Abstract
태반은 배아 발생 동안 처음 개발 기관이며, 배아의 생존을 위해 필요하다. 태반이 착상 전 배반포의 여분의 배아 trophectoderm 세포로부터 분화 다양한 융모 세포로 구성되어 있습니다. 이와 같이, 인간 태반의 초기 분화 이벤트에 대한 우리의 이해 때문에 인간 배아의 분리 및 조작에 대한 윤리적, 법적 제한으로 제한됩니다. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 인간 발달을 조사하기위한 견고한 모델 시스템이며 또한 다양한 영양막 세포 유형의 마커를 발현 융모 세포로 생체 외에서 분화 될 수있다. 여기서, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 (4) 및 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 저해제를 사용하여 세포 내로 융모 hPSCs를 구별하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜 된 siRNA로 형질 감염 될 수있는 다양한 영양막 세포 유형을 생성손실의 기능 표현형을 조사 또는 병원균에 감염 될 수있다합니다. 또한, hPSCs는 유전자 변형 될 수 있고, 당시의 기능 이득 분석을 위해 영양막 세포의 전구 세포로 분화. hPSCs부터 인간 trophoblasts를 발생이 체외 분화 방법은 초기 인간 배아 작업의 윤리적 법적 제한을 극복하고,이 시스템은 약물 발견 및 줄기 세포 연구를 포함한 다양한 용도에 사용될 수있다.
Introduction
태반은 임신 중 태아의 성장과 생존에 필요한 산모와 태아 순환 사이의 가스, 영양소, 노폐물, 호르몬의 교환을 용이하게한다. 포유류 배아 발생 동안 형성된 제 기관 6-7 일을 인간 임신 후 생쥐 1, 2, 3, 4 일 3.5-4.5 개발 시작 태반이다. 융모 세포는 태반의 가장 중요한 세포이며, 이러한 세포는 포유 동물 배아의 초기 계통 분화 이벤트 중 하나를 나타낸다. 그들은 착상 전 배반포의 외부 여분의 배아 trophectoderm 세포에서 발생한다. 태반 개발 초기 단계의 우리의 지식은 초기 인간 발달을 모델링에 대한 윤리적, 물류 제한에 의해 제한된다.
배아 이식, trophoblasts 중임산부 상피 세포를 침공하고 전문 전구 세포 (5)로 분화. Cytotrophoblasts (CTBS)의 융합 및 syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous 침입 trophoblasts (EVTs)로 분화, 미분화 전구 세포를 단핵하는 앵커 자궁 태반을. 않은 SYN은 임신 유지에 필요한 호르몬을 합성 말기 분화 세포를 다핵 있습니다. 융모 세포에 손상이 유산, 전자 간증, 자궁 내 성장 제한 한 결과로 EVTs 및 않은 SYN을 생성 초기 분화 이벤트는, 태반 형성에 필수적이다. 개발 된 인간 영양막 세포주의 종류 CTBS 태반 호르몬 및 디스플레이 속성 침습 6 생산 융모 상피암를 불멸화 포함한다. 인간의 첫 번째 임신의 태반에서 차 융모 세포는 고립하지만, 세포 빨리 DIF 할 수 있습니다ferentiate 및 체외에서 증식 중지합니다. 중요한 변형 일차 세포주는 종양 및 영양막 불멸화 세포주 정확하게 차 trophoblasts 7 표현되지 않을 수 있음을 나타내는 다른 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 또한,이 라인은이 세 번째 학기를 통해 첫 번째 이후의 단계에서 파생되기 때문에 태반의 영양막 세포 줄기 세포 전구 세포를 닮은 않을 것이다.
태반의 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 초기 단계 인간 trophoblasts의 체외 배양 시스템에서 강력한 필요성이있다. 착상 전 배아의 내부 세포괴와 속성을 공유하는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)은, 종종 조기 태반의 형성을 포함한 초기 인간 현상을 모델링하기 위해 사용된다. 두 사람의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 hESCs는 뼈 모르를 사용하여 체외에서 trophoblasts로 분화 될 수있다phogenic 단백질 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4을 이용한 융모 세포로 다 능성 세포의 이러한 변환은 인간 세포에 특이하고 초기 인간 배아 구 (16)에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 널리 초기 인간 태반의 개발을 연구하는데 사용된다. 최근에는 발견되었다는 억제제의 첨가 A83-01 (A) 및 된 Smad2 / 3, MEK1 / 2의 신호 전달 경로를 차단 PD173074 (P)는, trophectoderm 같은 조상 주로 않은 SYN으로 hPSC 분화의 효율을 증대 및 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포 9, 17의 광범위한 세대가없는 EVTs, 시험 관내 모델 시스템 (9), (11)의 유효성을지지 차별화. 여기서는 BMP4 / A / P 배지를 이용하여 인간 전구 세포 영양막에 hPSCs의 생체 외 분화에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 조건은 리포 펙션 - 매개 형질 전환을 사용하여 RNA 서열, 유전자 파괴 된 siRNA를 이용하여, 병원체 감염, 유전 적 변형을 포함한 다양한 애플리케이션에 세포 과잉수 생산.
