Summary
Este protocolo detalla un método adaptable para medir la migración de células en respuesta a quimioatrayentes, que también pueden ser utilizados para determinar la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero.
Abstract
La migración celular es una parte vital de la respuesta inmune, el crecimiento y la cicatrización de heridas. La migración celular es un proceso complejo que implica interacciones entre las células, la matriz extracelular, y factores químicos solubles y no solubles (por ejemplo, factores quimiotácticos). Los métodos estándar para la medición de la migración de las células, tales como el ensayo de cámara de Boyden, el trabajo contando las células a ambos lados de un divisor. Estas técnicas son fáciles de usar; Sin embargo, ofrecen poca modificación geométrica para diferentes aplicaciones. En contraste, los dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados para observar la migración de células con gradientes de concentración personalizables de factores solubles 1, 2. Sin embargo, los métodos para hacer los ensayos de microfluidos basados pueden ser difíciles de aprender.
A continuación, describimos un método fácil para la creación de cámaras de cultivo de células para medir la migración de células en respuesta a gradientes de concentración químicos. Nuestros millas celularesmétodo de la cámara gración puede crear diferentes gradientes de concentración lineal con el fin de estudiar la migración celular para una variedad de aplicaciones. Este método es relativamente fácil de usar y se lleva a cabo normalmente por los estudiantes universitarios.
La cámara de microcanal fue creado por la colocación de un inserto acrílico en la forma de la cámara de microcanal final por pocillo en una placa de Petri. Después de esto, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) se vertió en la parte superior del inserto. El PDMS se deja endurecer y después se eliminó la inserción. Esto permitió la creación de los pozos en cualquier forma o tamaño deseado. Las células se pueden añadir posteriormente a la cámara de microcanal, y agentes solubles se pueden añadir a uno de los pozos por remojo un bloque de agarosa en el agente deseado. El bloque de agarosa se añade a uno de los pozos, y las imágenes de lapso de tiempo puede ser tomada de la cámara de microcanal con el fin de cuantificar la migración celular. Las variaciones de este método se pueden hacer para una aplicación determinada, por lo que este método higHly personalizable.
Protocol
1. La producción de una Cámara de microcanales para crear un gradiente de concentración
- Cortar una pieza de molde de acrílico
- Obtener una pieza de acrílico de la anchura deseada. Típicamente utilizar hojas de acrílico 1/16 pulgadas de espesor. hojas más gruesas son difíciles de cortar bien y muy delgadas hojas no tienen la resistencia mecánica, provocando su rotura o deformación durante el proceso.
- Crear un archivo CAD con la forma deseada de la pieza de acrílico para producir una cavidad dentro del polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar la anchura del cauce y longitud para alcanzar el gradiente deseado correspondiente a los protocolos experimentales individuales.
- A continuación, utilice una pieza de acrílico de las siguientes dimensiones: dos cuadrados (0,254 cm x 0,254 cm) conectados por un canal de ancho de 0,127 cm (0,254 cm de largo) (Figura 1).
- Importe el archivo CAD en el aparato de corte por láser y colocar la pieza de acrílico en un cortador de láser de acuerdo con la manuel protocolo del cante.
NOTA: Como alternativa, 3D-imprimir la pieza desde el diseño CAD. La ventaja de este método es que los materiales alternativos pueden utilizarse para el molde; Sin embargo, la resolución y la reproducibilidad se pueden disminuir con la impresión en 3D en comparación con el corte por láser.
Figura 1: (CAD) Representación Computer-Aided Design de la Cámara de microcanales. Esta imagen representa el dibujo CAD de la pieza de acrílico necesaria para crear la cámara de microcanales. 1 A) Vista superior de dibujo CAD, 1B) Vista lateral de CAD dibujo con dimensiones en pulgadas, 1C) Vista superior de CAD dibujo con dimensiones en pulgadas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- En un recipiente para pesar, mezclar 10 partes en peso de base de elastómero comercial (por ejemplo Sylgard 184) con 1 parte en peso de elastómero comercial Agente de curado (por ejemplo Sylgard 194). Típicamente, la mezcla 10 g de elastómero base a 1 g de elastómero agente de curado.
- Agitar para combinar la base y agente de curado con una micropipeta para 5 min.
- Configurar una campana de vacío y colocar el barco sopesar con PDMS en el vacío durante 30 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
- Apague el vacío y retire el recipiente para pesar. Verter el PDMS en la parte superior del acrílico recortada en una pequeña placa de Petri. Asegúrese de que el PDMS cubre completamente el inserto.
