Abstract
השליה היא האיבר הראשון לפתח במהלך embryogenesis ודרושה להישרדות של העובר המתפתח. השליה מורכבת תאים trophoblastic שונים המבדילים מתאי trophectoderm חוץ עובריים של הבלסטוציסט preimplantation. ככזה, את הבנתנו את אירועי הבידול המוקדמים של השליה האנושית מוגבלת בגלל מגבלות אתיות ומשפטיות על בידוד המניפולציה של עובר אנושי. תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) הם מערכת מודל חזקה לחקירת התפתחות אנושית והוא יכול גם להיות מובחן במבחנה לתאים trophoblastic מבטאי סמנים של סוגי תאי trophoblast השונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחנת hPSCs לתאי trophoblastic באמצעות עצם morphogenic חלבון 4 ומעכבים של מסלולי איתות Activin / קטרים. פרוטוקול זה מייצר סוגי תאים trophoblast שונים שיכולים להיות transfected עם siRNAsעל חקירת פנוטיפים הפסד של פונקציה או יכול להיות נגוע פתוגנים. בנוסף, hPSCs ניתן מהונדס גנטי ולאחר מכן מובחן לתוך אבות trophoblast עבור רווח של פונקצית המנתח. שיטת בידול במבחנה זו להפקה trophoblasts אדם החל hPSCs מתגברת על המגבלות האתיות ומשפטיות של עבודה עם עוברי אדם מוקדם, מערכת זו יכולה לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות מחקר בתאי גזע.
Introduction
השליה נדרשת לצמיחה וההישרדות של העובר במהלך הריון ומקלה על חילופי גזים, חומרים מזינים, פסולת, והורמונים בין זרימת יולדות ועוברת. העוגב הראשון נוצרו במהלך העובר יונקים הוא השליה, שמתחיל לפתח 6-7 ימים לאחר ההתעברות בבני אדם ובבעלי 3.5-4.5 ימים בעכברים 1, 2, 3, 4. תאי Trophoblastic הם התאים החשובים ביותר של השליה, ותאים אלה מייצגים אחד אירועי בידול שושלת המוקדמים של העובר היונק. הם נובעים מתאי trophectoderm חוץ עובריים החיצוני של הבלסטוציסט preimplantation. הידע שלנו בשלבים המוקדמים של פיתוח שליה הוא מוגבל על ידי מגבלות אתיות ולוגיסטיות על דוגמנות התפתחות אנושית מוקדם.
במהלך השתלה העוברית, trophoblastsלפלוש האפיתל האימהי להתמיין ובתאים מתמחים 5. Cytotrophoblasts (CTBs) הם mononucleated, אבות מובחן כי הפתיל להתמיין syncytiotrophoblasts (SYNs) ו trophoblasts פולשנית extravillous (ד ^), אשר עוגן השליה אל הרחם. SYNs הוא multinucleated, תאים מובחנים סופנים כי לסנתז הורמונים הכרחיים לקיום הריון. האירועים בידול מוקדם שיוצרים ד ^ ו SYNs הם מרכיב חיוני לייצור השליה, כמו ליקויי בתאים trophoblastic לגרום להפלה, רעלת הריון, ו -1 פיגור גדילה תוך רחמי. סוגי שורות תאים אנושיים trophoblast אשר פותחו כוללים הנציחו CTBs ו choriocarcinomas, אשר מייצר הורמוני השליה ומאפייני פולשנית תצוגה 6. תאי trophoblastic ראשית ממנהל השליות הראשון בטרימסטר אדם יכולים להיות מבודדים, אבל התאים במהירות DIFferentiate ולהפסיק מתרבים במבחנה. חשוב לציין, הפך שורות תאים ראשוניות יש פרופילי ביטוי גנים שונים, המציין כי שורות תאי trophoblast tumorigenic והנציחו לא יכולות לייצג במדויק העיקרי trophoblasts 7. בנוסף, שורות אלה צפויות להידמות אבות תאי גזע trophoblast השליה כי הם נגזרים בשלב מאוחר תחילה דרך הטרימסטר שלישי.
