Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.
Abstract
נדידת תאים היא חלק חיוני של מערכת חיסונית, צמיחה, וריפוי פצעים. נדידת תאים היא תהליך מורכב הכרוך אינטראקציות בין תאים, תאי מטריקס, וגורמים כימיים מסיסים ובלתי מסיס (למשל, chemoattractants). שיטות תקן למדידת ההגירה של תאים, כגון assay הקאמרית בוידן, עבודה על ידי ספירת תאים משני צדי מחיצה. טכניקות אלו קלות לשימוש; עם זאת, הם מציעים שינוי גיאומטרי קטן עבור יישומים שונים. לעומת זאת, מכשירי microfluidic יכולים לשמש כדי לצפות נדידת תאים עם מילויי ריכוז להתאמה אישיים של גורמי מסיסי 1, 2. עם זאת, שיטות להכנת מבחנים מבוססים מיקרופלואידיקה יכולות להיות קשות ללמוד.
כאן אנו מתארים שיטה קלה ליצירת תאי תרבית תאים למדוד נדידת תאים בתגובה הדרגתית ריכוז כימי. המייל הסלולרי שלנושיטה קאמרית הגירה יכולה ליצור הדרגתי ריכוז ליניארי שונה על מנת ללמוד נדידת תאים עבור מגוון רחב של יישומים. שיטה זו היא יחסית קלה לשימוש והיא מבוצעת בדרך כלל על ידי סטודנטים לתואר ראשון.
תא microchannel נוצר על ידי צבת הוסף אקריליק בצורה של חדר microchannel הסופי היטב לתוך צלחת פטרי. אחרי זה, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) נמזג על גבי להכניס את. את PDMS הורש להקשיח ואז להכניס הוסר. זה אפשר ליצירת בארות בכל צורה או גודל רצוי. תאים עשויים להיות שיצטרפו בעתיד תא microchannel, וסוכני מסיסים ניתן להוסיף אחת הבארות על ידי השריית גוש agarose ב הסוכן הרצוי. בלוק agarose מתווסף באחת הבארות, ואת הזמן לשגות תמונות שניתן לנקוט של חדר microchannel על מנת לכמת נדידת תאים. וריאציות שיטה זו יכולה להיעשות עבור יישום נתון, מה שהופך גדולות בשיטה זוhly להתאמה אישית.
Protocol
1. הפקת לשכת microchannel ליצור מפל ריכוזים
- חיתוך חתיכת עובש אקריליק
- השג חתיכת אקרילי בעובי הרצוי. משתמשים בדרך כלל 1/16 אינץ 'בעובי גליונות אקריליק. גיליונות עבים קשים לחתוך היטב דק מאוד סדינים אין את החוזק המכאני הנדרש, מה שגרם להם לשבור או עיוות תוך כדי התהליך.
- יצירת קובץ CAD עם הצורה הרצויה של היצירה אקריליק לייצר חלל בתוך polydimethylsiloxane (PDMS). התאם את רוחב הערוץ וארך כדי להשיג את השיפוע הרצוי רלוונטי פרוטוקולי ניסוי פרט.
- הנה, להשתמש פיסת אקריליק של הממדים הבאים: שני ריבועים (0.254 ס"מ x 0.254 ס"מ) המחוברים באמצעות ערוץ רחב 0.127 ס"מ (0.254 ס"מ) (איור 1).
- ייבא את קובץ CAD לתוך המכשיר חיתוך לייזר ולמקם היצירה אקריליק חותך לייזר על פי manuהפרוטוקול של facturer.
הערה: לחילופין, 3D-להדפיס את היצירה מעיצוב CAD. היתרון של שיטה זו הוא כי חומרים חלופיים יכולים לשמש עבור העובש; עם זאת, החלטת השחזור יכולים להיות ירידה עם הדפסת 3D לעומת חיתוך ליזר.