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Protocol
참고 : 영양막 세포의 전구 세포에 하나 hESCs는 또는 hiPSCs의 분화를 들어, 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 성장 hPSCs는 BMP4 / A / P와 분화를 시작하기 전에이 구절에 대한 조건없는 공급기로 전환된다. 이 과정은 분화 된 세포의 MEF 오염을 제거한다. 여기서는 hESC의 분화를위한 프로토콜을 제공하고, 동일한 프로토콜 hiPSCs에 적용될 수있다.
1. 문화 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포에 hESCs는의 복구 (MEFs에) (준비)
- MEFs에의 감마 조사
- 10 % FBS, 2 mM L- 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)를 DMEM, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA) 다음 MEFs에 배양 용 배지 500 mL로.
- 기본 MEFs에 하나 바이알을 해동하고, 세포를 배양 MEF 매체를 사용한다. MEF 문화 매체를 이용하여 30 판에 기본 MEFs에를 확장합니다.
주 : 산소 농도가이 단계에 대한 중요하지, 그래서어느 인큐베이터 내에서 4 % 생리 또는 주위 (20 %)의 조건을 사용할 수있다. - MEFs에 수확. 플레이트로부터 제거하고 MEFs에 원추형 튜브에 세포를 전송하기 위해 0.25 % 트립신을 사용한다. 조사 악기로 MEFs에 배치하고 3,500 회색에 세포를 노출합니다.
주 : 시간의 양이 조사부 부 내부 소스의 활성에 의존 할 것이다. - MEF 배양액을 조사 MEFs에 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산.
- 원심 분리기를 이용하여 펠렛 MEFs에 50 % MEF 배지 및 배지 (80 % FBS와 20 % MEF 배지)를 50 % 동결 세포를 추가한다. 나누어지는 유리 병 당 1 × 10 6 세포.
- 하룻밤 -80 ° C 냉장고에 조사 MEF 튜브를 배치하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송.
- 문화 냉동 MEFs에와 hESCs는 해동
- hESC의 매체의 500 ml의 확인 : DMEM을 / F-12와 20 % 혈청 REPLAC장담, 0.1 mM의 NEAA, 2 mM의 L 글루타민, 10 NG / ㎖의 bFGF, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올 및 1X 펜 / 패 혈성.
- hESCs는 해동 전에 MEFs에 1 일 한 병을 녹여. 코트 각 웰에 1 ml의를 사용하여 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트. 실온에서 적어도 20 분 동안 배양 한 다음, 젤라틴을 제거한다.
- 액체 질소 저장에서 MEFs에의 병을 제거하고 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 담그지. 단지 작은 얼음 결정이 남아 간헐적 때까지 병을보세요. 신속 15ml의 원뿔형 튜브 내부 MEF 배지 9 ml의 바이알의 내용물을 옮긴다.
- 5 분 동안 200 × g으로 원심 분리하여 세포 펠렛. 뜨는을 기음과 MEF 매체에서 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트에 균등하게 MEFs에 나누어지는. 하룻밤 37 ℃로 낮은 산소 (4 %) 배양기에 플레이트를 넣습니다.
- MEFs에에 hESCs는의 일상 문화
- 액체 질소에서 hESC의 유리 병을 제거하고 신속하게 3를 사용하여 병을 해동7 ° C의 물을 욕조. 조심스럽게 hESC의 매체의 9 ml의를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 hESCs는 피펫 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 배지를 제거하고 hESC의 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁.
- 단계 1.2.4에서 제조 된 판에서 MEF 매체를 기음과 hESC의 배지 1 ㎖를 추가합니다. hESC의 매체에 바위 억제제 Y-27632 (10 μM)를 추가합니다. MEFs에 상 hESCs는을 전송합니다.
- 하룻밤 37 ° C 낮은 산소 (4 %) 인큐베이터로 세포를 놓습니다. 매일 hESC의 매체를 교체합니다. 4 배에서 직립 현미경으로 시각화 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어.
