Summary
Denne protokol detaljer en tilpasselig metode til at måle cellemigrering som respons på kemoattraktanter, som også kan anvendes til bestemmelse af diffusionshastigheden af et lægemiddel ud af en polymer matrix.
Abstract
Cell migration er en vital del af immunreaktioner, vækst og sårheling. Cellemigrering er en kompleks proces, der involverer interaktioner mellem celler, den ekstracellulære matrix, og opløselige og ikke-opløselige kemiske faktorer (f.eks kemoattraktanter). Standardmetoder til måling af migration af celler, såsom Boyden kammer assay arbejde ved at tælle celler på hver side af en skillevæg. Disse teknikker er nemme at bruge; De tilbyder dog lidt geometrisk modifikation til forskellige applikationer. I modsætning hertil kan mikrovæskeanordninger anvendes til at observere cellemigrering med tilpasselig koncentrationsgradienter af opløselige faktorer 1, 2. fremgangsmåder til fremstilling mikrofluidik baserede assays kan imidlertid være svært at lære.
Her beskriver vi en nem metode til at skabe cellekultur kamre til måling cellemigrering som respons på kemiske koncentrationsgradienter. Vores celle migration kammer metode kan skabe forskellige lineære koncentrationsgradienter for at studere cellemigrering til en lang række applikationer. Denne metode er relativt let at bruge og udføres typisk ved studerende.
Mikrokanalplade Kammeret blev skabt ved at anbringe en acryl insert i form af den endelige mikrokanalplade kammer brønd i en petriskål. Herefter blev poly (dimethylsiloxan) (PDMS) hældes på toppen af indsatsen. PDMS fik lov at hærde, og derefter insertet blev fjernet. Dette gav mulighed for etablering af brønde i enhver ønsket form eller størrelse. Celler kan tilsættes efterfølgende til mikrokanalplade kammeret, og opløselige midler kan tilsættes til en af brøndene ved neddypning en agarose blok i ønsket middel. Agarose blok sættes til en af brøndene, og time-lapse billeder kan tages af mikrokanalplade kammer for at kvantificere cellemigrering. kan foretages variationer af denne metode for en given anvendelse, hvilket gør denne metode HIGHly tilpasses.
Protocol
1. Producere en mikrokanalplade Afdeling oprettes en koncentrationsgradient
- Skæring en akryl støbeformdel
- Opnå et stykke acryl af den ønskede bredde. Typisk bruger 1/16-tommer-tykke acrylplader. Tykkere plader er vanskelige at skære godt og meget tynde plader har ikke den fornødne mekaniske styrke, hvilket får dem til at bryde eller kæde under processen.
- Opret en CAD-fil med den ønskede form af den acryliske stykke for at frembringe et hulrum i polydimethylsiloxan (PDMS). Juster kanal bredde og længde for at opnå den ønskede gradient relevant for de enkelte eksperimentelle protokoller.
- Her skal du bruge en akryl stykke af følgende dimensioner: to felter (0,254 cm x 0,254 cm) forbundet med en 0,127 cm bred kanal (0,254 cm lang) (Figur 1).
- Importer CAD-filen i laserskæring apparat og placer akryl brik i en laserskærer henhold til manukantens protokol.
BEMÆRK: Alternativt 3D-printe stykket fra CAD design. Fordelen ved denne metode er, at alternative materialer kan anvendes til formen, dog kan opløsningen og reproducerbarhed reduceres med 3D-print i forhold til laserskæring.
Figur 1: Computer-Aided Design (CAD) repræsentation Microchannel Afdeling. Dette billede viser CAD-tegning af akryl indsats er nødvendig for at skabe den mikrokanalplade kammer. 1 A) set fra oven CAD-tegning, 1B) Side visning af CAD-tegning med dimensioner i inches, 1C) set fra oven CAD tegning med dimensioner i inches Klik her for at se en større version af dette tal.
- I en vejer båd, bland 10 vægtdele kommercielt Elastomer Base (f.eks Sylgard 184) med en vægtdel kommercielle Elastomer hærderen (f.eks Sylgard 194). Typisk blandes 10 g Elastomer Base til 1 g Elastomer hærder.
- Stir at kombinere base og hærder med en mikropipette i 5 min.
- Opsæt et vakuum klokke og placer vejer båd med PDMS i vakuum i 30 min for at fjerne luftbobler.
- Sluk for vakuum og tag vejer båden. Hæld PDMS oven på acryl udskæring i en lille petriskål. Sørg for, at PDMS fuldstændig dækker indsatsen.