איור 1: תכנון בעזרת מחשב (CAD) ייצוג microchannel הקאמרית. תמונה זו מתארת את ציור CAD של הוסף אקריליק הדרושים ליצירת תא microchannel. 1 א) להציג לראש ציור CAD, 1B) הצד לנוכח CAD ציור עם מידות בסנטימטרים, 1C) נוף לראש CAD ציור עם מידות בסנטימטרים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- בסירה לשקול, לערבב 10 חלקים לפי משקל של אלסטומר בסיס מסחרי (למשל Sylgard 184) עם חלק 1, לפי משקל, סוכן מסחרי אלסטומר אשפרה (למשל Sylgard 194). בדרך כלל, לערבב 10 גרם של מאגר אלסטומר עד 1 גרם של סוכן אלסטומר אשפרה.
- מערבבים לשלב את הבסיס סוכן ריפוי עם micropipette למשך 5 דקות.
- הגדרת פעמון ואקום ומניחים הסירה לשקול עם PDMS בריק במשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו.
- כבה את הוואקום ולהסיר את הסירה לשקול. יוצקים את PDMS על גבי מחוץ לחתוך אקריליק בצלחת פטרי קטנה. ודא כי PDMS מכסה לחלוטין את הכנס.
- אפשר PDMS כדי לרפא לילה (לפחות 18 שעות) בטמפרטורת החדר.
- הסרת הכנס מן PDMS
- לאחר לרפא את PDMS, להסיר את המכסה על ידי חיתוך PDMS בזהירות סביב חתיכת אקרילי עם אזמל.
2. ציפוי התאים בתא microchannel
- עיקור לתא עבור תאי ציפוי.
הערה: בעוד PDMS ניתן לעקר באמצעות אתילן אוקסיד או טכניקות אחרות, טיפול UV מהיר הוא מהיר, זול, ומספיק מחקרי תרבית תאים. משך טיפול UV הקצר לא לפגוע שלמות מבנה או מכאני של יצירת PDMS.- בארון תרבית תאים סטנדרטי, מכסה לחלוטין את החדר עם אתנול 70%.
- שים את צלחת פטרי ברדס זרימה למינרית עם המכסים מעל.
- סתום את מכסה המנוע ולהדליק את האור האולטרה סגול. לחשוף לאור UV למשך 1-2 שעות.
- פתח את מכסה המנוע זרימה למינרית ולחכות 15 דקות כדי לחדש את זרימת.
- הסר את אתנול 70%.
- לשטוף לתאי פעמיים עם בופר פוספט סטרילית (PBS). השתמש 1 מ"ל של PBS עבור כל שטיפה. הסר PBS ולאפשר תאים לייבוש למשך הלילה עם המכסים מעל.
הערה: לחילופין, במקוםשל שימוש במנדף זרימה למינרית, להשתמש בתיבת קאמרית UV לעיקור אם אחד זמין. להפוך את תיבת UV על ידי הצבת מקור אור UV בחלק האחורי של קופסת קרטון מרופדת בנייר אלומיניום. רדיד האלומיניום משקף את האור כדי לאפשר גם תאורה של המדגם.
- תאי ציפוי ב קאמרי
- ספירת תאים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer.
- הוספת 100 μL של השעית תא 400 μL של 0.4% Trypan כחולים ומערבבים בעדינות. החל 100 μL של פתרון זה hemocytometer על ידי מילוי שני התאים בעדינות מתחת coverslip הזכוכית.
- שימוש במיקרוסקופ עם מטרה 10X להתמקד הרשת על hemocytometer. השתמשתי מונה נקודות יד לספור את התאים בלא הכתם חיים בתוך קבוצה אחת של 16 ריבועים על hemocytometer.
- ספירת תאים בכל 4 סטים של 16 ריבועים. קח את ספירת תאי הממוצע מן 4 סטים של 16 ריבועים ולהתרבות על ידי 5x10 4. המספר הסופי זהו number של תאים / מ"ל ההשעיה תא.
- להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בכל תא. זה מתרגם ל צפיפות התאים ליד ומחוברות של ~ 30,000 / 2 ס"מ.
- אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין).
- ספירת תאים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer.