- 통로 hESCs는 모든 4-6일, 세포 생장 및 hESC의 콜로니의 크기에 따라. 계대 전날 MEFs에 접시를 준비합니다. 세포가 통과 할 준비가되면, hESC의 매체를 제거하고 PBS 1 ㎖로 잘 씻는다.
- 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제를 추가 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ℃에서 배양하고, 콜라게나 제를 제거합니다. WPBS로 세포를 웰 당 화산재 hESC의 배지 1 mL를 넣고 5 ㎖ 수동 피펫의 끝을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어. 새로운 MEF 코팅 잘 (들)에 일시 중단 된 세포 덩어리를 전송합니다.
MEFs에에서 hESCs는 2. 전환은 공급없이하는 세포 외 매트릭스 코팅 된 플레이트에 조건을
- 준비 MEF 중간 (CM)를 금연실
- 90~100%의 포화 상태에서 T75 플라스크에 조사 MEFs에 플레이트; 치밀 MEFs에 도금하는 것이 중요하다. 들이 플라스크의 바닥에 부착 여부를 결정하기 위해 현미경을 사용하여 세포를 관찰 (MEFs에 도금 또는 다음날 약 6 시간 후에 부착).
참고 : 현미경을 사용하여 관찰 할 때 붙어 있지 않은 세포가 중간에 떠. 다음 날, MEF 매체를 제거하고 B-FGF가없는 hESC의 매체의 25ml를 추가합니다. - 배양 24 시간 후 조정 배지를 수집합니다. 십이일의 최대 매일 새로운 배지로 교체하십시오. 0.22 μM 필터를 사용하여 수집 된 CM 필터. 앞서, 사용하는 CM에 신선한 B-FGF를 추가합니다.
참고 : CM은 -80 ° C에서 냉동 1 년까지 저장할 수 있습니다. 또한, 2 주 4 ° C에서 CM을 저장합니다.
- 90~100%의 포화 상태에서 T75 플라스크에 조사 MEFs에 플레이트; 치밀 MEFs에 도금하는 것이 중요하다. 들이 플라스크의 바닥에 부착 여부를 결정하기 위해 현미경을 사용하여 세포를 관찰 (MEFs에 도금 또는 다음날 약 6 시간 후에 부착).
- 전환 MEFs에에 문화에서 hESCs는이 피더 무료로하는 세포 외 기질 코팅 플레이트.
- 코팅 조직 배양 플레이트에 대한 세포 외 매트릭스의 제조
- 얼음에 세포 외 기질의 분취 량 (약 3 ~ 4 시간)을 해동. 얼음처럼 차가운 팁, 일, 차가운 50 ML 원뿔 튜브 및 DMEM / F12 매체, 전송 얼음처럼 차가운 DMEM 24 ml의에 세포 외 기질의 2 mg의 사용 / F-12 (희석는 공급 업체에서 세포 외 기질 농도에 따라 달라집니다 ).
- 즉시 얼음에 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 전송하고 4 ℃에서 보관합니다. 코팅 조직 배양 플레이트의 웰에 희석 된 세포 외 기질의 적당량을 추가 (예컨대, 6 웰 플레이트에 웰 당 1 mL) 중. 코팅 플레이트 소용돌이 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
- B-FGF (10 NG / ㎖)를 함유하는 CM을 사용 MEFs에 발 (단계 1.3)을 통과 hESCs는.
- 대기음은 새로운 판에서 세포 외 기질을 제거하고 B-FGF를 포함하는 CM을 추가 할 수 있습니다. 피펫을 사용하여 MEF 플레이트에서 긁어 세포 덩어리를 전송하고 세포 외 기질 코팅 된 플레이트로 나누어지는. 밤새 37 ℃로 저산소 배양기에서 품어.
- 매일 B-FGF 매체와 CM 교체; 매체의 크기는 배양 플라스크의 크기에 의존 할 것이다. 한 6 잘 잘위한 매체 2 ㎖를 사용합니다. 파스퇴르 피펫으로 차별화 된 세포를 긁어.
- 통로 hESCs는 현미경으로 볼 때 식민지가 밝은 모든 6~7일.
참고 : 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 hESC의 식민지가 MEF-배양 된 세포보다 큰 성장한다. - 공급 장치가없는 세포가 통과 할 준비가되면, 광고에 의해 세척, 매체를 제거PBS를 제거하기 위해 피펫, 기음을 사용하여 PBS의 땡 1 ㎖를 추가, 0.5 ㎎ / ㎖ 디스 파제 피펫으로 (37 ° C로 미리 예열), 5 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 잘 당 PBS 2 ㎖를 추가하고 나중에 흡입에 의해 PBS로 세포를 씻으십시오. 물론 당 CM의 1 ML을 추가하고 수동 5 ml를 피펫의 팁을 사용하여 작은 덩어리로 세포를 긁어.
