Summary
Detta protokoll detaljer en anpassningsbar metod för att mäta cellmigration som svar på kemoattraherande ämnen som också kan användas för att bestämma diffusionshastigheten för ett läkemedel ur en polymermatris.
Abstract
Cellmigration är en viktig del av immunsvar, tillväxt och sårläkning. Cellmigration är en komplex process som involverar interaktioner mellan celler, den extracellulära matrisen och lösliga och icke-lösliga kemiska faktorer (t.ex. kemoattraherande ämnen). Standardmetoder för mätning av migration av celler, såsom Boyden kammaranalys, arbete genom att räkna celler på vardera sidan av en avdelare på. Dessa tekniker är lätta att använda; men de erbjuder lite geometrisk modifiering för olika tillämpningar. I motsats härtill kan mikrofluidikanordningar användas för att observera cellmigrering med anpassnings koncentrationsgradienter av lösliga faktorer 1, 2. Emellertid kan förfaranden för framställning av mikrofluidik baserade analyser vara svår att lära sig.
Här beskriver vi en enkel metod för att skapa cellkulturkammare för att mäta cellmigration som svar på kemiska koncentrationsgradienter. Våra cell migration kammarmetoden kan skapa olika linjära koncentrationsgradienter för att studera cellmigration för en mängd olika tillämpningar. Denna metod är relativt lätt att använda och utförs typiskt genom studenter.
Mikrokanalen kammaren skapades genom att placera en akryl insats i form av den slutliga mikrokanalkammaren väl i en petriskål. Efter detta, var poly (dimetylsiloxan) (PDMS) hälldes på toppen av insatsen. PDMS tilläts hårdna och sedan insatsen avlägsnades. Detta tillåtet för skapandet av brunnar i varje önskad form eller storlek. Celler kan därefter tillförs mikrokanalkammaren, och lösliga medel kan tillsättas till en av brunnarna genom blötläggning en agaros-block i det önskade medlet. Agarosen blocket sätts till en av brunnarna, och time-lapse bilder kan tas till mikrokanalkammaren för att kvantifiera cellmigration. Variationer av denna metod kan göras för en given tillämpning, vilket gör denna metod HIGhly anpassningsbar.
Protocol
1. Att producera en mikro avdelningen att skapa en koncentrationsgradient
- Skärning av en akrylformelementet
- Erhålla en bit av akryl av den önskade bredden. Vanligtvis använder 1/16-tums tjock akrylskivor. Tjockare skivor är svåra att skära bra och mycket tunna ark inte ha erforderlig mekanisk hållfasthet, vilket får dem att bryta eller varp under processen.
- Skapa en CAD-fil med den önskade formen för den akrylstycket för att alstra en hålighet inuti polydimetylsiloxan (PDMS). Justera kanalens bredd och längd för att uppnå den önskade gradienten relevant för enskilda experimentella protokoll.
- Här kan du använda en akryl av följande dimensioner: två rutor (0,254 cm x 0,254 cm) förbundna med en 0,127 cm bred kanal (0,254 cm lång) (Figur 1).
- Importera CAD-filen till laserskärapparaten och placera akryl i en laserskärare enligt manukarens protokoll.
OBS: Alternativt 3D-ut bit från CAD-konstruktion. Fördelen med denna metod är att alternativa material kan användas för formen; Men, kan upplösningen och reproducerbarhet minskas med 3D-utskrifter jämfört med laserskärning.
Figur 1: datorstödd konstruktion (CAD) representation Microchannel avdelningen. Detta avbildar visar CAD-ritningen av akryl insatsen som krävs för att skapa mikrokammaren. 1 A) Uppifrån av CAD-ritningar, 1B) Sidovy av CAD-ritning med mått i inches, 1C) Uppifrån av CAD-ritning med mått i inches Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- I en väga båt, blanda 10 viktdelar kommersiell Elastomer Base (t.ex. Sylgard 184) med en viktdel av kommersiell Elastomer härdare (t.ex. Sylgard 194). Typiskt, blanda 10 g elastomerbasen till en g Elastomer härdare.
- Rör om att kombinera basen och härdare med en mikropipett under 5 min.
- Inrätta en vakuumklocka och placera väga båt med PDMS i vakuum under 30 minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Stäng av vakuumet och avlägsna väger båten. Häll PDMS på toppen av den akryl utskärning i en liten petriskål. Se till att PDMS helt täcker skäret.