3. Dextran ספוג בלוקים Agarose
- יצירת גוש agarose
- יוצקים 3% agarose לתוך תבנית מודפס 3D (2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ).
- אפשר agarose כדי לחזק בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
- הסר את הבלוק agarose מן התבנית.
הערה: לחילופין, יוצקים 3% agarose לתוך צלחת קטנה פטרי בעובי של 2 מ"מ. חותכים בלוק 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות אזמל או כלי חיתוך אחרים. זה לא מדויק כמו מערכת העובש אבל זה יכול להיות קצת יותר קל לעשות.
- לגמרי submergדואר לחסום agarose בתמיסה של הריכוז הרצוי של גורם chemotactic. כדי להעריך את היווצרות מפל ריכוזים, שטוף את התא הראשון עם dextran ניאון. הריכוז ועל משקל מולקולרי של dextran צריך להתאים לזה של גורם או סמים מסיסים של עניין.
- משרים את הלילה לחסום agarose.
4. זמן לשגות של דיפוזיה Dextran להעריך את מפל ריכוזי הפקטור המסיס
- מניחים את גוש agarose ספוג dextran בתוך באר ריבוע קטן של החדר microchannel.
- הנח את תא microchannel במערכת הדמיה תא או להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר עם יכולת זמן לשגות. להתחיל את הזמן לשגות פי הוראות היצרן.
הערה: התוצאות המוצגות נלקחים עם מסנן GFP, 50% אור, 4/10 pH, והגדלה 4X.
5. זמן לשגות של גדילת התא
- פלייט תאים בתא microchannel בקצה אחד שלתָא. הנה, להשתמש 3T3 פיברובלסטים. להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בבית הבליעה microchannel. ספירת תאים כמתואר 2.2.1.
- אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). שמור על תא microchannel עם תאים מצופה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. נדידת תאי הדרך ניתן לצפות בערוץ עם מיקרוסקופ.
- הוספת סמן או להשתמש פגם מיקרוסקופי בתא כסמן כדי לשמש נקודת זינוק לכמת את המרחק המהלכים מול התא.
- ליצור שיפוע ידי הצבת ג'ל agarose (8 מ"מ 3 בלוק) המכיל את גורם הגדילה מרוכז,-attractant הכימותרפיה, סמים, או גורם אחר שנבדק (כאן, 40% FBS נמצא בשימוש כדוגמה) בקצה אחד של microchannel תָא.
- קח זמן לשגות תמונות של חזית התא נעה. הנה, התוצאות מראות תמונות של התא הלוך ושובNT כי נלקחו כל 12 שעות באמצעות מערכת הדמיה.
- השתמש בתמונות של חזית התא לכמת שיעור צמיחת תאים. לחשב את שיעור הצמיחה באמצעות הראשון פונקצית polyfit MATLAB (roipoly) כדי ליצור מסכה מצולעים שהוגדרה על ידי מול התא, קירות הערוץ, ואת סמן הפנייה. ממד המסכה הזאת להניב מרחק הגירה של החזית שממנו המהירות מול התא ממוצעת מחושבת. מחקרים אחרים לא מנוצלים בשיטה דומה 8.
הערה: השווה את הקצה מול צמיחת תאים על כל מסגרת לריכוז של הגורם המסיס באותו מרחק. השיפוע גורם ריכוז המסיס מחושב באמצעות קירוב מודל דיפוזיה 1D. - קח תמונות הניאון של תאים באמצעות מכתים Phalloidin ו DAPI.
- תקן תאים לפני צביעה עם Phalloidin.
- paraformaldehyde 4% חם ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף מספיק 4% paraformaldehyde לכסות תאים. שמור את התאים בparaformaldehyde למשך 10 דקות.
- יש לשטוף פעמים עם PBS במשך 15 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
- הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון מספיק permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) כדי לכסות תאים. השאר פתרון במשך 10 דקות.
- שטוף פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
- הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון לחסימת (1% אלבומין בסרום שור ב PBS) במשך 20 דקות.