יש צורך חזק במערכת תרבות חוץ גופייה של trophoblasts אדם בשלב מוקדם על מנת ללמוד את האירועים הראשונים של היווצרות שליה ותפקוד. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר חולקים תכונות עם מסת התאים הפנימית של עובר preimplantation, משמשים לעתים קרובות מודל התפתחות אנושית מוקדם, כוללים ההיווצרות של השליה מוקדם. שני תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) ו hESCs ניתן להבדיל לתוך trophoblasts במבחנה באמצעות עצם מורחלבון 4 phogenic (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. מרה זו של תאי פלוריפוטנטיים לתאי trophoblastic באמצעות BMP4 היא ספציפית עבור תאים אנושיים והיא בשימוש נרחב כדי ללמוד על ההתפתחות של השליה האנושית מוקדם כי היא אינה דורשת גישה עוברית אדם מוקדם 9, 16. לאחרונה, התגלה כי תוספת של מעכבי A83-01 (א) ו PD173074 (P), אשר חוסמים את המסלולים SMAD2 / 3 ו MEK1 / 2 איתות, מגביר את היעילות של בידול hPSC לתוך אבות דמוי trophectoderm, בעיקר SYNs ו ד ^, ללא דור נרחב של המזודרם, האנדודרם, או תאים האאקטודרם 9, 17 במבחנת 9, 11. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידול במבחנה של hPSCs לתוך אבות trophoblast אדם באמצעות BMP4 / A / P בינוני תרבות. תנאים אלה לייצר מספר שופע של תאים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל רצף RNA, שיבוש הגן באמצעות siRNAs, זיהומים הפתוגן, ושינוי גנטי באמצעות transfection בתיווך lipofection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: לקבלת הבידול של או hESCs או hiPSCs לתוך אבות trophoblast, hPSCs גדל על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) הם יועברו אל מזין ללא תנאים לשני קטעים לפני ביצוע בידול עם BMP4 / A / P. תהליך זה מבטל את זיהום MEF של תאים מובחנים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידול hESC, ואותו פרוטוקול ניתן ליישם hiPSCs.
תרבות 1. ושחזור של hESCs על פיברובלסטים עכבר עובריים מוקרן (MEFs) (תכשירים)
- גמא-הקרנה של MEFs
- הפוך 500 מ"ל של מדיום עבור culturing MEFs: DMEM עם 10% FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), ו -0.1 מ"מ חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA).
- להפשיר בקבוקון אחד MEFs העיקרי ולהשתמש בינוני MEF עבור culturing התאים. הרחב את MEFs הראשוני ל -30 צלחות באמצעות מדיום תרבות MEF.
הערה: ריכוזי חמצן אינם קריטיים עבור שלב זה, כךאו פיזיולוגיים (4%) או הסביבה (20%) תנאים בתוך חממה ניתן להשתמש. - קציר MEFs. השתמש 0.25% טריפסין להסיר את MEFs מהצלחות ולהעביר את תאי צינור חרוטים. מניחים את MEFs לתוך מכשיר הקרנה ולחשוף את התאים 3,500 אפורים.
הערה: משך הזמן יהיה תלוי בפעילות של המקור בתוך יחידת irradiator. - Resuspend את MEFs מוקרן עם מדיום התרבות MEF ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
- גלולת MEFs באמצעות צנטריפוגות ולהוסיף בינוני תרבות MEF 50% ו -50% תא הקפאה בינוני (FBS 80% ובינוני תרבות MEF 20%). Aliquot 1 x 10 6 תאים לכל בקבוקון.
- מניח את בקבוקוני MEF מוקרנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן להעביר אותם בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
- מפשיר MEFs ו hESCs קפוא לתרבות
- הפוך 500 מ"ל של מדיום hESC: DMEM / F-12 עם 20% סרום Replacement, 0.1 מ"מ NEAA, 2 מ"מ L- גלוטמין, 10 ng / ml bFGF, 0.1 מ"מ SS-mercaptoethanol, ו 1x פן / סטרפטוקוקוס.
- להפשיר בקבוקון אחד של יום MEFs אחד לפני להפשרת hESCs. מעיל 6-גם צלחת עם ג'לטין 0.1%, באמצעות 1 מ"ל לכל היטב. דגירה של 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסר את הג'לטין.
- הסר בקבוקון של MEFs מהאחסון בחנקן נוזלי לטבול את הבקבוקון בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. צפה הבקבוקון לסירוגין עד להישאר גבישי קרח קטנים בלבד. העבר במהירות את תכולת הבקבוקון 9 מ"ל של מדיום MEF בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום MEF. Aliquot MEFs שווה לצלחת 6 באר. מכניס את הצלחת לתוך לילה 37 ° C חממה דל בחמצן (4%).