- Tillåta PDMS att härda över natten (minst 18 h) vid rumstemperatur.
- Ta bort insatsen från PDMS
- Efter härdning PDMS, avlägsna insatsen genom att försiktigt skära PDMS runt akryl stycke med en skalpell.
2. Plätering cellerna i en mikro avdelningen
- Sterilisering av kammaren för plätering celler.
OBS: Medan PDMS kan steriliseras med hjälp av etylenoxid eller andra tekniker, är en sammanfattning av UV-behandling snabbt, billigt, och tillräcklig för cellkulturstudier. Det korta UV behandlingstid försämrade inte den struktur eller mekaniska integriteten hos den PDMS stycket.- I en standardcellodlingsskåp, helt täcka kammaren med 70% etanol.
- Sätta petriskål i dragskåp med laminärt flöde med locken off.
- Stäng huven och slå på UV-ljus. Utsättas för UV-ljus i 1-2 h.
- Öppna huv med laminärt flöde och vänta 15 min för att återupprätta flödet.
- Ta bort 70% etanol.
- Tvätta kamrarna två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Använd 1 ml PBS för varje tvätt. Ta bort PBS och låt kammare för att torka över natten med locken utanför.
OBS: Alternativt iställetatt använda ett laminärt flöde huva, använda en UV-kammaren låda för sterilisering om det finns någon. Göra en UV box genom att placera en UV-ljuskälla i baksidan av en kartong fodrad med aluminiumfolie. Aluminiumfolien reflekterar ljuset för att tillåta jämn belysning av provet.
- Utstrykning av celler i kammaren
- Räkna celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
- Tillsätt 100 mikroliter av cellsuspensionen till 400 mikroliter av 0,4% trypanblått och blanda försiktigt. Tillsätt 100 mikroliter av denna lösning till hemocytometer genom att försiktigt fylla båda kamrarna under glastäck.
- Använd ett mikroskop med en 10X mål att fokusera på nätet på hemocytometer. Använd en handräknare för att räkna levande ofärgade celler i en uppsättning av 16 rutor på hemocytometer.
- Räkna celler i alla 4 uppsättningar av 16 rutor. Ta den genomsnittliga celltal från 4 uppsättningar av 16 kvadrater och multiplicera med 5x10 4. Denna slutliga siffran är number från celler / ml i cellsuspensionen.
- Lägg 2500 celler till en brunn i varje kammare. Detta kan översättas till en nära-konfluent celldensitet av ~ 30000 / cm 2.
- Låt cellerna att sitta i kammaren under 60 min före tillsats av media (Dulbeccos modifierade Eagles medium, 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin).
- Räkna celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
3. dextran Fuktiga agarosblock
- Skapa en agaros blocket
- Pour 3% agaros in i 3D tryckta formen (2 mm x 2 mm x 2 mm).
- Tillåta agarosen att stelna i en vakuumkammare under 30 minuter för att avlägsna eventuella bubblor.
- Ta bort agarosen kvarter från formen.
OBS: Alternativt, häll 3% agaros i små petriskål vid en tjocklek av 2 mm. Skär en 2 mm x 2 mm x 2 mm blocket med hjälp av en skalpell eller annan skärverktyg. Detta är inte lika noggrann som formsystemet, men det kan vara lite lättare att göra.
- helt submerge agarosen blocket i en lösning av den önskade koncentrationen av den kemotaktiska faktorn. För att bedöma koncentrationsgradienten bildningen, spola kammaren först med fluorescerande dextran. Koncentrationen och molekylvikten för dextran bör matcha den hos en löslig faktor eller ett läkemedel av intresse.
- Blöt agarosen blocket natten.
4. Time-lapse av dextran Diffusion att bedöma löslig faktor koncentrationsgradienten
- Placera dextran indränkt agarosen blocket i en liten fyrkantig brunn i mikrokammaren.
- Placera mikrokammaren i en cell imaging system eller använda en annan fluorescensmikroskop med en time-lapse kapacitet. Påbörja tidsförlopp i enlighet med tillverkarens instruktioner.
OBS: De visade resultaten tas med GFP filter, 50% ljus, 4/10 pH och 4X förstoring.
5. Time-lapse av celltillväxt
- Plate celler i mikrokanalkammare vid en ände avkammare. Här använder 3T3 fibroblaster. Lägg 2500 celler till en brunn i mikrokammaren. Räkna celler som beskrivs i 2.2.1.
