越每一行表示在一特定小时的梯度的信道之间的距离进行测量。 ImageJ的用于计算荧光强度。这可以通过使用分析来完成|测量工具。首先，选择分析和选择强度下集测量。然后，选择测量为了得到AVE分析下愤怒像素强度。这可以作图微米距离如该图所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的微腔可用于目的，包括确定细胞迁移速率响应于生长因子和趋化因子以及从聚合物基质测定药物的扩散速率的多种。它可以利用我们的微腔室生长细胞并放置一个趋化在腔室的一端。细胞生长响应于趋化和细胞迁移可以通过取可在为了确定细胞迁移率分析的时间推移的图像进行量化。这种方法的代表性结果示于图3，其中被确定的增长率是使用MATLAB polyfit函数13.4微米/小时。
我们的微腔室的另一用途是用于测量药物的扩散速度出聚合物基质。类似的分子量与感兴趣的药物的荧光标记的葡聚糖可用于DRU的扩散模型克的兴趣。要注意的是，样品必须精心为大量的对流会扰乱梯度进行处理是重要的。该方法的代表性结果示于图4。这种模式相比于Boyden小室测定法的一个优点是，它更适用于因为平坦表面的贴壁细胞类型;然而，细胞必须坚持之前穿过Boyden小室的小管下降。的Boyden小室测定法的另一个限制是，它是一个端点化验;因此，趋化不能被肉眼观察到。相反，我们的方法中，趋化是通过时间推移图像9观察。使用含有化学引诱物微量的也已用于观察细胞迁移的方法。然而，这种方法的主要缺点是低通量10。唐恩趋化室是配合使用延时成像像日另一个测定E法这里详细11,12。该室由雕刻在玻璃载片的面，以创造一个内层和外层以及两个同心圆的，和桥两井隔开。的趋化因子被放置在所述外孔中，允许细胞从内井迁移到外井。这种迁移是使用使用图像分析软件分析时间推移图像量化。到博伊登测定相似，唐恩室法的局限性之一是，它不能容易地修改，以创建自定义可溶因子的浓度梯度。
用于评估细胞迁移另一种简单的技术是一种体外划伤13。这种方法是快速和廉价的，因为它不仅需要创造接近先前创建的划痕细胞迁移的时间推移图像的细胞单层和捕捉划伤。 Howev呃此方法的主要缺点是，它不适合于测量到的化学因子的浓度梯度的反应。我们的方法提供了创建的化学梯度和相对于化学梯度细胞迁移量化的潜力。我们的方法可以与刮方法如可以在细胞单层来创建划痕结合，而一个趋化因子存在于所述微通道室中的孔中的一个。这允许在量化和伤口愈合的建模。我们的装置的另一潜在应用是确定癌细胞的抑制细胞生长的试剂的反应。
其他基于微流体系统也被用于细胞迁移实验14,15。这些研究利用具有洁净室平版印刷技术来创建在硅和/或激光加工原板以在硅晶片上的微流体通道。硅维峰ř微加工能够在相比于我们的方法，利用便宜的材料（PDMS和丙烯酸）来制造微通道室是昂贵的。我们的设备克服了基于微流体装置，其中，不可能创建小3D通道15等的PDMS的限制。通过我们的方法，我们已经成功地创建了基于PDMS设备小直径通道。其他的研究已经使用的基于PDMS的微流体装置具有微通道的两个层，并且被计算机控制，以便创造氧任意梯度研究根据氧气16的不同梯度细胞迁移的多通道气体混合器。用于向以类似的方式用于与另外的气体混合室中的微通道室的一端提供了设备有潜力。
微流控设备使用软光刻技术常发;这些可适于创建细胞迁移chambeRS。这些方法涉及印刷用计算机辅助设计（CAD）信道的图案的掩模。然后这些掩模投射在涂有感光通过光学光刻抗蚀剂主模。母模制成后，PDMS倒在主站和允许以创建可用于微流体的研究17，18，19将PDMS模具硬化。趋化或chemorepulsive化合物被放置在中高浓度的腔室中的储层中的一个来创建梯度17。虽然这些技术是类似于我们的集合时，它们可能是昂贵的，由于制造母模的系统和使用的洁净室的高成本。此外，这些方法可能难以为学生在基于类别设置学习。在我们的建立来创建信道所使用的插入物可以用各种方法，包括3D PR创建inting和激光切割。因此，我们的系统允许创建各种各样的模具对于特别是三维打印变得更经济实惠和广泛使用成本相对较低。
基于微流体装置，用于测量细胞迁移和生长的PDMS已被用于广泛的应用范围。例如，在神经科学研究研究20中 ，设备是用在其中PDMS组分放置在组织培养皿或玻璃，以形成由一个物理屏障分离与微米级的槽，为了允许两个室软光刻技术制造神经元在整个隔间生长。拍摄延时图像显示神经细胞穿越屏障。用于生产本设备微图案的方法是复杂的，而我们的设备的制造方法简单，可通过研究人员在各级中使用。另一项研究中也使用一种简单的低成本的制造方法的Si利用透明胶带，以创造在PDMS的印象，产生微通道创造了一个模具师傅milar PDMS微流体装置。我们对在该方法中所描述的方法的优点是，在我们的方法中的信道在一个步骤中被制造，而该协议需要它创建与介质流动到细胞中21两个问题的PDMS层之间的粘合。
总之，我们的微通道室的方法是可定制的，并且可以被用于获得不同的结果。该方法允许创建的浓度梯度的，以适应用户的需要。此外，我们的设备提供超过现有设备的优势，由于其相对较低的成本和易用性为研究人员在各级的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者承认克莱姆森大学创意咨询程序和NSF CBET1254609为这个项目提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
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