- תרבות לשגרת hESCs על MEFs
- הסר בקבוקון hESC מ חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר את הבקבוקון באמצעות 3באמבט מים 7 מעלות צלזיוס. בעדינות פיפטה hESCs לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום hESC ומסובב ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר הבינוני resuspend התאים עם 1 מ"ל של מדיום hESC.
- לשאוב את המדיום MEF מהצלחת מוכן בשלב 1.2.4 ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hESC. הוספת רוק מעכב Y-27632 (10 מיקרומטר) למדיום hESC. מעבירים את hESCs על MEFs.
- מניח את התאים לתוך 37 ° C חממה דל בחמצן (4%) לילה. החלף את המדיום hESC יומי. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר, דמיינו תחת מיקרוסקופ זקוף על 4X.
- מסדרון, hESCs כל 4-6 ימים, תלוי confluency התא ואת הגודל של מושבות hESC. הכינו צלחת של MEFs יום לפני passaging. כאשר התאים מוכנים למעבר, להסיר את המדיום hESC ולשטוף היטב עם 1 מ"ל של PBS.
- הוסף 1 מ"ג / מ"ל collagenase (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהסיר את collagenase. Wאפר את התאים עם PBS, להוסיף 1 מ"ל של מדיום hESC לכל היטב, באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ"ל. מעביר את גושי תאים המושעים לתוך MEF מצופה חדש היטב (הים).
מעבר 2. של hESCs מ MEFs מזין ללא תנאי על תאי מטריקס מצופה צלחות
- כן MEF אוויר הבינוני (CM)
- פלייט MEFs מוקרן בבקבוק T75 בבית 90-100% confluency; חשוב כי MEFs הם מצופה בצפיפות. שים את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לקבוע אם יש להם מצורף בתחתית של הבקבוק (MEFs לצרף כ -6 שעות לאחר ציפוי או למחרת).
הערה: תאים פנויים לצוף בטווח הבינוני כאשר נצפו באמצעות מיקרוסקופ. למחרת, להסיר בינוני MEF ולהוסיף 25 מ"ל של מדיום hESC חסר B-FGF. - אסוף המדיום מותנה לאחר 24 שעות של דגירה. חלף בינוני טרי מדי יום לכל היותר 12 ימים. סנן את CM שנאסף באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף B-FGF טרי CM.
הערה: CM אפשר להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס, לאחסן עד 1 שנה. לחלופין, לאחסן את CM על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות.
- פלייט MEFs מוקרן בבקבוק T75 בבית 90-100% confluency; חשוב כי MEFs הם מצופה בצפיפות. שים את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לקבוע אם יש להם מצורף בתחתית של הבקבוק (MEFs לצרף כ -6 שעות לאחר ציפוי או למחרת).
- תוכל להעביר את hESCs מתרבה על MEFs מזינה ללא צלחות מטריקס מצופית תאיות.
- הכנת תאי מטריקס עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי
- להפשיר aliquot של מטריקס על הקרח (כ 3-4 שעות). בעזרת הטיפים קר כקרח, צינור חרוטי אחד קר, 50 מ"ל, ובינוניים DMEM / F12, העברת 2 מ"ג של מטריקס ל -24 מ"ל של DMEM קר כקרח / F-12 (דילול תלויה בריכוז תאי מטריקס מהספק ).
- מיד להעביר את 50 מ"ל צינור חרוטי לקרח ולאחסן אותו ב 4 ° C. עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי, להוסיף את הכמות המתאימה של מטריקס בדילול אל הבאר (למשל, 1 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). מערבולת כדי לצפות את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה 1.
- hESCs קטע מתוך MEFs (כמו בשלב 1.3) באמצעות CM המכיל B-FGF (10 ng / ml).
- לשאוב להסיר את תאי מטריקס מהצלחת חדשה ולהוסיף CM המכיל B-FGF. מעביר את הגושים הסלולר מגורדים מצלחת MEF בעזרת פיפטה ו aliquot אותו לתוך צלחת מטריקס מצופה התאית. דגירה בחממה 37 ° C נמוך חמצן למשך הלילה.
- החזר את CM עם המדיום B-FGF יומי; בסך הבינוני יהיה תלוי בגודל של בקבוק התרבות. השתמש 2 מ"ל של מדיום עבור 6-היטב היטב אחד. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר.
- hESCs מעבר כל 6-7 ימים, כאשר מושבות בהירות כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ.