- 새로운 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 일시 중단 된 세포 덩어리 플레이트; 세포는 24 시간 후 준수해야합니다.
- 코팅 조직 배양 플레이트에 대한 세포 외 매트릭스의 제조
BMP4 / A / P를 사용하여 hESCs는 3. 차별화
- 분화 매체를 준비합니다. 사용 CM은 (B-FGF 결여)와 추가 (신선한) BMP4 (50 NG / ㎖) A83-01 (1 μM), 및 PD173074 (0.1 μM). 사용하기 전에 CM 이러한 억제제를 추가합니다.
- 4 % 산소로 설정 인큐베이터 내 배양 한 통과를 위해 세포 외 기질 코팅 된 플레이트에 성장 공급 장치가없는 hESCs는을 사용합니다. 세포 외 기질 코팅 된 플레이트 상에 제 1 통로 후,세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 다음 날, 분화를 시작합니다. (B-FGF를 포함) 형상을 제거하고 BMP4 / A / P (6 웰 플레이트에 웰 당 2 ml)에 포함 된 CM로 교체합니다. 4 %의 산소 농도를 이용하여 세포를 배양 계속.
- BMP4 / A / P를 포함하는 CM (2 ㎖ / 잘위한 6 웰 플레이트) 2 일마다 교체합니다. 대기음은 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새 CM을 추가 할 수 있습니다. B-FGF (고려 차별화 하루 2) BMP4을 추가 및 제거에 이어 두 번째 날에, 세포 형태는 현미경을 이용하여 관찰 할 때 더 큰 나타나는 변경됩니다.
참고 : 밝은 둥근 모서리를 보이는 미분화 세포는 존재하지 않습니다. - 원하는 시간 지점에서 세포를 수집합니다. 차별화 된 세포는 약 2 주 후에 분할 중단됩니다. 이 기간 동안 형질 세포 (다음 섹션 참조).
siRNA를 또는 플라스미드 DNA와 융모 세포의 4. 형질
- 형질 전환을위한 융모 세포를 준비
- MEFs에 그들을 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다.
- 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 % 컨 플루을 보장하는, 잘 / 새로운 판에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 세포 1을 분할합니다. 저산소 배양기에서 세포를 밤새 인큐베이션.
참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다. - 다음날, 분화 배지로 배지 교환 (CM 6 웰 플레이트 ㎖ / 웰 BMP4 / A / P를 함유하고 B-FGF 결여, 2를 이용). 흡인에 의해 기존의 매체를 제거하고 피펫을 사용하여 새로운 매체 (2 ml)에 전송합니다. 밤새 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)에 세포를 놓습니다.
- 원하는 시간 -까지 세포 분화(일 1과 14 사이)을 가리 킵니다. 트랜 스펙 션 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 Trypsinize. 젤라틴 코팅 플레이트 상에 원하는 컨 플루 (형질 감염 시약 프로토콜에 따라 다름)에 플레이트 (제거하는 20 분 및 흡인을위한 조직 배양 접시에 0.1 % 젤라틴 추가). (B-FGF가없는) BMP4 / A / P를 포함하는 CM을 추가하고 밤새 품어.
- 다음날, 세포에 신선한 차별화 매체를 추가 할 수 있습니다. siRNA와 형질 감염 시약을 사용하여 siRNA를 형질 감염. 플라스미드 DNA를 들어, 적절한 리포 펙 타민 시약을 사용한다.
- 각 형질 전환 시약에 기재 한 바와 같이 제품 프로토콜을 따르십시오. 저산소 배양기에서 밤새 셀, 셀의 각 웰 / 플레이트로 siRNA에 리포 펙 타민 단지 이동을 부드럽게 혼합하고 배양.
참고 : 일부 형질 전환 시약이 CM은 펜 / 연쇄상 구균이 부족 필요 항생제에 의해 억제된다. - 다음날, 신선한 분화 용지로 교체합니다.
- 욕망에서 세포를 수확(D) 타임 포인트 (예를 들면, 24 시간, 48 시간 및 72 시간)을 정량적 RT-PCR을 사용하여 유전자 파쇄 효율을 확인한다. 수확 셀, 웰 당 1 ml에 첨가하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양하고, 0.05 % 트립신을 사용한다. 트립신을 중화 잘 당 MEF 매체의 5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운하고 RNA의 분리를위한 세포 펠렛을 사용한다.