- Tillad PDMS at hærde natten over (mindst 18 timer) ved stuetemperatur.
- Udtagning af fra PDMS
- Efter hærdning PDMS, fjerne indsatsen ved forsigtigt at skære PDMS omkring akryl stykke med en skalpel.
2. Plating Cellerne i en mikrokanalplade Chamber
- Sterilisering kammeret til udpladning celler.
BEMÆRK: Mens PDMS kan steriliseres ved anvendelse af ethylenoxid eller andre teknikker, en hurtig UV-behandling er hurtig, billig og tilstrækkelig til studier af cellekulturer. Den korte UV behandlingsvarighed ikke forringe struktur eller mekaniske integritet af PDMS stykket.- I en standard cellekultur kabinet, fuldstændigt dækker kammer med 70% ethanol.
- Sætte petriskålen i laminar flow hætte med låg off.
- Luk hætten og tænd for UV-lys. Udsættes for UV-lys i 1-2 timer.
- Åbn laminar flow hætte og vente 15 minutter for at genetablere strømningen.
- Fjern 70% ethanol.
- Vask kamrene to gange med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Brug 1 ml PBS i hver vask. Fjern PBS og tillade kamre tørre natten med låg off.
BEMÆRK: Alternativt i stedettil anvendelse af en laminær strømning, brug en UV kammerboksen til sterilisering, hvis en sådan er tilgængelig. Foretag en UV boks ved at placere en lyskilde UV i bagsiden af en papkasse foret med aluminiumfolie. Aluminiumfolien reflekterer lyset for at muliggøre jævn belysning af prøven.
- Plating celler i salen
- Tæl celler under anvendelse af Trypan blå og et hæmocytometer.
- Tilsæt 100 pi af cellesuspensionen til 400 pi 0,4% trypanblåt og blandes forsigtigt. Påfør 100 pi af denne opløsning til hæmocytometeret ved forsigtigt at fylde begge kamre under dækglas.
- Brug et mikroskop med en 10X målsætning at fokusere på gitteret på hæmocytometeret. Brug en hånd tally tæller til at tælle de levende ufarvede celler i et sæt af 16 firkanter på hæmocytometeret.
- Tæl celler i alle 4 sæt af 16 kvadrater. Tag den gennemsnitlige celletal fra de 4 sæt af 16 pladser og gange med 5x10 4. Dette sidste tal er number fra celler / ml i cellesuspensionen.
- Tilføj 2.500 celler til en brønd i hvert kammer. Dette svarer til en næsten sammenflydende celledensitet på ~ 30.000 / cm2.
- Tillad celler til at sidde i kammeret i 60 min før tilsætning medier (Dulbeccos Modified Eagles Medium, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin).
- Tæl celler under anvendelse af Trypan blå og et hæmocytometer.
3. Dextran Soaked Agarose Blocks
- Oprettelse af en agarose blok
- Hæld 3% agarose i 3D trykte støbeform (2 mm x 2 mm x 2 mm).
- Tillad agarose at størkne i et vakuumkammer i 30 minutter for at fjerne eventuelle bobler.
- Fjern agarose blok fra formen.
BEMÆRK: Alternativt, hæld 3% agarose i små petriskål med en tykkelse på 2 mm. Skær en 2 mm x 2 mm x 2 mm blok under anvendelse af en skalpel eller andet skærende værktøj. Dette er ikke så præcis som formen system, men det kan være lidt lettere at gøre.
- helt submerge agarose blok i en opløsning af den ønskede koncentration af den kemotaktiske faktor. For at vurdere koncentrationsgradienten dannelse, skylle kammeret først med fluorescerende dextran. Koncentrationen og molekylvægten af dextran bør stemme overens med en opløselig faktor eller lægemiddel af interesse.
- Soak agarose blok natten over.
4. Time-lapse af Dextran Diffusion at Vurdere Opløselig Factor Koncentration Gradient
- Placer dextran gennemvædet agarose blok i en lille firkant brønd i mikrokanalplade kammeret.
- Placer mikrokanalplade kammer i en celle imaging system eller anvende en anden fluorescerende mikroskop med en tidsforskudt kapacitet. Begynd time-lapse ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: De viste resultater er taget med GFP filter, 50% let, 4/10 pH, og 4X forstørrelse.
5. Time-lapse af cellevækst
- Plate celler i mikrokanalplade kammer i den ene ende afkammer. Her bruge 3T3 fibroblaster. Tilføj 2.500 celler til en brønd i mikrokanal kammeret. Tæl celler som beskrevet i 2.2.1.