הערה: מושבות hESC גדלו על צלחות מצופות מטריקס לגדול מאשר תאי MEF-תרבותיים. - כאשר התאים ללא מזין מוכנים למעבר, להסיר את המדיום, לשטוף ידי מודעותדינג 1 מ"ל של PBS בעזרת פיפטה, לשאוב להסיר את PBS, להוסיף 0.5 מ"ג / מ"ל dispase (מחומם מראש ל -37 ° C) עם טפטפת, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- שוטפים את התאים עם PBS על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS לכל היטב aspirating לאחר מכן. הוסף 1 מ"ל של CM לכל היטב באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ"ל.
- פלייט גוש תאים מושעה לתוך צלחות מטריקס מצופית תאיות חדשות; התאים צריכים לדבוק לאחר 24 שעות.
- הכנת תאי מטריקס עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי
בידול 3. hESCs שימוש BMP4 / A / P
- הכן את מדיום הבידול. השתמש CM (חסר B-FGF) ולהוסיף (טרי) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 מיקרומטר), ו PD173074 (0.1 מיקרומטר). להוסיף מעכבים אלה אל CM לפני השימוש.
- השתמש hESCs מזין ללא גדל על צלחות מצופות תאי מטריקס עבור 1 מעבר, בתרבית בתוך להגדיר באינקובטור ב חמצן 4%. לאחר המעבר הראשון לצלחות מצופות תאי מטריקס,בואו התאים לצרף למשך 24 שעות. למחרת, ליזום בידול. הסר את CM (המכיל B-FGF) ולהחליפו CM המכיל BMP4 / A / P (2 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). המשך culturing התאים באמצעות רמות חמצן 4%.
- החזר את CM המכיל BMP4 / A / P (2 מיליליטר / גם צלחת 6-היטב) כל 2 ימים. לשאוב להסיר את המדיום הישן ולהוסיף CM חדש בעזרת פיפטה. ביום השני לאחר הוספת BMP4 והסרת B-FGF (יום בידול נחשב 2), מורפולוגיה התא תשתנה, המופיעה גדול יותר כאשר נצפה באמצעות מיקרוסקופ.
הערה: מובחן תאים, אשר תערוכה וקצוות מעוגלים בהירים, לא יהיו נוכחים. - איסוף תאים בזמן נקודות רצויות. תאים מובחנים יפסיקו חלוקה לאחר כ -2 שבועות. תאי Transfect במהלך פרק זמן זה (עיין בסעיף הבא).
4. Transfection של תאים Trophoblastic עם siRNAs או DNA פלסמיד
- כן תאי trophoblastic עבור transfection
- hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר העברתם מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF.
- פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשוב, כל כך לפצל את התאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר יבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי הלילה בחממה דל בחמצן.
הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה. - למחרת, להחליף את מדיום עם בינוני בידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסרי B-FGF, באמצעות 2 מ"ל / גם צלחת 6-היטב). הסר את המדיום הישן על ידי שאיפה ולהעביר את המדיום החדש (2 מ"ל) בעזרת פיפטה. מניח את תאי חממה דל בחמצן (חמצן 4%) הלילה.
- להבדיל בין התאים עד הזמן- הרצוילנקודה (בין בימים 1 ו -14). יום לפני transfection, trypsinize התאים באמצעות טריפסין 0.05% במשך 5 דקות. פלייט אותם confluency הרצוי (בהתאם לפרוטוקול מגיב transfection) לצלחת ג'לטין מצופה (להוסיף ג'לטין 0.1% לצלחת בתרבית רקמה למשך 20 דקות לשאוב להסיר). להוסיף CM המכיל BMP4 / A / P (חסר B-FGF) דגירה לילה.
- למחרת, להוסיף בינוני בידול טרי אל התאים. Transfect siRNAs באמצעות מגיב transfection siRNA. עבור DNA פלסמיד, השתמש מגיב lipofectamine מתאים.
- פעל על פי פרוטוקול המוצר כמתואר לכל מגיב transfection. מעביר את מתחמי lipofectamine siRNA היטב כל / צלחת של תאים, ומערבבים בעדינות, ותרבות תאי לילה חממה דל בחמצן.
הערה: חלק ריאגנטים transfection מעוכבים על ידי אנטיביוטיקה, אשר דורשת CM חסר פן / סטרפטוקוקוס. - למחרת, להחליף עם תקשורת בידול טריה.
