Abstract
胎盘是胚胎发育过程中，开发的第一个器官，并需要对发育中的胚胎的生存。胎盘包括从植入前胚泡的胚外滋养外胚层细胞分化的各种滋养细胞。因此，我们的人胎盘的早期分化事件的认识，是因为对人胚胎的分离和操作的伦理和法律限制的限制。人多能干细胞（hPSCs）是用于调查人类发展的稳健的模型系统，也可以在体外分化成表达各滋养层细胞类型的标志物滋养层细胞。在这里，我们提出了一个详细的协议，用于区分hPSCs到使用骨形态发生蛋白4和激活素/ Nodal信号通路抑制剂的滋养层细胞。该协议生成可以用的siRNA转染各种滋养层细胞类型调查失功能表型或可感染病原体。此外，hPSCs可以进行遗传修饰，然后分化成滋养层祖换的功能增益分析。用于产生人类滋养细胞从hPSCs开始本体外分化的方法克服了与早期的人类胚胎工作的伦理和法律的限制，并且该系统可用于多种应用，包括药物发现和干细胞研究。
Introduction
怀孕期间胎盘需要胎儿的生长和存活，并促进气体，营养物，废物和激素的母体和胎儿循环之间的交换。哺乳动物胚胎发育过程中形成的第一器官是胎盘，它开始显影6-7天在人类受孕后和在小鼠中1，2，3，4 3.5-4.5天。滋养层细胞是胎盘的最重要的细胞，这些细胞所代表的哺乳动物胚胎的最早谱系分化的事件之一。他们从植入前胚泡的外胚外滋养层细胞产生。我们的胎盘发育的早期阶段的知识是通过模拟早期人类发展的伦理和后勤限制的限制。
在胚胎移植，滋养细胞侵入母体上皮细胞和分化成专门的祖细胞5。细胞滋养细胞（CTB介）的单核，即融合和分化成合体（SYN包）和绒毛外滋养层细胞侵入（EVTs）未分化的祖细胞，它的锚胎盘在子宫。 SYN包的多核，即合成所需的持续受孕激素影响终末分化细胞。产生EVTs和SYN包的早期分化事件对于胎盘形成所必需的，如在滋养层细胞的损伤导致流产，先兆子痫，宫内生长受限1。已经开发人类滋养细胞系的类型包括永生个CTB和绒毛膜癌，其产生的胎盘激素和显示侵入属性6。从人类早期妊娠胎盘的主要滋养层细胞可以分离，但很快细胞DIFferentiate并停止在体外增殖。重要的是，转化和原代细胞系具有不同的基因表达图谱，表明致瘤性和永生滋养层细胞系可能不准确地表示主滋养层7。此外，这些线是不可能像胎盘滋养层干细胞祖细胞，因为它们是从后级通过第三孕期导出的第一。
有为了研究胎盘的形成和功能的早期事件需要在早期人类滋养细胞体外培养体系稳健。人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），它们共享与早期胚胎的内细胞团性质，常用于早期人类的发展模式，包括早期胎盘的形成。人类诱导多能干细胞（iPS细胞）和人类胚胎干细胞可以分化成骨用在铁道部滋养细胞体外phogenic蛋白4（BMP4）8，9，10，11，12，13，14，15。多能细胞用BMP4的滋养层细胞这种转换是特异于人细胞，并广泛用于研究早期人类胎盘的发展，因为它不要求访问人类早期胚胎9,16。最近，人们发现，在加入抑制剂A83-01（A）和PD173074（P），其阻断SMAD2 / 3和MEK1 / 2信号途径，增加HPSC分化的效率为滋养外胚层样祖细胞，主要的SYN和EVTs，没有广泛代中胚层，内胚层或外胚层细胞9，17的该体外模型系统9，11的有效性。在这里，我们提出了hPSCs 体外分化为使用BMP4 / A / p培养基中的人类祖先滋养了详细的方案。这些条件产生细胞的数量丰富为各种各样的应用，包括RNA测序，基因破坏用的siRNAs，病原体感染，遗传修饰使用脂转染介导的转染。
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Protocol
注：对于任何一个人类胚胎干细胞或iPS细胞分化成滋养层祖细胞，生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）hPSCs的转变开始分化与BMP4 / A / p之前无饲养了两个通道的条件。这个过程消除了分化细胞的MEF污染。这里，我们提出了人类胚胎干细胞分化的协议，和相同的协议可以被应用到人iPS细胞。