- סור פתרון חסימה ולשטוף 2 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
- מנקודה זו, להגן על תאים מפני אור עם רדיד אלומיניום כאשר לא בשימוש. הסר PBS מתאי ולהוסיף Phalloidin 488 בדילול 1:50 ב PBS עבור H 1.
- לשטוף 2 פעמים PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. ואז להסיר PBS מתאי.
- הוסף DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) מדולל 1: 1,000 ב PBS לתאים במשך 15 דקות.
- הסר DAPI ולשטוף תאים פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף.
- הסר לשטוף האחרון ולהוסיף מספיק PBS לכסות תאים. תאים יכולים להיות צילמו עכשיו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- תקן תאים לפני צביעה עם Phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג את התנועה של חזית התא מעבר לתעלה בתגובת שיפוע של בסרום שור העובר להציב בקצה השני של הערוץ מהמקום שבו התאים מצופים. חזית התא מוצגת 48 שעות (איור 2 א), 72 שעות (איור 2 ב), 96 שעות (איור 2 ג), ו -120 שעות ציפוי פוסט (איור 2 ד). התנועה של חזית התא הייתה במעקב עם הזמן לשגות תמונות אלה, ושיעור הגירת מרחק וצמיחה חושבו על ידי פונקצית polyfit MATLAB. כלומר, התוצאות המהירות מול התא הממוצע נמצאה 13.4 מיקרומטר / h (איור 3). איור 4 מראה את שיפוע פלורסנט הוקמה על ידי הצבת לחסום agarose מושרים dextran בקצה אחד של הערוץ ומאפשר dextran כדי לנטרל באמצעות ערוץ 12 שעות. תמונת זמן לשגות נלקח בכל שעה, ואת הקרינה מעבר למרחק של הערוץ נמדד זמם כפי שמוצג באיור 4 ולעומת מודל דיפוזיה 1D.
איור 2: תא קדמי תנועה. זמן לשגות תמונות של חזית התא בתא microchannel עובר דרך הערוץ. חזית התא מסומנת בקווים כתומים, ומרחק ההגירה כלול. מרחק הגירה זו נמדד מן הסימון על הצלחת אל מול חזית התא כפי שמוצג. בר בקנה מידה 1 מ"מ מוצג בלבן. א) 48 שעות לאחר ציפוי, B) 72 שעות לאחר ציפוי, C) 96 שעות לאחר ציפוי, D) 120 שעות שלאחר ציפוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דואר 3 "src =" / files / ftp_upload / 55,264 / 55264fig3.jpg "/>
איור 3: חישוב קצב צמיחה. Cell התנועה מול במעקב עם תמונות זמן לשגות. שיעור הצמיחה מחושב באמצעות הפונקציה polyfit MATLAB (roipoly) להניב מהירות מול התא הממוצע של 13.4 מיקרומטר / h. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Gradient פלורסנט עם Dextran. עוצמת פלורסנט נמדדה מעבר למרחק של הערוץ שבו כל שורה מייצגת השיפוע בשעה מסוימת. ImageJ ששימש לחישוב עוצמת הקרינה. ניתן לעשות זאת באמצעות ניתוח | בכלי מדידה. ראשית, לבחור מידות קבעו תחת עוצמת לנתח ובחר. לאחר מכן, בחר מי שמודד תחת לנתח על מנת לקבל aveזעם עוצם פיקסל. זה ניתן להתוות לעומת מרחק מיקרון כפי שמוצג באיור הזה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תא microchannel שלנו עשוי לשמש מספר רב של מטרות, כולל קביעת שיעור נדידת תאים בתגובה גורמי גדילה chemoattractants ומדידת קצב הדיפוזיה של תרופה ממטריקס פולימר. אפשר לנצל תא microchannel שלנו לגדל תאים ומקום chemoattractant בקצה אחד של החדר. התאים גדלים בתגובה chemoattractant, ואת נדידת תאים ניתן לכמת על ידי לקיחת תמונות זמן לשגות כי ניתן לנתח על מנת לקבוע את שיעור נדידת תאים. נציג תוצאות של שיטה זו מוצגות באיור 3, כאשר שיעור הצמיחה היה נחוש בדעתו להיות 13.4 מיקרומטר / h באמצעות פונקצית polyfit MATLAB.