- Låt cellerna att sitta i kammaren under 60 min före tillsats av media (Dulbeccos modifierade Eagles medium, 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin). Hålla mikrokanalkammaren med strukna cellerna vid 37 ° C i 5% CO2. Cellmigration genom kanalen kan ses med ett mikroskop.
- Lägg en markör eller använda en mikroskopisk defekt i kammaren som en markör för att tjäna som en startpunkt för att kvantifiera avståndet cell främre rör.
- Etablera en gradient genom att placera en agarosgel (8 mm 3 block) innehållande den koncentrerade tillväxtfaktor, kemo-attraherande, drog, eller annan faktor som testas (här, 40% FBS används som exempel) i ena änden av mikrokanalen kammare.
- Ta tidsförlopp bilder av den rörliga cell front. Här visar resultaten bilder av cellen front som togs var 12 timmar med hjälp av ett bildsystem.
- Använda bilder av cell front för att kvantifiera celltillväxthastigheten. Beräkna tillväxttakten genom att först använda polyfit funktionen MATLAB (roipoly) för att skapa en polygonal mask definieras av cell front, kanalväggarna, och referensmarkören. Måtten på denna mask ge migreringsavståndet av den främre, från vilken medelcellfronthastighet beräknas. Andra studier har utnyttjat en liknande metod 8.
OBS: Jämför kanten av celltillväxt framsidan på varje ram för att koncentrationen av den lösliga faktorn vid samma avstånd. Den lösliga faktorn koncentrationsgradient beräknas med en 1D approximation diffusion modell. - Ta fluorescerande bilder av cellerna med hjälp Phalloidin och DAPI färgning.
- Fix celler innan färgning med Phalloidin.
- Varm 4% paraformaldehyd vid 37 ° C.
- Tillsätt tillräckligt 4% paraformaldehyd för att täcka cellerna. Hålla cellerna iparaformaldehyd under 10 min.
- Skölj två gånger med PBS under 15 minuter varje gång. Använd tillräckligt PBS för att täcka cellerna.
- Ta bort PBS från celler och tillsätt tillräckligt permeabilisering lösning (0,1% Triton X-100 i PBS) för att täcka cellerna. Lämnar lösningen under 10 min.
- Tvätta två gånger med PBS under 5 minuter varje gång. Använd tillräckligt PBS för att täcka cellerna.
- Ta bort PBS från celler och tillsätt blockeringslösning (1% bovint serumalbumin i PBS) under 20 min.
- Avlägsna blockeringslösning och tvätta 2 gånger med PBS under 5 min varje gång. Använd tillräckligt PBS för att täcka cellerna.
- Från denna punkt, skyddar celler från ljus med aluminiumfolie när den inte används. Ta bort PBS från celler och tillsätt Phalloidin 488 utspätt 1:50 i PBS under 1 h.
- Tvätta 2 gånger i PBS under 5 min för varje tvätt. Använd tillräckligt PBS för att täcka cellerna. Ta sedan bort PBS från celler.
- Lägg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) utspädd 1: 1000 i PBS till cellerna under 15 min.
- Avlägsna DAPI ochtvätta cellerna två gånger med PBS under 5 min för varje tvätt.
- Ta sista tvättningen och tillsätt tillräckligt PBS för att täcka cellerna. Celler kan nu skall avbildas med ett fluorescensmikroskop.
- Fix celler innan färgning med Phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar rörelsen av cellen fram över kanalen som svar på en gradient av fetalt bovint serum placeras vid den motsatta änden av kanalen från där cellerna pläteras. Cellen fram visas vid 48 h (figur 2A), 72 h (figur 2b), 96 h (figur 2C), och 120 h (figur 2D) stolpen plätering. Rörelsen av cellen främre spårades med dessa tidsförlopp bilder, och migreringen avstånd och tillväxthastigheten beräknades genom den polyfit funktionen MATLAB. Från detta, var den genomsnittliga cellfronthastigheten befanns vara 13,4 ^ m / h (figur 3). Figur 4 visar den fluorescerande gradienten upprättas genom att en dextran indränkt agaros blocket vid en ände av kanalen och tillåta dextran diffundera genom kanalen under 12 timmar. En time-lapse bilden togs vid varje timme, och fluorescens över avståndet kanalen mättes och plottades såsom visas i fig 4 och jämförs med en 1D diffusionsmodell.