1.文化和辐照小鼠胚胎成纤维细胞的人类胚胎干细胞恢复细胞（MEF）（制剂）
- 的MEF的γ-辐射
- 制成500毫升培养的MEF培养基：DMEM含10％FBS，2mM的L-谷氨酰胺，1×青霉素/链霉素（青霉素/链霉素），和0.1mM非必需氨基酸（NEAA）。
- 解冻初级MEFs中的一小瓶，并使用MEF培养基用于培养细胞。展开主MEF中使用MEF培养基30板。
注意：氧浓度没有此步骤至关重要，因此任一培养箱内生理（4％）或环境（20％）的条件下都可以使用。 - 收获MEFS。使用0.25％胰蛋白酶，以从板取下的MEF并将细胞转移到锥形管中。放置的MEF到照射仪器并暴露细胞3500灰色。
注：的时间量将取决于照射单元内的源的活性。 - 悬浮用MEF培养基照射的MEF和计数使用血球细胞的数目。
- 沉淀使用离心机该MEF并添加50％的MEF培养基和50％的细胞冷冻培养基（80％FBS和20％的MEF培养基）。等分试样每瓶1×10 6个细胞。
- 放置在-80℃的冰箱中过夜的辐照MEF小瓶，然后将它们转移到液氮长期贮存。
- 为解冻冷冻文化MEF中与人类胚胎干细胞
- 使500毫升人类胚胎干细胞培养基：DMEM / F-12，用20％血清Replac键相，0.1毫NEAA，2mM的L-谷氨酰胺，10纳克/ ml的bFGF，0.1毫β-巯基乙醇，和1x青霉素/链霉素。
- 解冻胚胎干细胞解冻前MEF中一天一小瓶。涂覆6孔板有0.1％明胶，用1毫升每孔中。孵育在室温下至少20分钟，然后取出明胶。
- 从存储在液氮中删除的MEF的小瓶中并浸入小瓶在37℃水浴中。观察间歇直到只剩下小冰晶保持小瓶。迅速将小瓶中的内容传送9mL的MEF培养基的15毫升锥形管内。
- 通过在200 xg离心离心5分钟沉淀细胞。吸出上清液并重新悬浮在MEF培养基的细胞沉淀。均匀分装的MEF到6孔板中。放板放入37℃的低氧（4％）培养箱中过夜。
- 在MEF中人类胚胎干细胞的常规培养
- 从液氮中取出的胚胎干细胞小瓶用3迅速解冻小瓶7℃水浴。轻轻吸取人类胚胎干细胞到含有9毫升人类胚胎干细胞培养基的15毫升锥形管和自旋向下在200 XG 5分钟。除去培养基并用1ml人类胚胎干细胞培养基中重悬细胞。
- 吸从步骤1.2.4准备好的平板的MEF中，加入1 ml人类胚胎干细胞培养基。 ROCK抑制剂Y-27632（10μM）加入到人类胚胎干细胞培养基。转移到人类胚胎干细胞MEF中。
- 放置细胞进入37℃的低氧（4％）培养箱中过夜。每天更换人类胚胎干细胞中。刮去分化的细胞用巴斯德移液管，在4X直立显微镜下观察。
- 通道的人类胚胎干细胞每4-6天，取决于细胞汇合和人类胚胎干细胞集落的大小。一天前传代MEF中准备一盘。当细胞准备通道，取出胚胎干细胞培养基，并用1毫升的PBS洗孔。
- 加入1毫克/毫升胶原酶（预热至37℃），孵育在37℃下5分钟，然后取出胶原酶。 W¯¯灰的细胞用PBS，每孔加入1 ml人类胚胎干细胞培养基中，并手动刮去细胞进入使用5毫升吸管的尖端小团块。转移悬浮细胞团块到一个新的MEF涂覆的孔（多个）。
2.由MEF人类胚胎干细胞的过渡到无饲养的细胞外基质，涂层板条件
- 准备MEF条件培养基（CM）
- 板在T75烧瓶中的照射的MEF在90-100％汇合;重要的是，该MEF密集电镀。观察用显微镜，以确定它们是否已连接于烧瓶底部的细胞（MEF中附上约6小时的电镀或第二天之后）。
注意：使用显微镜观察时未连接的细胞漂浮在介质中。第二天，除去MEF培养基，并添加25毫升人类胚胎干细胞培养基中缺乏的B-FGF。 - 孵化后24小时收集条件培养基。用新鲜培养基每天最多12天进行更换。 使用0.22微米过滤器过滤所收集的CM。在使用之前，添加新鲜的B-FGF到CM。
注：CM能够在-80℃冷冻并贮存长达1年。可替代地，在4℃下储存在CM 2周。
- 板在T75烧瓶中的照射的MEF在90-100％汇合;重要的是，该MEF密集电镀。观察用显微镜，以确定它们是否已连接于烧瓶底部的细胞（MEF中附上约6小时的电镀或第二天之后）。