- Tillad celler til at sidde i kammeret i 60 min før tilsætning medier (Dulbeccos Modified Eagles Medium, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin). Hold mikrokanalplade kammer med udpladede celler ved 37 ° C i 5% CO2. Cellemigrering gennem kanalen kan ses med et mikroskop.
- Tilføj en markør eller bruge en mikroskopisk defekt i kammeret som en markør for at tjene som et udgangspunkt sted at kvantificere den afstand, cellen forreste bevæger sig.
- Etablere en gradient ved at placere en agarosegel (8 mm 3 blok) indeholdende koncentreret vækstfaktor, kemo-tiltrækningsstof, lægemiddel eller andre faktorer, der testes (her 40% FBS bliver brugt som eksempel) i den ene ende af mikrokanal kammer.
- Tag time-lapse billeder af bevægelige celle front. Her viser resultaterne billeder af cellen front der blev taget hver 12 timer under anvendelse af et billedbehandlingssystem.
- Brug billeder af cellen foran at kvantificere celle vækst. Beregn væksten ved først at bruge Matlab polyfit funktion (roipoly) for at oprette en polygonal maske defineret af cellen foran, kanalvæggene, og henvisningen markør. Dimensionerne af denne maske opnåelse af migration afstand af fronten, hvorfra gennemsnitlige celle forreste hastighed beregnes. Andre studier har anvendt en lignende fremgangsmåde 8.
BEMÆRK: Sammenlign kanten af cellevæksten foran på hver ramme til koncentrationen af den opløselige faktor på det samme afstand. Den opløselige faktor koncentrationsgradient er beregnet ved hjælp af en 1D diffusion model tilnærmelse. - Tag fluorescerende billeder af cellerne under anvendelse Phalloidin og DAPI-farvning.
- Fix celler, før farvning med Phalloidin.
- Varm 4% paraformaldehyd ved 37 ° C.
- Tilsæt så 4% paraformaldehyd til dækning celler. Hold celler iparaformaldehyd i 10 min.
- Skyl to gange med PBS i 15 minutter hver gang. Brug nok PBS til at dække cellerne.
- Fjern PBS fra celler og tilføje nok permeabiliserende opløsning (0,1% Triton X-100 i PBS) til dækning af celler. Efterlad opløsningen i 10 minutter.
- Vask to gange med PBS i 5 minutter hver gang. Brug nok PBS til at dække cellerne.
- Fjern PBS fra cellerne og tilføje blokerende opløsning (1% bovint serumalbumin i PBS) i 20 min.
- Fjern blokeringsopløsning og vask 2 gange med PBS i 5 minutter hver gang. Brug nok PBS til at dække cellerne.
- Fra dette punkt, beskytte celler mod lys med aluminiumfolie, når den ikke bliver brugt. Fjern PBS fra celler og tilføj Phalloidin 488 fortyndet 1:50 i PBS i 1 time.
- Vask 2 gange i PBS i 5 minutter for hver vask. Brug nok PBS til at dække cellerne. Fjern derefter PBS fra celler.
- Tilføj DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) fortyndet 1: 1.000 i PBS til cellerne i 15 min.
- Fjern DAPI ogVask cellerne to gange med PBS i 5 minutter for hver vask.
- Fjern sidste vask og tilføje nok PBS til at dække celler. Celler kan nu afbildes med et fluorescensmikroskop.
- Fix celler, før farvning med Phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser bevægelsen af cellen foran over kanalen som reaktion på en gradient af kalvefosterserum placeret i den modsatte ende af kanalen, hvorfra cellerne udplades. Cellen foran er vist ved 48 timer (figur 2A), 72 timer (figur 2B), 96 h (Figur 2C), og 120 timer (figur 2D) efter udpladning. Bevægelsen af cellen fronten blev sporet med disse time-lapse billeder, og migrationen afstand og væksthastighed blev beregnet ved MATLAB polyfit funktion. Fra dette blev den gennemsnitlige celle forreste hastighed fundet at være 13,4 um / time (figur 3). Figur 4 viser den fluorescerende gradient etableret ved at placere en dextran gennemblødt agarose blok i den ene ende af kanalen og tillader dextran at diffundere gennem kanalen i 12 timer. En time-lapse billedet blev taget på hver time, og fluorescens på tværs af afstand kanalen blev målt og afbildet som vist i figur 4 og sammenlignet med en 1D diffusion model.