- Permitir a los PDMS curar durante la noche (al menos 18 h) a temperatura ambiente.
- Extracción de la inserción de PDMS
- Después de curar el PDMS, extraiga la tapa cortando cuidadosamente el PDMS alrededor de la pieza de acrílico con un bisturí.
2. placas las células en una Cámara de microcanales
- La esterilización de la cámara para el recubrimiento de las células.
NOTA: Mientras PDMS pueden ser esterilizados con óxido de etileno u otras técnicas, un tratamiento UV rápida es rápido, barato, y suficiente para estudios de cultivo celular. La duración del tratamiento UV corta no afectó la estructura o la integridad mecánica de la pieza de PDMS.- En una cabina de cultivo de células estándar, cubrir completamente la cámara con 70% de etanol.
- Ponga la placa de Petri en la campana de flujo laminar con las tapas.
- Cierre el capó y encender la luz UV. Exponerlo a la luz UV durante 1-2 h.
- Abra la campana de flujo laminar y esperar 15 minutos para restablecer el flujo.
- Retire el etanol al 70%.
- Lavar las cámaras dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Use 1 ml de PBS para cada lavado. Retirar PBS y se permiten cámaras que se seque durante la noche con las tapas.
NOTA: Como alternativa, en lugarde utilizar una campana de flujo laminar, usar una caja de cámara UV para la esterilización si hay alguno disponible. Hacer una caja de UV mediante la colocación de una fuente de luz UV en la parte posterior de una caja de cartón forrada con papel de aluminio. El papel de aluminio refleja la luz para permitir la iluminación uniforme de la muestra.
- Sembrando células en la Cámara
- Contar las células usando azul tripán y un hemocitómetro.
- Añadir 100 ml de la suspensión celular a 400 l de 0,4% Trypan azul y mezclar suavemente. Aplicar 100 l de esta solución a la hemocitómetro rellenando suavemente ambas cámaras bajo el cubreobjetos de vidrio.
- Utilizar un microscopio con un objetivo de 10X para centrarse en la cuadrícula en el hemocitómetro. Utilizar un contador de cuenta de la mano para contar las células no teñidas en vivo dentro de un conjunto de 16 plazas en el hemocitómetro.
- Recuento de células en los 4 grupos de 16 cuadrados. Tome el recuento medio de células a partir de las 4 series de 16 plazas y se multiplica por 4 5x10. Este número final es el number de células / ml en la suspensión celular.
- Añadir 2.500 células a un pocillo de cada cámara. Esto se traduce en una densidad de células casi confluentes de ~ 30.000 / cm 2.
- Permiten a las células para sentarse en la cámara durante 60 minutos antes de la adición de medios (Modificado de Dulbecco del medio Eagle, 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina).
- Contar las células usando azul tripán y un hemocitómetro.
3. Los bloques de agarosa dextrano empapados
- Creación de un bloque de agarosa
- Verter 3% de agarosa en el molde impreso 3D (2 mm x 2 mm x 2 mm).
- Dejar que la agarosa solidifique en una cámara de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas.
- Retire el bloque de agarosa del molde.
NOTA: Como alternativa, se vierte 3% de agarosa en pequeña placa de Petri en un espesor de 2 mm. Corte un bloque de 2 mm x 2 mm x 2 mm con un bisturí u otra herramienta de corte. Esto no es tan preciso como el sistema de molde, pero puede ser un poco más fácil de hacer.
- completamente submerge el bloque de agarosa en una solución de la concentración deseada del factor quimiotáctico. Para evaluar la formación gradiente de concentración, lave la cámara en primer lugar con dextrano fluorescente. La concentración y peso molecular del dextrano deben coincidir con la de un factor o fármaco de interés soluble.
- Remojar la noche a la mañana de bloques de agarosa.
4. lapso de tiempo de la difusión de dextrano para evaluar el gradiente de concentración del factor soluble
- Coloque el bloque de agarosa dextrano empapado en un pequeño pozo cuadrado de la cámara de microcanales.
- Coloque la cámara de microcanal en un sistema de imágenes de células o utilizar otro microscopio de fluorescencia con una función de tiempo. Comienza el lapso de tiempo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Nota: Los resultados mostrados son tomadas con filtro de GFP, el 50% de luz, 4/10 pH, y la magnificación 4X.
5. lapso de tiempo de Crecimiento Celular
- células de la placa en la cámara de microcanal en un extremo de lacámara. Aquí, utilizar fibroblastos 3T3. Añadir 2.500 células a un pocillo en la cámara de microcanal. Recuento de células como se describe en 2.2.1.