융모 세포의 5 병원체 감염 : 센다이 바이러스 성 감염
- 차별화 hESCs는 준비
- MEFs에의 전송 후 세포 외 기질에 두 구절에 대한 문화 hESCs는 (단계 2.2 참조). B-FGF를 포함 hESC의 매체를 사용합니다.
- 차별화 전에 새로운 세포 외 기질 플레이트 일일 위에 hESCs는 분할합니다. 다음날 적어도 50 %의 포화 상태를 확인하는 새로운 판 / 웰,에 1 : 높은 휴대 포화 상태가 중요하므로 분할 세포 1입니다. 저산소 배양기 (4 %의 산소)에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션. <BR /> 참고 : hESCs는이 단계에서 계산 할 필요가 없습니다.
- 다음 날, 낮은 산소 인큐베이터 (4 % 산소)의 분화 배지 (CM 포함 BMP4 / A / P 및 부족 B-FGF)과 하룻밤 문화 매체를 교체합니다.
- 융모 세포의 센다이 바이러스 감염
- 어느 날 원하는 차별화 하루 전에 5 분 동안 0.05 % 트립신을 사용하여 (단일 세포) 분화 세포를 Trypsinize 및 젤라틴 코팅 플레이트로 전송. 차별화 매체를 추가하고 저산소 배양기에서 하룻밤 품어.
- 다음날, (이 바이러스에 따라 달라집니다) 감염 매체를 추가합니다. 6 웰 플레이트 잘 하나 0.5 ml에 사용 BMP4 / A / P를 포함하는 펜 / 연쇄상 구균이 결여 사용 CM. MOI는 저산소 배양기에서 8 시간 동안 1 품어을 = 센다이 바이러스를 추가합니다.
- 추가 시간 포인트가 필요한 경우, 4 시간 후 바이러스 함유 배지를 제거하고 BMP4 / A / P의 CM으로 대체. 세포를 수집RNA 분리하는 셀 스크레이퍼를 사용.
- 바이러스 반응 (18)에 관여하는 유전자에 대한 QRT-PCR을 수행하여 바이러스 감염의 효율성을 확인합니다.
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Representative Results
hPSCs의 체외 분화의 개요
이 체외 분화 프로토콜은 하나의 통로 (그림 1A)에 대한 조건없는 공급기로 전환하는 MEFs에 성장 미분화 hESCs는 시작됩니다. 우리는이 프로토콜에 hESCs는의 분화를 설명하는 동안, 우리는 성공적으로 융모 세포로 hiPSCs를 구별하기 위해이 프로토콜을 사용했다. 세포 외 매트릭스로의 전환은 인간 융모 성 세포의 순수 인구 요구 분석을위한 바람직하지 않다 조사 된 MEFs의 대부분을 제거한다. 미분화 hPSCs는 세포 외 기질에 성장 식민지가 계대 (약 1 주일)에 대한 준비가 될 때까지 CM은 B-FGF를 포함하는 배양한다. 이것은 BMP4 / A / P - 매개 분화를 유도하기 전에 능성 상태를 유지한다. 식민지는 ~의 덩어리로 50 ~ 100 세포를 파괴하는디스 파제를 이용하여 세포 외 기질 - 코팅 플레이트 상에 두 번 계대. 계대 후 날, 부착 세포는 분화를 유도 할 준비 및 배지 B-FGF 결여 BMP4 / A / P를 포함하도록 전환된다. 분화 된 세포는 세포 RNA 분리 수집 또는 형질 감염 실험에 사용할 수있는 시간 동안 약 2 주 동안 증식. 형태 학적 변화는 분화 후 1-2일 개시되었으며, 하나의 대표적인 실험 결과가도 1b에 도시되어 나타난다. 분화 일 1-2에 세포가 날 0 (그림 1B)에서 세포보다 크기가 큰 것을 알 수 있습니다. 분화 된 세포 식민지는 급속하게 성장하고,이 변화는 매일 눈에 띈다. 분화가 진행되면서, 세포 분열 및 바깥 쪽 방향으로 증가하고, 콜로니의 중심으로부터 확대 (도 1B를 일 3-5). 식민지의 바깥 부분은 t에 비해 큰 세포를 포함식민지의 중심에 그가 세포. 분화 세포는 세포 외 기질에 배양 된 다 능성 줄기 세포보다 어두운 및 평평하게; 루틴 세포 배양에 사용되는 직립 현미경으로 세포를 볼 때 셀의 밝기의 변화는 명백하다. 개별 식민지는 세포가 서로의 위에 성장과 분화의 날 (5) (그림 1B)에 의해 함께 병합합니다. 차별화 하루 4-5 후, 다수의 핵을 포함하는 셀 (그림 1B) 본 (도시하지 않음)입니다.