Figur 2: Cell Front Movement. Time-lapse billeder af cellen front i mikrokanalplade kammeret bevæger sig gennem kanalen. Cellen forreste markeret med appelsin linjer, og migrationen afstand er inkluderet. Denne migration afstand blev målt fra markeringen på pladen til forsiden af cellen foran som vist. En 1 mm skala bar er vist i hvidt. A) 48 timer efter udpladning, B) 72 timer efter udpladning, C) 96 timer efter udpladning, D) 120 timer efter udpladning. Klik her for at se en større version af dette tal.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 55.264 / 55264fig3.jpg "/>
Figur 3: Vækst Rate Beregning. Cell forreste bevægelse spores med time-lapse billeder. Vækst blev beregnet ved hjælp af Matlab polyfit funktion (roipoly) for at give gennemsnitlige celle foran hastighed på 13,4 um / t. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescent Gradient med dextran. Fluorescensintensitet målt over afstanden af den kanal, hvor hver linje repræsenterer gradient ved en bestemt time. ImageJ blev anvendt til beregning af fluorescensintensiteten. Dette kan gøres ved hjælp af analyse | Måleværktøjet. Først skal du vælge Set Målinger under Analyser, og vælg intensitet. Vælg derefter foranstaltning Analyser for at få avevrede pixel intensitet. Dette kan plottes som funktion af afstanden i mikron, som vist i denne figur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores mikrokanalplade kammer kan anvendes til en lang række formål, herunder bestemmelse af vandringshastigheden celle som reaktion på vækstfaktorer og kemoattraktanter og måle diffusionshastigheden af et lægemiddel fra en polymermatrix. Det er muligt at anvende vores mikrokanalplade kammer til at vokse celler og placere en kemoattraktant i den ene ende af kammeret. Cellerne vokser som reaktion på kemoattraktanten, og migrationen celle kan kvantificeres ved at tage time-lapse billeder, der kan analyseres for at bestemme den celle vandringshastigheden. Repræsentative resultater af denne fremgangsmåde er vist i figur 3, hvor vækstraten blev bestemt til at være 13,4 um / h under anvendelse af MATLAB polyfit funktion.
En anden brug af vores mikrokanalplade kammer er at måle diffusionshastigheden af et lægemiddel ud af en polymer matrix. En fluorescens mærkede dextran af en lignende molekylvægt for lægemidlet af interesse kan bruges til at modellere diffusionen af DRUg af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at prøverne skal håndteres forsigtigt, da en stor mængde konvektion vil forstyrre forløbet. De repræsentative resultater af denne fremgangsmåde er vist i figur 4. En fordel ved denne model i sammenligning med Boyden kammer assay er, at det er mere anvendelig til adhærente celletyper grund af den flade overflade; henviser til, at skal cellerne falder gennem et lille rør i Boyden kammer før klæbe. En anden begrænsning af Boyden kammer assay er, at det er en endpoint assay; således, kemotaxi kan ikke observeres visuelt. I modsætning hertil med vores metode, er kemotaksi observeret gennem de time-lapse billeder 9. Anvendelsen af mikropipetter indeholdende kemoattraktanter er også blevet anvendt en fremgangsmåde til at observere cellemigrering. Men den største ulempe ved denne metode er lille produktion 10. Dunn kemotaksi kammer er en anden assay, der anvendes i forbindelse med time-lapse billeddannelse lignende the metode beskrevet her 11, 12. Kammeret består af to koncentriske cirkler skåret på forsiden af objektglasset for at skabe en indre og ydre brønd, og en bro adskiller de to brønde. Kemoattraktanten anbringes i den ydre brønd, og cellerne får lov til at migrere fra den indre brønd til den ydre brønd. Denne migrering kvantificeres ved anvendelse time-lapse billeder, der er analyseret under anvendelse af billedanalysesoftware. Svarende til Boyden assay en af begrænsningerne af Dunn kammerets assayet er, at det ikke let kan modificeres til at oprette tilpassede opløselige faktor koncentrationsgradienter.
En anden simpel teknik til vurdering cellemigrering er en in vitro ridse 13. Denne metode er hurtig og billig, da den kun kræver skabe en ridse i cellemonolaget og indfangning af time-lapse billeder af cellemigrering tæt på den tidligere oprettede bunden. HowevEr, den store ulempe ved denne fremgangsmåde er, at den ikke er egnet til at måle respons på en kemisk faktor koncentrationsgradient. Vores metode giver mulighed for at skabe en kemisk gradient og kvantificere celle migration i forhold til den kemiske gradient. Vores metode kan kombineres med skrabe metoden som en ridse kan oprettes i cellemonolaget, mens en kemotaktisk faktor er til stede i en af brøndene i mikrokanalplade kammer. Dette giver mulighed for kvantificering og modellering af sårheling. En anden potentiel anvendelse af vores enhed er at bestemme reaktion af cancerceller til midler, der hæmmer cellevækst.