- Permiten a las células para sentarse en la cámara durante 60 minutos antes de la adición de medios (Modificado de Dulbecco del medio Eagle, 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina). Mantener la cámara de microcanal con células cultivadas en placas a 37 ° C en 5% de CO 2. La migración celular a través del canal se pueden ver con un microscopio.
- Añadir un marcador o utilizar un defecto microscópico en la cámara como un marcador con el fin de servir como un punto de partida para cuantificar la distancia los delanteros célula se mueve.
- Establecer un gradiente mediante la colocación de un gel de agarosa (8 mm 3 bloques) que contiene el factor de crecimiento concentrado, quimio-atrayente, drogas, u otro factor está probando (aquí, 40% de FBS se utiliza como un ejemplo) en un extremo del microcanal cámara.
- Tomar imágenes con lapso de tiempo de la parte frontal de células en movimiento. Aquí, los resultados muestran imágenes de la célula front que fueron tomadas cada 12 h utilizando un sistema de imagen.
- Use imágenes de la parte delantera celular para cuantificar la tasa de crecimiento celular. Calcular la tasa de crecimiento por primera utilizando la función polyfit MATLAB (roipoly) para crear una máscara poligonal definida por el frente de células, las paredes del canal, y el marcador de referencia. Las dimensiones de esta máscara producen la distancia de migración de la parte frontal de la que se calcula la velocidad del frente de celda promedio. Otros estudios han utilizado un método similar 8.
NOTA: Comparar el borde de la parte delantera de crecimiento de células en cada trama a la concentración del factor soluble en esa misma distancia. El gradiente de concentración factor soluble se calcula usando un modelo de difusión 1D aproximación. - Tomar imágenes fluorescentes de las células por medio de faloidina y DAPI.
- Fijar las células antes de la tinción con faloidina.
- Cálido paraformaldehído al 4% a 37 ° C.
- Agregar suficiente paraformaldehído al 4% para cubrir las células. Mantener células en elde paraformaldehído durante 10 min.
- Enjuague dos veces con PBS durante 15 min cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
- Retirar PBS a partir de células y añadir solución permeabilizante suficiente (0,1% Triton X-100 en PBS) para cubrir células. Deje la solución durante 10 min.
- Lavar dos veces con PBS durante 5 min cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
- Retirar PBS a partir de células y añadir solución de (1% de albúmina de suero bovino en PBS) de bloqueo para 20 min.
- Eliminar la solución de bloqueo y se lava 2 veces con PBS durante 5 minutos cada vez. Use suficiente PBS para cubrir las células.
- A partir de este punto, proteger a las células de la luz con papel de aluminio cuando no se utilicen. Retirar PBS a partir de células y añadir faloidina 488 diluido 1:50 en PBS durante 1 h.
- Lavar 2 veces en PBS durante 5 min para cada lavado. Use suficiente PBS para cubrir las células. A continuación, retire PBS a partir de células.
- Añadir DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) diluido 1: 1000 en PBS a las células durante 15 min.
- Retire y DAPILavar las células dos veces con PBS durante 5 min para cada lavado.
- Retire último lavado y añadir una cantidad suficiente para cubrir las células PBS. Las células ahora se pueden obtener imágenes con un microscopio de fluorescencia.
- Fijar las células antes de la tinción con faloidina.
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Representative Results
La figura 2 muestra el movimiento de la parte delantera de células a través del canal en respuesta a un gradiente de suero bovino fetal colocado en el extremo opuesto del canal, desde donde se siembran las células. El frente celular se muestra a las 48 h (figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), y 120 h (Figura 2D) post chapado. El movimiento de la parte frontal de células fue rastreado con estas imágenes con lapso de tiempo, y la tasa de distancia de migración y el crecimiento se calcularon por la función polyfit MATLAB. De esto, se encontró que la velocidad del frente medio de celda a ser 13,4 micras / h (Figura 3). La Figura 4 muestra el gradiente fluorescente establecido mediante la colocación de un bloque de agarosa empapado de dextrano en un extremo del canal y permitiendo dextrano se difunda a través del canal de 12 h. Una imagen de lapso de tiempo fue tomada en cada hora, y la fluorescencia través de la distancia de el canal se midió y se representó gráficamente como se muestra en la Figura 4 y en comparación con un modelo de difusión 1D.