BMP4 / A / P는 영양막 세포 마커의 차별화 및 발현을 유도
우리는 정량적 RT-PCR (QRT-PCR)을 사용 BMP4 / A / P 분화 3 일 동안 유전자 발현의 변화를 조사 하였다. RNA는 분화 일 1, 2에 고립, 3과의 cDNA로 전환했다. 다 능성 줄기 세포의 소실 모두 B를 평가할 수있다Y 형태 시각적 현미경을 사용하고, QRT-PCR에 의해, 다 능성 유전자에 대한 프라이머를 사용. NANOG, 다 능성 줄기 세포 마커의 상대적인 발현 수준이 감소된다 ~ 75 % 세포 BMP4 배양하고, 레벨이 (BMP4 / A / P의 존재 ~ 90 %로 감소된다 분화 후 하루 그림 2). 차별화 하루 2, NANOG의 수준 (B-FGF를 포함) hESC의 CM 매체에 비해 BMP4 단독으로 또는 BMP4 / A / P에서의 배양 세포에 매우 낮다. 우리는 밝고 분화 된 세포에 비해 크기가 작은 분화 이일 (그림 1B), 후 미분화 세포를 관찰하지 않기 때문에 이것은 예상 된 결과입니다. KRT7 및 CDX2 : 융모 BMP4 세포 - 매개 분화의 효율은 직접 영양막 개의 마커에 특이적인 프라이머를 사용한 QRT-PCR에 의해 평가 될 수있다. 이 유전자는 모두 인간 다 능성 줄기로 표현되지 않습니다세포 및 BMP4 치료 2 ~ 3 일 후 발현 증가 (그림 2). 여기에 설명 된 조건을 사용하여, KRT7 사체 수준 (도 2) BMP4 / A / P 배지에서 분화 일 1 증가 및 분화의 처음 3 일 동안 일정하게 유지. 혼자 BMP4를 사용하여 KRT7 식 티빈 / 마디 억제제 hESCs는 9의 분화 속도를 증가한다는 이전의 관찰과 일치의 날 (2)에 의한 지연 증가가 있습니다. 이러한 억제제의 사용 효율을 평가하는 또 다른 방법은 단독 BMP4 처리 셀 및 CDX2 KRT7 성적 정상 풍부를 결정하는 것이다. 티빈 / 마디 억제제와 함께 혼자 BMP4 또는 BMP4를 사용하는 경우 CDX2 수준은 분화 일 1-3 비슷합니다. 그러나 KRT7 성적은 더 많은 제안이 억제제의 존재의 차별화 중 하나 일 이후에 더 풍부급속한 분화 (그림 2). CDX2 표현은 일반적으로 두 조건에 대한 차별화 2 일에 피크과 3 일 (그림 2) 후 감소한다. 예상대로 미분화 hESCs는이 KRT7 또는 CDX2 (그림 2)를 표현하지 않습니다. 결론적으로, BMP4 / A / P 조건 hESCs는 빠르게 분화 및 태반 마커 발현 빠르면 분화 일 3로서 검출 될 수있다.