שימוש נוסף של תא microchannel שלנו הוא למדוד את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס. Dextran מתויג fluorescently של משקל מולקולרי דומה לתרופה של עניין עשוי לשמש מודל דיפוזיה של druגרם של עניין. חשוב לציין כי הדגימות חייבים להיות מטופל בזהירות כמו כמות גדולה של הסעה תשבש את השיפוע. תוצאות הנציג של שיטה זו מוצגות באיור 4. יתרון של מודל זה בהשוואת assay הקאמרית בוידן הוא שזה יותר החלים על סוגי תאים חסידים בגלל המשטח השטוח; ואילו, התאים חייבים לנפול דרך צינורית קטנה בתא בוידן לפני הדבקות. מגבלה נוספת של assay הקאמרית בוידן היא כי מדובר assay נקודות קצה; וכך, chemotaxis לא ניתן לראות בצורה ויזואלית. לעומת זאת, בשיטה שלנו, chemotaxis הוא ציין באמצעות זמן לשגות תמונות 9. שימוש micropipettes המכיל chemoattractants גם שמש שיטה של התבוננות נדידת תאים. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא תפוקה נמוכה 10. תא chemotaxis דאן הוא assay אחר כי הוא משמש יחד עם הדמיה זמן לשגות כמו השיטת ה המפורטים כאן 11, 12. התא מורכב משני מעגלים בעלי מרכז משותף מגולפים על פני שקופיות הזכוכית כדי ליצור גם פנימית וחיצוני, וגשר המפריד בין שתי בארות. Chemoattractant ממוקם היטב החיצוני, והתאים רשאים להעביר מהבאר הפנימית לבאר החיצוני. הגירה זו היא לכמת באמצעות תמונות זמן לשגות כי מנותחות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. בדומה assay בוידן, אחת המגבלות של assay הקאמרית דאן הוא שזה לא יכול בקלות להיות שונה כדי ליצור הדרגתי ריכוז גורם מסיס מותאם אישית.
טכניקה פשוטה נוספת להערכת נדידת תאים היא במבחנה לגרד 13. שיטה זו היא מהירה וזולה כמו זה רק דורש יצירת שריטה בשכבת התא הלכיד זמן לשגות תמונות של נדידת תאים קרובות השריטה שנוצרה בעבר. Howevאה, החסרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא אינה מתאימה למדידת תגובות מפל ריכוזי גורם כימי. השיטה שלנו מציעה את הפוטנציאל ליצור שיפוע כימיים לכמת ביחס נדידת תאים להדרגתיות כימיים. השיטה שלנו עשויה להיות משולבת עם שיטת השריטה כמו שריטה ניתן ליצור בשכבת התא, ואילו גורם chemotactic שוהה באחת הבארות בתא microchannel. זה מאפשר כימות והכנת דגמים של ריפוי פצעים. יישום נוסף פוטנציאל של המכשיר שלנו הוא כדי לקבוע את התגובה של תאים סרטניים לסוכנים מעכבים צמיחת תאים.
מערכות מיקרופלואידיקה מבוססות אחרות גם שמשו ללימודי נדידת תאים 14, 15. מחקרים אלה להשתמש בטכניקות ליתוגרפיות עם חדרים נקיים ליצור תבניות הורים בסיליקון ו / או עיבוד לייזר כדי ליצור ערוצי microfluidic ב פרוסות סיליקון. wafe הסיליקוןr עיבוד מיקרו יכול להיות יקר בהשוואה לשיטה שלנו אשר מנצל בחומרים זולים (PDMS ואקריליק) לייצור תא microchannel. המכשיר שלנו מתגבר על המגבלה של PDMS האחר המבוססים מכשירי microfluidic שבו לא ניתן היה ליצור ערוצי 3D קטנים 15. בשיטה שלנו, יצרנו בהצלחה מכשיר מבוסס PDMS עם ערוצי בקוטר קטן. מחקרים אחרים שהשתמשו במכשיר microfluidic מבוסס PDMS עם שתי שכבות של microchannels ומיקסר גז רב ערוצית, כי הוא נשלט מחשב כדי ליצור הדרגתיים שרירותיים של חמצן ללמוד נדידת התאים תחת הדרגתיים שונים של חמצן 16. קיים פוטנציאל עבור המכשיר שלנו כדי לשמש באופן דומה בתוספת תא ערבוב גז בצד אחד של חדר microchannel.