Figura 2: Movimiento Celular frontal. imágenes con lapso de tiempo de la parte frontal de células en la cámara de microcanales se mueve a través del canal. El frente célula marcada en líneas de color naranja, y la distancia de migración se incluye. Esta distancia de migración se mide a partir de la marca de la placa a la parte delantera de la parte delantera de células como se muestra. Una barra de escala 1 mm se muestra en blanco. A) 48 h después de la galvanoplastia, B) 72 h después de la galvanoplastia, C) 96 h después de la galvanoplastia, D) 120 h después de chapado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: cálculo del tipo de crecimiento. Cell movimiento del frente seguimiento con imágenes con lapso de tiempo. La tasa de crecimiento se calculó utilizando la función polyfit MATLAB (roipoly) para dar velocidad media frente de células de 13,4 m / h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Gradiente fluorescente con dextrano. La intensidad de fluorescencia se mide a través de la distancia del canal en el que cada línea representa el gradiente a una hora en particular. ImageJ se utilizó para calcular la intensidad de fluorescencia. Esto se puede hacer usando el Analizar | Medir herramienta. En primer lugar, elegir mediciones indicadas en virtud de análisis y selección de intensidad. A continuación, elija medida en virtud Analizar el fin de obtener aveintensidad de los píxeles rabia. Esto puede ser trazada frente a la distancia en micras como se muestra en esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestra cámara de microcanal puede ser utilizado para una multitud de propósitos, incluyendo la determinación de la tasa de migración celular en respuesta a factores de crecimiento y factores quimiotácticos y la medición de la velocidad de difusión de un fármaco a partir de una matriz de polímero. Es posible utilizar nuestra cámara de microcanal para hacer crecer células y colocar un quimioatrayente en un extremo de la cámara. Las células crecen en respuesta a la quimioatrayente, y la migración de las células pueden ser cuantificados por la toma de imágenes con lapso de tiempo que pueden ser analizados con el fin de determinar la velocidad de migración de las células. Los resultados representativos de este método se muestran en la Figura 3, donde se determinó la tasa de crecimiento para ser 13,4 micras / h utilizando la función polyfit MATLAB.
Otro uso de nuestra cámara de microcanal es medir la velocidad de difusión de un fármaco fuera de una matriz de polímero. Un dextrano marcado con fluorescencia de un peso molecular similar a la droga de interés puede ser utilizado para modelar la difusión de la Drug de interés. Es importante tener en cuenta que las muestras deben manejarse con cuidado ya que una gran cantidad de convección interrumpirá el gradiente. Los resultados representativos de este método se muestran en la Figura 4. Una ventaja de este modelo en comparación con el ensayo de cámara de Boyden es que es más aplicable a tipos de células adherentes, debido a la superficie plana; mientras que, las células deben caer a través de un pequeño tubo en la cámara de Boyden antes de adherir. Otra limitación de la cámara de Boyden ensayo es que es un ensayo de punto final; Por lo tanto, no se pueden observar visualmente la quimiotaxis. Por el contrario, con nuestro método, la quimiotaxis se observa a través de las imágenes con lapso de tiempo 9. El uso de micropipetas que contienen quimioatrayentes también se han utilizado un método de observación de la migración celular. Sin embargo, el principal inconveniente de este método es el bajo rendimiento 10. La cámara de quimiotaxis Dunn es otro ensayo que se utiliza en conjunción con la imagen de lapso de tiempo como THMétodo E se detalla aquí 11, 12. La cámara consta de dos círculos concéntricos talladas en la cara de la lámina de vidrio con el fin de crear un pozo interior y exterior, y un puente que separa a los dos pozos. El quimioatrayente se coloca en el pocillo exterior, y se dejó que las células para migrar desde el interior de pozo a pozo exterior. Esta migración se cuantifica el uso de imágenes con lapso de tiempo que se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes. Al igual que en el ensayo Boyden, una de las limitaciones del ensayo de cámara de Dunn es que no se puede modificar fácilmente para crear gradientes de concentración del factor de encargo solubles.
Otra técnica simple para evaluar la migración celular es cero, de una in vitro 13. Este método es rápido y barato, ya que sólo requiere la creación de un rasguño en la monocapa celular y la captura de imágenes con lapso de tiempo de la migración de células cercanas al cero previamente creada. however, la principal desventaja de este método es que no es adecuado para medir las respuestas a un gradiente de concentración de factor químico. Nuestro método ofrece la posibilidad de crear un gradiente químico y para cuantificar la migración de células en relación con el gradiente químico. Nuestro método se puede combinar con el método de cero como un rasguño puede ser creado en la monocapa de células, mientras que un factor quimiotáctico está presente en uno de los pozos en la cámara de microcanal. Esto permite la cuantificación y la modelización de la cicatrización de heridas. Otra aplicación potencial de nuestro dispositivo es para determinar la respuesta de las células cancerosas a los agentes que inhiben el crecimiento celular.