Figur 2: Cell frambensrörelser. Time-lapse bilder av cell front i mikrokammaren rör sig genom kanalen. Cell front markerade i orange linjer och migreringsavståndet ingår. Denna migration avstånd mättes från markeringen på plattan till framsidan av cellen framsidan, såsom visas. En 1 mm skala bar visas i vitt. A) 48 timmar efter plätering, B) 72 timmar efter plätering, C) 96 timmar efter plätering, D) 120 timmar efter plätering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
e 3 "src =" / filer / ftp_upload / 55.264 / 55264fig3.jpg "/>
Figur 3: Growth Rate Beräkning. Cell främre rörelse spåras med tidsförlopp bilder. Tillväxttakten beräknades med polyfit funktionen MATLAB (roipoly) för att ge medelcellfronthastighet av 13,4 pm / h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fluorescerande Gradient med dextran. Fluorescensintensitet mätt över en sträcka på kanalen där varje rad representerar gradienten vid en viss timme. ImageJ användes för att beräkna fluorescensintensiteten. Detta kan göras med hjälp av Analysera | Mätverktyget. Först väljer Set Mätningar i Analysera och välj intensitet. Sedan väljer åtgärd inom Analyze för att få average pixelintensiteten. Detta kan ritas i förhållande till avståndet i mikrometer, såsom visas i denna figur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår mikrokanalkammaren kan användas för en mängd ändamål, inklusive bestämning av cellmigration hastigheten som svar på tillväxtfaktorer och kemoattraktanter och mäta diffusionshastigheten för ett läkemedel från en polymermatris. Det är möjligt att utnyttja vår mikrokammare för att odla celler och placera en chemoattractant i ena änden av kammaren. Cellerna växer som svar på kemoattraherande, och cellmigration kan kvantifieras genom att ta tidsförlopp bilder som kan analyseras, för att bestämma den cellvandring hastigheten. Representativa resultat av denna metod visas i figur 3, där tillväxthastigheten bestämdes till 13,4 | im / h med användning av polyfit funktionen MATLAB.
En annan användning av vår mikrokanalkammaren är att mäta diffusionshastigheten för ett läkemedel ur en polymermatris. En fluorescensmärkta dextran med en liknande molekylvikt för läkemedlet av intresse kan användas för att modellera den diffusion av drug av intresse. Det är viktigt att notera att proverna måste hanteras varsamt som en stor mängd konvektion kommer att störa gradienten. De representativa resultaten av denna metod visas i figur 4. En fördel med denna modell i jämförelse med Boyden kammaranalys är att det är mer tillämpliga på adherenta celltyper på grund av den plana ytan; medan, måste cellerna faller genom ett litet rör i Boyden-kammare före vidhäftning. En annan begränsning av Boyden kammaranalys är att det är en endpoint analys; sålunda kemotaxi kan inte observeras visuellt. I motsats, med vår metod är kemotaxi observeras genom de tidsförlopp bilder 9. Användning av mikropipetter som innehåller kemoattraherande ämnen har också använts ett förfarande för att observera cellmigration. Men den största nackdelen med denna metod låg genomströmning 10. Dunn kemotaxi kammare är en annan analys som används i samband med time-lapse avbildning som the metod beskrivs här 11, 12. Kammaren består av två koncentriska cirklar ristade på ytan av glasskivan för att skapa en inre och yttre väl, och en bro skiljer de två brunnarna. Kemoattraktanten placeras i den yttre brunn, och cellerna får migrera från den inre väl till den yttre brunn. Denna migration kvantifieras med time-lapse bilder som analyseras med bildanalysprogram. I likhet med Boyden-analysen, är en av begränsningarna av kammaranalysen Dunn att det inte lätt kan modifieras för att skapa anpassade lösliga faktor koncentrationsgradienter.
En annan enkel teknik för att bedöma cellmigration är ett in vitro skrapa 13. Denna metod är snabb och billig eftersom den endast kräver att skapa en repa i cellmonoskiktet och fånga tidsförlopp bilder av cellmigration nära den tidigare skapade scratch. however, är den största nackdelen med denna metod att det inte är lämpligt att mäta svar på en kemisk faktor koncentrationsgradient. Vår metod ger potential för att skapa en kemisk gradient och att kvantifiera cellmigration i förhållande till den kemiska gradienten. Vår metod kan kombineras med scratch-metoden som en repa kan skapas i cellmonoskiktet, medan en kemotaktisk faktor är närvarande i en av brunnarna i mikrokanalen kammaren. Detta gör det möjligt för kvantifiering och modellering av sårläkning. En annan potentiell tillämpning av vår anordning är att bestämma responsen hos cancerceller för medel som inhiberar celltillväxt.