- קציר התאים על הרצוןבזמן נקודות ד (למשל, 24 שעות, 48 שעות, ו -72 שעות) כדי לבדוק את היעילות שיבוש גנטי באמצעות RT-PCR כמותי. עבור תאים קציר, השתמש טריפסין 0.05%, הוספת 1 מ"ל לכל היטב דוגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ"ל של מדיום MEF לכל היטב כדי לנטרל את טריפסין. ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ולהשתמש התא גלולה עבור בידוד RNA.
זיהום פתוגן 5. של תאים Trophoblastic: זיהום ויראלי סנדאי
- כן hESCs לבידול
- hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר ההעברה מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF.
- פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשובים, כך פיצול תאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר תבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי לילה חממה דל בחמצן (חמצן 4%). <br /> הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה.
- למחרת, להחליף את המדיום עם בינוני הבידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסר B-FGF) ותרבות לילה חממה דל בחמצן (4% חמצן).
- זיהום ויראלי סנדאי של תאים trophoblastic
- יום אחד לפני יום בידול הרצוי, trypsinize התאים המבדילים (תאים בודדים) באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות ולהעבירם צלחת ג'לטין מצופה. הוסף בינוני בידול דגירת לילה חממה דל בחמצן.
- למחרת, להוסיף בינוני עבור זיהום (זה ישתנה בהתאם הנגיף). השתמש CM חסר פן / סטרפטוקוקוס המכיל BMP4 / A / P, באמצעות 0.5 מ"ל עבור אחד טוב של צלחת 6 באר. להוסיף וירוס סנדאי עבור משרד פנים = 1. דגירה עבור 8 שעות בתוך חממה דל בחמצן.
- אם-מועד לפי שעון נוסף נחוצים, להסיר את המדיום המכיל וירוס לאחר 4 שעות ולהחליפה BMP4 / A / P CM. איסוף תאיםעבור בידוד RNA באמצעות מגרד תא.
- לקבוע את היעילות של זיהום ויראלי על ידי ביצוע qRT-PCR עבור גנים המעורבים בתגובה ויראלי 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה כללית של במבחנה בידול של hPSCs
פרוטוקול בידול במבחנה זה מתחיל עם hESCs מובחן גדל על MEFs אשר יועבר אל מזין ללא תנאים למעבר אחד (איור 1 א). בעוד תיארנו את הבידול של hESCs בפרוטוקול זה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להבדיל hiPSCs בהצלחה לתאי trophoblastic. מעבר מטריקס מסיר את רוב MEFs המוקרן, אשר אינם רצויים עבור ניתוחים הדורשים אוכלוסיות טהורות של תאי trophoblastic אדם. hPSCs המובחן גדל על תאי מטריקס ותרבותי עם המכיל CM-FGF B עד המושבות מוכנות passaging (כשבוע). זה שומר על המדינה pluripotent לפני גרימת BMP4 / A / בידול בתיווך P. המושבות הם שיבשו לגושים של ~ 50-100 תאיםבאמצעות dispase ו passaged בשנית לצלחת מטריקס מצופה תאית. למחרת passaging, התאים החסידים מוכנים להשרות התמיינות, והמדיום מופעל להכיל BMP4 / A / P חסר B-FGF. תאי הבדיל להתרבות במשך כ 2 שבועות, במהלכן התאים ניתן לאסוף עבור בידוד RNA או המשמשים בניסויי transfection. שינויים מורפולוגיים להופיע 1-2 ימים לאחר הבידול כבר יזם, ותוצאות מניסוי נציג אחד מוצגות באיור 1B. שים לב כי תאים בימי בידול 1-2 הנם גדולים יותר מהתאים מהיום 0 (האיור 1B). מושבת תא הבדיל גדלה במהירות, ושינוי זה בולט מדי יום. במהלך ההתמיינות, התאים להתחלק להרחיב את ממרכז המושבה, גדל בכיוון החוצה (ימים 3-5; איור 1B). החלק החיצוני של המושבה מכיל תא גדול יותר לעומת tהוא התאים במרכז המושבה. התאים המבדילים להיות כהה יותר ושטוח יותר מאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבית על תאי מטריקס; השינויים בהירים תא הם יותר נראים לעין כאשר אתה מציג את התאים עם מיקרוסקופ זקוף משמש תרבית תאים שיגרתית. מושבות הפרט להתמזג יחד על ידי בידול יום 5 (איור 1 ב '), עם תאים גדלו על גב אחד את השני. לאחר יום בידול 4-5, תאים המכילים גרעינים רבים נוכחים (לא מוצג) (איור 1 ב).