Otros sistemas de microfluidos basados también se han utilizado para los estudios de migración celular 14, 15. Estos estudios utilizan técnicas litográficas con habitaciones limpias para crear moldes maestros en silicio y / o mecanizado láser para crear canales de microfluidos en obleas de silicio. wafe de silicior micro mecanizado puede ser caro en comparación con nuestro método que utiliza materiales más baratos (PDMS y acrílico) para la fabricación de una cámara de microcanal. Nuestro dispositivo supera la limitación de otros dispositivos de microfluidos PDMS en los que no fue posible crear pequeños canales 3D basadas 15. Con nuestro método, hemos creado con éxito dispositivo basado PDMS con canales de diámetro pequeño. Otros estudios han utilizado un dispositivo de microfluidos a base de PDMS con dos capas de microcanales y un mezclador de gas multi-canal que está controlado por ordenador a fin de crear gradientes arbitrarias de oxígeno para estudiar la migración de las células con diferentes gradientes de oxígeno 16. Existe un potencial de nuestro dispositivo para ser utilizado en una manera similar con la adición de una cámara de mezcla de gas en un extremo de la cámara de microcanal.
Los dispositivos microfluídicos se hacen a menudo usando técnicas litográficas blandas; estos pueden ser adaptados para crear chambe migración celularrs. Estos métodos implican la impresión de una máscara con los patrones de canal con el diseño asistido por ordenador (CAD). Estas máscaras se proyectan en un molde maestro recubierto con un fotosensible resistir a través de la litografía óptica. Después de que se hizo el molde maestro, PDMS se vierte en el maestro y se deja endurecer el fin de crear un molde de PDMS que puede ser utilizado para estudios de microfluidos 17, 18, 19. Compuestos quimioatrayente o chemorepulsive se colocan en la cámara en alta concentración en uno de los depósitos para crear gradientes de 17. Aunque estas técnicas son similares a nuestra puesta a punto, que puede ser costoso debido al alto costo de crear el molde maestro para el sistema y el uso de salas limpias. Además, estos métodos pueden ser difíciles para que los estudiantes aprendan en un entorno basado en la clase. Los insertos utilizados en nuestro set-up para crear los canales se pueden crear con una gran variedad de métodos, incluyendo pr 3DInting y de corte por láser. Por lo tanto, nuestro sistema permite la creación de una amplia variedad de moldes para un costo relativamente bajo en particular como la impresión 3D se hace más asequible y ampliamente disponibles.
PDMS dispositivos microfluídicos basados para medir la migración celular y el crecimiento se han utilizado para una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, en la neurociencia investigación estudia 20, los dispositivos fueron fabricados utilizando técnicas de litografía suave en la que el componente de PDMS se colocó en una placa de cultivo tisular o de vidrio con el fin de formar dos compartimentos que se han separado por una barrera física con ranuras de tamaño micrométrico para permitir neuronas a crecer a través de los compartimentos. Se tomaron imágenes con lapso de tiempo para mostrar las neuronas que cruzan la barrera. El método de la micropatterning utilizado para producir este dispositivo es complejo, mientras que el método de producción para nuestro dispositivo es simple y puede ser usado por los investigadores en todos los niveles. Otro estudio también utilizó un método de bajo costo fácil para la producción de un SIMilar dispositivo de microfluidos PDMS utilizando un molde maestro creado a partir de cinta adhesiva con el fin de crear una impresión en el PDMS para producir microcanales. Una ventaja de nuestro enfoque sobre el que se describe en este método es que los canales en nuestro método se fabrican en un solo paso, mientras que este protocolo requiere la adhesión entre dos capas de PDMS que crea problemas con el flujo medio a las células 21.
En conclusión, nuestro método de la cámara de microcanal es adaptable y puede ser usada para obtener resultados diferentes. El método permite la creación de un gradiente de concentración con el fin de adaptarse a las necesidades del usuario. Por otra parte, nuestro dispositivo ofrece una ventaja sobre los dispositivos existentes debido a su costo relativamente bajo y la facilidad de uso para los investigadores en todos los niveles.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen programa de investigación creativa de la Universidad de Clemson y NSF CBET1254609 para proporcionar fondos para este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
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