Andre mikrofluidik baserede systemer har også været anvendt for celle migrationsundersøgelser 14, 15. Disse undersøgelser udnytter litografiske teknikker med rene værelser til at skabe master-forme i silikone og / eller laser bearbejdning at skabe mikrofluid kanaler i silicium wafers. Silicon wafer mikro bearbejdning kan være dyrt i forhold til vores metode, der udnytter billigere materialer (PDMS og acryl) at fremstille en mikrokanalplade kammer. Vores enhed overvinder begrænsning af andre PDMS baserede mikrofluidenheder, hvor det ikke var muligt at skabe små 3D kanaler 15. Med vores metode, har vi med succes skabt PDMS baseret enhed med kanaler med lille diameter. Andre studier har anvendt en PDMS-baserede mikrofluidanordning med to lag af mikrokanaler og en multi-kanal gas mixer, der er computerstyret for at skabe vilkårlige gradienter af oxygen for at studere migrationen af celler under forskellige gradienter af oxygen 16. Der er potentiale for vores udstyr kan anvendes på en lignende måde med tilføjelsen af en gas blandekammer i den ene ende af mikrokanalplade kammeret.
Mikrofluidenheder er ofte lavet med bløde litografiske teknikker; disse kan tilpasses til at skabe cellemigrering chambers. Disse metoder involverer udskrive en maske med kanal mønstre med Computer Aided Design (CAD). Disse masker er derefter projiceret på en master støbeform belagt med en lysfølsom modstand gennem optisk litografi. Efter master Formen er fremstillet, er PDMS hældes på master og fik lov til at hærde for at skabe en PDMS støbeform, der kan anvendes til mikrofluide studier 17, 18, 19. Kemotiltrækkende eller chemorepulsive forbindelser anbringes i kammeret i høj koncentration i et af reservoirerne til at skabe gradienter 17. Mens disse teknikker ligner vores opsætning, kan de være dyre på grund af de høje omkostninger ved at skabe master støbeform til systemet og anvendelse af renrum. Desuden kan disse metoder være svært for eleverne at lære i en klasse baseret indstilling. Indsatserne, der anvendes i vores set-up for at skabe kanalerne kan oprettes med en række forskellige metoder, herunder 3D-PRinting og laserskæring. Således er vores system giver mulighed for etablering af en bred vifte af forme til relativt lave omkostninger især da 3D-print bliver mere overkommelige og bredt tilgængelige.
PDMS baseret mikrofluidenheder til måling cellemigrering og vækst er blevet anvendt til en lang række applikationer. For eksempel, i neuroscience forskningsundersøgelser 20, indretninger blev fremstillet ved anvendelse af bløde litografiteknikker, hvor PDMS komponent blev anbragt på en vævskulturskål eller glas for at danne to rum, der var adskilt af en fysisk barriere med mikrometerstore riller for at tillade neuroner til at vokse på tværs af rum. Time-lapse billeder blev taget for at vise neuroner krydser barrieren. Fremgangsmåden til micropatterning anvendes til at fremstille denne enhed er kompleks, mens produktionsmetoden for vores enhed er enkel og kan anvendes af forskere på alle niveauer. En anden undersøgelse bruges også en nem billig metode til fremstilling af en siMilar PDMS mikrofluid enhed ved hjælp af en master støbeform skabt af tape for at skabe et indtryk i de PDMS til at producere mikrokanaler. En fordel ved vores tilgang over beskrevet i denne metode er, at kanalerne i vores metode er fremstillet i ét trin, mens denne protokol kræver adhæsion mellem to PDMS lag, som skaber problemer med mediestrøm til cellerne 21.
Afslutningsvis vores mikrokanalplade kammer metode kan tilpasses og kan anvendes til at opnå forskellige resultater. Metoden giver mulighed for at skabe en koncentrationsgradient for at passe til brugerens behov. Desuden er vores enhed tilbyder en fordel i forhold til eksisterende indretninger på grund af sin relativt lave omkostninger og brugervenlighed for forskere på alle niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Clemson University Creative Inquiry program og NSF CBET1254609 for at yde støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