Andra mikrofluidik-baserade system har också använts för cellmigrationsstudier 14, 15. Dessa studier använder litografiska tekniker med rena rum för att skapa mästare formar i kisel och / eller laserbearbetning för att skapa mikroflödessystem kanaler i kiselskivor. kisel wafer mikrobearbetning kan bli dyrt i jämförelse med vår metod som utnyttjar billigare material (PDMS och akryl) för att tillverka en mikrokammare. Vår enhet vinner begränsning av andra PDMS baserade mikroflödessystem enheter där det inte var möjligt att skapa små 3D kanaler 15. Med vår metod har vi lyckats skapa PDMS baserad enhet med kanaler med liten diameter. Andra studier har använt en PDMS-baserade mikroflödessystem enhet med två lager av mikrokanaler och en flerkanals gasblandare som är datorstyrd för att skapa godtyckliga gradienter av syre för att studera migrationen av celler under olika gradienter av syre 16. Det finns potential för vår anordning som skall användas på ett liknande sätt med tillsats av en gas blandningskammare vid en ände av mikrokanalkammaren.
Mikrofluidikanordningar görs ofta med mjuka litografiska tekniker; dessa kan anpassas för att skapa cellmigration chambers. Dessa metoder innebär att skriva en mask med kanalmönster med datorstödd konstruktion (CAD). Dessa masker är sedan projiceras på en mästare mögel belagd med en ljuskänslig motstå genom optisk litografi. Efter master Formen är tillverkad, är PDMS hälls på master och får härda i syfte att skapa en PDMS mögel som kan användas för mikroflödesstudier 17, 18, 19. Kemoattraherande eller chemorepulsive föreningar placeras i kammaren i hög koncentration i en av reservoarerna för att skapa gradienter 17. Medan dessa tekniker är liknar vår uppsättning upp, kan de vara dyra på grund av den höga kostnaden för att skapa master mold för systemet och användning av rena rum. Dessutom kan dessa metoder vara svårt för eleverna att lära sig i en klass baserad inställning. Skären som används i vår set-up för att skapa kanaler kan skapas med en rad olika metoder, bland annat 3D-printing och laserskärning. Således tillåter vårt system för att skapa en mängd olika formar för relativt låg kostnad särskilt som 3D-utskrifter blir mer överkomliga och allmänt tillgängliga.
PDMS baserade mikrofluidanordningar för mätning av cellmigration och tillväxt har använts för ett brett spektrum av applikationer. Till exempel i neurovetenskaplig forskning studerar 20, anordningar tillverkades med användning av mjuk litografi tekniker i vilka PDMS komponenten placerades på en vävnadsodlingsskål eller glas för att bilda två fack som är åtskilda av en fysisk barriär med mikrometerstorlek spår för att tillåta neuroner att växa över facken. Time-lapse bilder togs för att visa nervceller som korsar barriären. Metoden för micropatterning används för att framställa denna anordning är komplex, medan den produktionsmetod för vår anordning är enkel och kan användas av forskare på alla nivåer. En annan studie används också ett enkelt billig metod för framställning av en siMilar PDMS mikroflödessystem enhet med hjälp av en master mögel skapas från tejp för att skapa ett intryck i PDMS att producera mikro. En fördel med vår strategi över det som beskrivs i denna metod är att kanalerna i vår metod är tillverkade i ett steg, medan detta protokoll kräver adhesion mellan två PDMS skikt som skapar problem med medieflödet till cellerna 21.
Sammanfattningsvis är vår mikrokanalkammarmetod anpassningsbara och kan användas för att erhålla olika resultat. Metoden gör det möjligt att skapandet av en koncentrationsgradient för att passa användarens behov. Dessutom erbjuder vår enhet en fördel gentemot existerande enheter på grund av dess relativt låga kostnad och användarvänlighet för forskare på alla nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner Clemson University Creative Förfrågan program och NSF CBET1254609 för att tillhandahålla finansiering för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