BMP4 / A / P גורם בידול ביטוי של סמני Trophoblast
בדקנו שינויים בביטוי הגנים במהלך שלושת הימים הראשונים של בידול BMP4 / A / P באמצעות RT-PCR כמותי (qRT-PCR). RNA היה מבודד בבית ימים בידול 1, 2, ו -3 ועל המרה cDNA. היעלמותו של תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן להעריך הן בy מורפולוגיה, ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ, ועל ידי qRT-PCR, באמצעות פריימרים עבור גנים pluripotency. רמות הביטוי היחסיות של NANOG, סמן של תאי גזע פלוריפוטנטיים, הוא מופחת על ידי ~ 75% לאחר יום אחד של בידול כאשר תאים בתרבית עם BMP4, והרמות מופחתות על ידי ~ 90% בנוכחות BMP4 / A / P ( איור 2). על ידי בידול יום 2, רמות NANOG נמוכים מאוד עבור תאים בתרבית BMP4 לבד או BMP4 / A / P בהשוואה לאלו במדיום hESC CM (המכיל B-FGF). זוהי תוצאה צפויה, כי אנחנו לא שומרים תאים שלא עברו התמיינות לאחר יומיים של בידול (איור 1B), אשר הם בהירים קטנים יותר לעומת תאים מובחנים. היעילות של בידול בתיווך BMP4 לתאים trophoblastic ניתן להעריך באופן ישיר על ידי qRT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים עבור שני סמנים trophoblast: KRT7 ו Cdx2. שני גנים אלה אינם באים לידי ביטוי ב גזע אנושי pluripotentתאים, ומגבירה הביטוי שלהם לאחר 2-3 ימי טיפול BMP4 (איור 2). שימוש בתנאים המתוארים כאן, רמות תמליל KRT7 להגדיל ביום בידול 1 ב BMP4 / A / P בינוני נשארות קבוע במשך 3 הימים הראשונים של בידול (איור 2). יש KRT7 ביטוי בעת שימוש BMP4 לבד עלייה מאוחרת ביום 2, בהסכמה עם תצפיות קודמות כי Activin / מעכבי קטרים להגביר את קצב הבידול של 9 hESCs. דרך נוספת להעריך את היעילות של שימוש מעכבים אלה היא לקבוע את השפע היציב של תמלילי Cdx2 ו KRT7 בתאים שטופלו BMP4 לבד. רמות Cdx2 דומות במשך ימי בידול 1-3 בעת שימוש או BMP4 לבד או BMP4 יחד עם Activin / מעכבי קטרים. עם זאת, תמלילי KRT7 הם עשירים יותר לאחר יום אחד של בידול בנוכחות מעכבי אלה, דבר המרמז על יותרבידול מהיר (איור 2). ביטוי Cdx2 בדרך כלל מגיע לשיאן ביום בידול 2 עבור שני התנאים ומפחית לאחר יום 3 (איור 2). HESCs המובחן אינו מבטא גם KRT7 או Cdx2 (איור 2), כצפוי. לסיכום, BMP4 / A / תנאי P במהירות להבדיל hESCs, וביטוי סמן השליה ניתן לאתר מוקדם ככל יום בידול 3.