체외에서 사용 된 siRNA와 플라스미드 DNA의 형질 감염 및 바이러스 성 감염은 융모 세포를 - 유래
시험 관내에서 유도 된 인간 융모 세포는 코딩 또는 비 암호화 RNA를 하나의 유전자 발현을 방해 된 siRNA로 형질 감염 될 수있다. 우리는 분화 일 1, 2 (siRNA를 75 pmol의 사용)의 siRNA 형질의 두 라운드를 실시, BMP4 / A / P를 사용하여 hESCs는의 분화를 시작및 RNA 분리를위한 세포를 모았다. 정량적 RT-PCR은 코딩 또는 비 암호화하는 유전자 중 하나에 대한 최저 효율을 결정하는 효과적인 방법이다. RNA lncRHOXF1 19 비 암호화 긴의 다른 지역에 대한 보완이 된 siRNA를 사용하여, 우리는 lncRHOXF1 성적 증명서 (그림 3A)의 80 % 최저를 획득했습니다. 다음으로, 우리는 또한 분화 일 1, 단백질 코딩 유전자 hnRNP U에 대해 하나의 siRNA (25 pmol의)를 형질 2. 우리는 두 개의 연속적인 형질을 다음 hnRNP U 성적의 80 % 감소를 관찰했다. 체외 분화 영양막의 전구 세포에도 선천성 면역 반응을 조사하는데 사용될 수있다. 우리는 센다이 바이러스를 사용하는 셀이 하나의 MOI로 분화 일의 감염을 수행 바이러스 배양 8 시간 후에 세포를 수집 하였다. QRT-PCR을 사용하여, 우리는 활성 바이러스 프로를 나타내는 감염된 세포 (그림 3B)에 풍부한 바이러스 성 단백질 성적 증명서 (SEV-NP)을 검출융모 세포에서 pagation. 중요한 것은, 감염된 세포 (MOI를 사용 = 1) 외관 변경 가능한 있습니다하지 않습니다 (데이터 도시하지 않음). 생체 유래 융모 상피 세포에서도 플라스미드 DNA로 형질 감염 될 수있다. 우리는 GFP 플라스미드를 사용하여 형질을 수행하고이 분화 1 일 및 3 일에 BMP4 / A / P-처리 된 세포로 구성하고 GFP 다음 날 (그림 4)에 대한 몇 군데 소개했다. 우리는 일반적으로 24 시간 이후 형질에 30 % ~ 50 %의 형질 전환 효율을 얻을. 결론적으로, 생체 유래 융모 세포 이득 - 및 기능 상실 실험에 사용될 수있다.
그림 1 : BMP4 / A / P를 사용하여 초기 융모 세포에 인간 다 능성 줄기 세포의 체외 분화. (A) BMP4 차별화의 도식 BMP4 / A / P를 사용하여 융모 세포에 hPSCs의. (B) BMP4 / A / P 분화 D0, D2, D6 및 HUES9 동안 셀의 대표적인 시야 이미지. 스케일 바 = 50 μm의. 화살촉은 분화되지 않은 단일 셀 hESCs는을 나타낸다. 화살표는 차별화 동안 형태 학적 특징을 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : BMP4 / A / P 차별화 신속하게 능성 마커 NANOG을 downregulates와 영양막 세포의 유전자 CDX2와 KRT7을 상향 조절. NANOG (만능 마커), CDX2, 및 KRT7 (영양막 세포 마커)에 대한 QRT-PCR 분석. 값은 세중의 측정에서 평균 있습니다. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 유전자 중단 및 체외 분화 된 인간 융모 세포에서 사용하는 바이러스 감염. (A) hESCs는의 QRT-PCR 분석 (HUES9) 차별화 된 후 RNA lncRHOXF1 (왼쪽) 또는 두 개의 연속 일 동안 단백질 코딩 유전자 hnRNP U (오른쪽) 비 암호화, 긴 특정 된 siRNA로 형질. 최저 효율 (KD)는 일반적 70~80%이며, 한 형질 감염 실험의 결과를 나타낸다. (B) 8 시간 동안 센다이 바이러스 감염 분화 2 일 융모 상피 세포의 센다이 바이러스 단백질 사체 QRT-PCR 분석 (MOI = 1). 오류 막대는 SEM을 나타낸다."http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 체외 차별화 된 인간 융모 세포에 소개 플라스미드 DNA. 분화 일 1 일 3 trophectoderm의 전구 세포에 GFP 플라스미드 DNA의 형질 다음 날 시각화. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 영양막 세포의 전구 세포로 hESCs는 차별화를위한 기본 단계를 제시했다. 이 프로토콜은 최근 융모 세포의 분화를 증가시키고 통상적 BMP4 단독 치료로 관찰 중배엽 전구 세포의 생성을 방지 빠르게 티빈 / 노달 시그널링 억제제의 추가 hESCs는 차별화하기 위해 최적화되었다. BMP4 모델 시스템은 인간의 영양막 세포 계보 사양 및 확장의 초기 단계의 시험을 허용한다. 또한,이 BMP4 모델 시스템은 융모막 암종 세포주 및 extravillous 영양막 세포주를 사용 불가능 특정 하위 계통에 융모 세포의 분화를 조사하는데 유용하다. 생체 유래 융모 상피 세포에서 siRNA를도 19을 사용하여 기능 상실 실험에 사용될 수있다. 또한, hESCs는 또는 hiPSCs 유전자 transgen의 유도 발현을 수정할 수 있습니다 ES 19 내인성 유전자좌 20 리포터 유전자의 삽입을 위해, 이들 세포는 여기에 설명 된 조건을 사용하여 융모 상피 세포로 분화 될 수있다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