מכשירי microfluidic נעשים לעתים קרובות תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיות רכה; אלה יכולים להיות מותאמים ליצור chambe נדידת תאיםRS. שיטות אלה כוללות הדפסת מסכה עם דפוסי ערוץ עם תכנון בעזרת מחשב (CAD). מסכות אלו מכן מוקרנות על עובש אמן מצופה רגיש להתנגד באמצעות ליתוגרפיה אופטית. לאחר עובש אמן מורכב, PDMS הוא שפך על המאסטר ואיפשר להקשיח כדי ליצור עובש PDMS שיכול לשמש למחקרים microfluidic 17, 18, 19. תרכובות chemoattractant או chemorepulsive ממוקמות בתא בריכוז גבוה אחד מהמאגרים ליצור הדרגתי 17. בעוד טכניקות אלה דומים ההגדרה שלנו, הם יכולים להיות יקרים בשל העלות הגבוהה של יצירת עובש האמן למערכת והשימוש בחדרים נקיים. בנוסף, שיטות אלה יכולים להיות קשות עבור תלמידים ללמוד באווירה מעמדית. המחדיר המשמש ההגדרה שלנו ליצור הערוצים ניתן ליצור עם מגוון רחב של שיטות, כולל יחסי ציבור 3Dinting וחיתוך לייזר. לפיכך, המערכת שלנו מאפשרת יצירה של מגוון רחב של תבניות עבור עלות נמוכה יחסית במיוחד הדפסת 3D הופכת יותר זולה וזמין באופן נרחב.
PDMS מכשירים המבוססים microfluidic למדידת נדידת תאים וצמיחה שמש עבור מגוון רחב של יישומים. למשל, במדעי מוח מחקר שמלומד 20, התקנים היו מפוברקים באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות שבו רכיב PDMS הושם על צלחת בתרבית רקמה או זכוכית על מנת ליצור שני תאים שהופרדו על ידי מחסום פיזי עם חריצים בגודל מיקרון לאפשר נוירונים לגדול מעבר תאים. זמן לשגות תמונות נלקחו להראות נוירונים לחצות את המכשול. השיטה של micropatterning המשמש לייצור מכשיר זה הוא מורכב, ואילו שיטת הייצור עבור המכשיר שלנו הוא פשוט יכול להיות בשימוש על ידי חוקרים בכל הרמות. מחקר נוסף גם השתמש בשיטה בעלות הנמוכה קלה לייצור סימילר PDMS מכשיר microfluidic באמצעות עובש אמן שנוצר סקוטש כדי ליצור רושם של PDMS לייצר microchannels. יתרון של הגישה שלנו על אחד המתוארת בשיטה זו הוא כי הערוצים בשיטה שלנו מיוצרים בצעד אחד, בעוד פרוטוקול זה דורש הדבקה בין שתי שכבות PDMS אשר מיוצרות בעיות עם זרימה בינונית לתאים 21.
לסיכום, שיטת תא microchannel שלנו ניתנת להתאמה אישית וניתן להשתמש בו כדי להשיג תוצאות שונות. השיטה מאפשרת יצירה של מפל ריכוזים על מנת להתאים לצרכים של המשתמש. יתר על כן, המכשיר שלנו מציע יתרון על פני מכשירים קיימים בשל עלותו הנמוכה יחסית וקלות השימוש עבור חוקרים בכל הרמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים תוכנית הודעה Creative של אוניברסיטת קלמסון NSF CBET1254609 למתן המימון לפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