Transfections של siRNAs ו פלסמיד דנ"א זיהומים ויראלי שימוש במבחנה -derived תאים Trophoblastic
במבחנה שמקורם בתאי trophoblastic האדם ניתן transfected עם siRNAs לשבש את ביטוי הגנים או של קידוד או RNAs noncoding. יזמנו את הבידול של hESCs באמצעות BMP4 / A / P, ביצע שני סבבי transfections siRNA (באמצעות 75 pmol של siRNAs) בימים בידול 1 ו -2,ואסף התאים עבור בידוד RNA. RT-PCR כמותי היא שיטה יעילה כדי לקבוע את היעילות מציאה עבור קידוד או או גנים noncoding. השימוש בשתי siRNAs משלים באזורים שונים של זמן, noncoding RNA lncRHOXF1 19, השגנו מציאה 80% של תמלילי lncRHOXF1 (איור 3 א). בשלב הבא, אנחנו transfected siRNA אחד (25 pmol) עבור הגן המקודדים חלבונים hnRNP U, גם בימים בידול 1 ו -2 צפינו ירידה של 80% תמלילי hnRNP U בעקבות שני transfections רצופים. בשינה ובתאי trophoblast הבדיל במבחנה יכול לשמש גם כדי לחקור תגובות חיסון מולדות. ביצענו זיהומים של בידול יום 2 תאים באמצעות וירוס סנדאי ב משרד הפנים של 1 ואסף התאים לאחר 8 שעות של דגירה ויראלי. שימוש qRT-PCR, זיהינו תמלילי חלבון נגיפי בשפע (Sev-NP) בתאים נגועים (איור 3 ב), מעיד על פרו ויראלי פעילpagation בתאים trophoblastic. חשוב לציין, תאים נגועים (באמצעות משרד הפנים = 1) לא לשנות במראה הם קיימא (מידע לא מוצג). בתאים trophoblastic נגזר במבחנה ניתן transfected גם עם פלסמיד דנ"א. ביצענו transfections באמצעות פלסמיד GFP והציג זה לבנות לתוך BMP4 / A / תאים שטופלו P ביום בידול 1 ויום 3 צילמו עבור GFP למחרת (איור 4). אנחנו בדרך כלל מתקבלים יעילות transfection 30-50% ב 24 hr-transfection פוסט. לסיכום, בתאים trophoblastic נגזר במבחנה יכול להיות מנוצל עבור gain- וניסויים הפסד של פונקציה.
איור 1: In vitro התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לתאי trophoblastic מוקדם באמצעות BMP4 / A / P. (א) סכמטי של בידול BMP4 של hPSCs לתאים trophoblastic באמצעות BMP4 / A / P. (ב) תמונות בהירות שדה נציג של תאי HUES9 במהלך D0, D2, D6 של בידול BMP4 / A / P. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. ראשי החץ מציינים hESCs תא בודד כי אינם מובחנים זה מזה. החיצים להדגיש תכונות מורפולוגיות במהלך התמיינות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: BMP4 / A / בידול P במהירות downregulates NANOG pluripotency סמן upregulates Cdx2 גנים trophoblast ו KRT7. ניתוח qRT-PCR עבור NANOG (סמן pluripotency), Cdx2, ו KRT7 (סמנים trophoblast). הערכים הם ממוצעים ממהלכים בשלושה עותקים. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ג'ין שיבושים ואי זיהום ויראלי באמצעות בתאי trophoblastic אדם מובחן במבחנה. (א) qRT-PCR ניתוח של hESCs (HUES9) הבדיל ואז transfected עם siRNAs ספציפית ארוך, noncoding RNA lncRHOXF1 (משמאל) או הגן המקודדים חלבונים hnRNP U (מימין) במשך יומיים רצופים. יעילות המציאה (KD) היא בדרך כלל 70-80%, ואת התוצאות מניסוי transfection אחד מוצגות. (ב) qRT-PCR ניתוח לפרוטוקול חלבון נגיפי סנדאי של תאים trophoblastic בידול יום 2 נגוע בווירוס סנדאי (משרד הפנים = 1) במשך 8 שעות. הברים השגיאים לציין את SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: המבוא של פלסמיד דנ"א לתוך תאי trophoblastic אדם מובחנים במבחנה. Transfection של פלסמיד דנ"א GFP לתוך ובתאים trophectoderm בידול יום 1 ויום 3, דמיינו למחרת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצגנו את הצעדים הבסיסיים המבדילים hESCs לתוך אבות trophoblast. פרוטוקול זה ממוטב לאחרונה להבדיל hESCs במהירות בתוספת Activin / קטרי איתות מעכבים, הגדלת הבידול לתאי trophoblastic והימנעות ההדורה של אבות mesoderm, אשר הם נצפו בדרך כלל עם טיפול BMP4 לבד. מערכת מודל BMP4 מאפשרת לבחינה בשלבים המוקדמים ביותר של מפרט שושלת trophoblast אדם והתרחבות. בנוסף, מערכת מודל BMP4 זו שימושית גם על חקירת התמיינות של תאים trophoblastic אל שושלות משנה ספציפיות, דבר שאינו אפשרי באמצעות שורות תאים choriocarcinoma שורות תאים trophoblast extravillous. בתאים trophoblastic נגזר במבחנה יכול לשמש גם למטרות ניסויים הפסד של פונקציה באמצעות siRNAs 19. בנוסף, hESCs או hiPSCs ניתן מהונדס גנטי על מנת לתת ביטוי המושרה של transgen es 19 או עבור החדרת גני כתב ב לוקוסים אנדוגניים 20, ו תאים אלה יכולים להיות מובחנים לתוך תאי trophoblastic באמצעות בתנאים המתוארים כאן.