hESCs는에서 융모 전구 세포를 얻기 위해 CM 차별화 매체로부터 B-FGF (FGF2)를 생략 필수적이다. 배양 배지 내 BMP4 함께 B-FGF의 존재는 중배엽 및 내배엽 전구 세포 (16)의 발현을 향상시킨다. 영양막 세포 분화 배지에서 B-FGF의 포함은 최근 연구 BMP4 매개 차별화 대신 trophoblasts (21)의 중배엽과 내배엽 세포를 생성하는 것으로 나타났습니다 이유를 설명하는 것으로 생각된다. 함께 티빈 A와 BMP4와 B-FGF는 내배엽과 중배엽 차별화는 용량 의존적 방식으로 22 추진하고 있음은 잘 설립S = "외부 참조"> 23. 마우스에서, 상기 epiblast, trophectoderm의 개발, 원시적 인 내배엽 계통은 FGF 신호 경로 (24)에 따라 달라집니다. BMP4 분화가 21 일 (25)을 유도하기 위해 사용될 때 hESCs는 분화에서 B-FGF 유도 시그널링 중배엽의 형성에 필요하다. 대조적으로, BMP4와 함께 모두 FGF와 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 억제는 hESC의 유래 영양막 세포의 전구 세포에 SYN 형성을 선호하고 중배엽과 내배엽 원시 조상 (26)의 형성을 방지 할 수 있습니다.
기술의 한계
영양막 세포의 전구 세포에 hPSC 차별화의이 프로토콜과 함께 가장 일반적인 문제는 MEFs에에 hESCs는 또는 hiPSCs의 주로 미분화 인구 시작과 연결됩니다. hPSCs 모두 내측 및 외측 가장자리는 분화 세포를 축적하기 때문에콜로니, 매일 분화의 양을 모니터링하고 분화 된 콜로니 (또는 콜로니의 부분)을 제거하는 것이 중요하다. 분화 세포의 존재는 세포 외 기질로 전송 특히, 분화 프로세스를 복잡하게 할 수있다. 분화 된 세포는 빠르게 CM의 존재의 세포 외 기질에 확산되며,이 세포는 빠르게 문화를 인수하고 hPSCs를 밖으로하는-경쟁 할 것이다. 따라서, 세포 외 매트릭스와 세포를 전송하기 전에 MEFs에 성장 hPSCs 건강 분화 콜로니로 시작하는 것이 이상적이다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
분화 프로토콜을 사용하는 경우, 생성 전구 세포 영양막 세포 종류의 균질 혼합물이다. Trophoblasts은 융모 cytotrophoblasts, syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous cytotrophoblasts 구성되어 있습니다(EVTs) 27. 융모 cytotrophoblasts는 EVTs 및 않은 SYN을 생성하는 전구 세포이다. BMP4 차별화 된 hPSCs는 태반 특정 마커 유전자 또는 단백질 발현에 의해 정의 된 융모 cytotrophoblasts, 않은 SYN 및 EVTs 9, 15,의 혼합물을 생성합니다. 별개의 분화 경로는 HLA-G의 분비 (EVTs의 특성) 또는 (않은 SYN)에서 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (28), (29)에 의해 구별 될 수있다. 최근에는 결절 티빈 / 시그널링의 저해 hESCs는 EVT에서 분화를 선호하고,이 억제의 제거가 SYN 17 분화를 선호하는 것이 밝혀졌다. 사실, 이전 간행물은 hESCs는 차별화 혼자 BMP4를 사용하여 SYN 세포를 26 주로 생성하는 것으로 나타났습니다. BMP4 / A / P 및 조절 매체 (B-FGF 결여)를 사용하여 데이터를 나타내고있다EVT과 분화의 날 (5) 순수한 EVT 또는 SYN 인구가 EVTs의 분리를 위해 구슬에 접합 등의 HLA-G와 같은 세포 표면 마커를 사용하여, 추가 정제를 원하는 경우, 29 수에 의해 본 SYN 세포 상표입니다. 결론적으로, 여기에 설명 된 배양 방법은 다양한 애플리케이션에 사용될 수 hPSCs에서 융모 세포 상당량 생성하는 효과적인 방법이다. 이 프로토콜은 EVTs 않은 SYN과 동시에 발생하기 때문에, 초기 인간 태반 검사에 적합한 모델 시스템이다. 이들 세포는 약물 발견 및 유전자 공학을 포함한 다양한 응용 분야에 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
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