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
זה הכרחי כדי להשמיט B-FGF (FGF2) ממדיום בידול CM להשיג ובתאי trophoblastic מן hESCs. הנוכחות של B-FGF יחד עם BMP4 במדיום התרבות משפרת את הביטוי של אבות mesoderm ו endoderm 16. הכללת B-FGF במדיום בידול trophoblast הוא האמין להסביר מדוע מחקר שנערך לאחרונה מצא כי בידול בתיווך BMP4 מייצר תאי המזודרם ו endoderm במקום trophoblasts 21. הוא ומבוסס כי B-FGF יחד עם Activin A ו- BMP4 מקדם endoderm והבחנת mesoderm באופן תלוי במינון 22,s = "Xref"> 23. בשנת העכבר, התפתחות epiblast, trophectoderm, שושלות endoderm פרימיטיביות תלויות מסלולי איתות FGF 24. להבדיל hESCs, B-FGF-induced איתות נדרש להיווצרות המזודרם כאשר BMP4 משמש להשרות התמיינות 21, 25. לעומת זאת, עיכוב של שתי FGF ואת מסלולי איתות Activin / קטרי, יחד עם BMP4, טובות היווצרות SYN ב אבות trophoblast hESC הנגזרות ומונע היווצרות של אבות mesoderm ו endoderm פרימיטיבי 26.
מגבלות של הטכניקה
הבעיה הכי האופיינית עם פרוטוקול זה של בידול hPSC כדי אבות trophoblast קשורה החל עם אוכלוסייה מובחנת בעיקר של hESCs או hiPSCs על MEFs. בגלל hPSCs לצבור תאים מובחנים בשני הקצוות הפנימיים והחיצונייםשל המושבות, חשוב לפקח על כמות בידול יומית וכדי להסיר מושבות בדיל (או חלקים של מושבות). הנוכחות של תאים מובחנים יכול לסבך את תהליך הבידול, במיוחד כאשר תאים מועברים הבין-תאי. תאי הבדיל יתרבו במהירות על תאי מטריקס בנוכחות CM, ותאים אלה יהפכו מהר להשתלט על התרבות מחוץ להתחרות hPSCs. לכן, הוא אידיאלי להתחיל עם מושבות בריאות, מובחנות של hPSCs גדלו על MEFs לפני העברת התאים לחומר הבין-התאי.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
בעת שימוש בפרוטוקול הבחנה זו, אבות trophoblast וכתוצאה מכך הם תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. Trophoblasts מורכבות cytotrophoblasts villous, syncytiotrophoblasts (SYNs), ו cytotrophoblasts extravillous(ד ^) 27. cytotrophoblasts Villous הם אבות שיוצרים ד ^ ו SYNs. HPSCs BMP4 הבדיל יפיק תערובת של cytotrophoblasts villous, SYNs, ו ד ^ 9, 15, אשר הוגדרו על ידי ביטוי גנים או חלבון של סמנים ספציפיים-השליה. המסלולים בידול ברור ניתן להבחין על ידי הפרשת HLA-G (מאפיין של ד ^) או גונדוטרופין כוריוני אנושי (מ SYNs) 28, 29. לאחרונה, הוכיח כי העיכוב של איתות Activin / קטרים טובים בידול EVT מן hESCs, והסרת עכבות זה מעדיפה בידול כדי SYN 17. ואכן, פרסום מוקדם מצאו ששימוש BMP4 לבד להבדיל hESCs מייצר בעיקר תאי SYN 26. הנתונים באמצעות BMP4 / A / P ובינוניים מותנה (חסר B-FGF) מצביעים על כך שקיימתהן EVT ותאי SYN הנוכחי ביום בידול 5. אם אוכלוסיות EVT או SYN הטהורים הן רצויות, טיהור נוספת באמצעות סמנים פני תא, כגון HLA-G מצומדות כדי חרוזים עבור הבידוד של ד ^, אפשרי 29. לסיכום, שיטת התרבות המתוארת כאן היא דרך יעילה להפקת כמויות משמעותיות של תאי trophoblastic מ hPSCs שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של יישומים. בגלל פרוטוקול זה מייצר הוא SYNs ו ד ^, היא מערכת מודל מתאימה לבחינת השליה האנושית מוקדם. תאים אלה יכולים לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות והנדסה גנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