- 从转变对文化MEF中的人类胚胎干细胞的馈线自由外涂层矩阵板。
- 细胞外基质的制备用于涂覆组织培养板
- 解冻的细胞外基质的在冰上的等分试样（约3-4小时）。使用冰冷的提示，一冷，50ml锥形管中，并DMEM / F12培养基，传送2毫克的细胞外基质的成24毫升冰冷的DMEM / F-12（稀释取决于细胞外基质浓度从供应商）。
- 立即锥形管转移50毫升冰和储存于4℃。用于涂覆组织培养板中，稀释细胞外基质的适量添加到孔（例如，将1ml每孔在6孔板）。漩涡涂覆该板，并在室温下孵育至少1小时。
- 使用含有B-FGF（10毫微克/毫升）的CM通道的hESCs从该MEF（如在步骤1.3）。
- 抽吸以从新印版移除细胞外基质并添加含B-FGF的CM。使用移液管从MEF板传送刮下细胞团块，并将其分装到细胞外涂覆基质板。孵育在37℃的低氧培养箱中过夜。
- 更换每日B-FGF介质CM;介质的量将依赖于培养瓶的大小。用2毫升培养基用于一个6孔井。刮去分化的细胞用巴氏吸管。
- 人类胚胎干细胞通过每6-7天，如果在显微镜下观察菌落明亮。
注：生长在涂外基质平板菌落人类胚胎干细胞生长速度比MEF培养的细胞大。 - 当无饲养层细胞准备通道，取出介质，通过广告洗采用吸移管吸出，除去PBS丁1ml的PBS中，添加0.5毫克/毫升分散酶（预热至37℃）用移液管，并且在37℃下孵育5分钟。
- 加入2毫升的PBS每孔并随后吸移用PBS洗细胞。加入1ml每孔的CM和手动刮去细胞进入使用5毫升吸管的尖端小团块。
- 板悬浮细胞团块进入新的细胞外基质包被的平板; 24小时后的细胞要坚持。
- 细胞外基质的制备用于涂覆组织培养板
3.使用人类胚胎干细胞BMP4 / A / P值分化
- 准备分化培养基。使用CM（缺乏B-FGF），并添加（鲜）BMP4（50毫微克/毫升）中，A83-01（1μM），和PD173074（0.1μM）。添加在使用前这些抑制剂到CM。
- 使用无饲养层人类胚胎干细胞的细胞外基质包被的平板1通行增长，定在4％氧气的培养箱内培养。所述第一通道到细胞外涂覆基质的平板后，让细胞附着24小时。第二天，开始分化。除去（含B-FGF）的CM和用含有BMP4 / A / p（2毫升，每孔在6孔板）的CM代替它。继续培养用4％的氧含量的细胞。
- 更换含BMP4 / A / P中的CM（2毫升/一个6孔板），每2天。吸删除旧的介质，并使用吸管添加新的CM。上添加BMP4和除去的B-FGF（考虑分化第2天）后的第二天，细胞形态发生变化，用显微镜观察时出现大。
注：未分化细胞，表现出明亮的圆边，将不存在。 - 收集的细胞以期望的时间点。分化的细胞会停止约2周后分裂。在这段时间内转染细胞（参见下一部分）。
4.转染滋养层细胞与siRNA的或质粒DNA
- 准备转染滋养层细胞
- 对细胞外基质的两个通道从该MEF它们转移后的文化人类胚胎干细胞（见步骤2.2）。使用含有B-FGF人类胚胎干细胞中。
- 分裂的胚胎干细胞分化上之前，新的细胞外基质板一天。高细胞融合是非常重要的，所以1分裂细胞：1到一个新的板块/孔，这将确保至少50％汇合第二天。孵育细胞过夜在低氧气培养箱。
注：胚胎干细胞不需要在这个步骤中被计数。 - 第二天，替换用分化培养基的培养基（含有BMP4 / A / P和缺乏B-FGF，使用2-毫升/孔的6孔板的CM）。通过抽吸除去旧培养基并转移使用移液管的新培养基（2ml）中。放置细胞在低氧培养器（4％氧气）中过夜。
- 分化细胞，直到所需的时间点（之间的天1和14）。转染前一天，trypsinize使用0.05％胰蛋白酶进行5分钟的细胞。他们板至所需汇合（取决于转染试剂协议）到明胶包被的平板（0.1％明胶添加到组织培养板20分钟，并吸出除去）。添加含有BMP4 / A / P（缺乏B-FGF）CM和孵育过夜。
- 第二天，新鲜分化培养基添加到细胞中。的siRNA转染使用siRNA转染试剂。对于质粒DNA，使用适当的脂质体试剂。
- 按照产品协议为每个转染试剂描述。转移的siRNA脂质体复合物的细胞的每个孔/板，轻轻混合，培养细胞过夜以低氧气培养箱。
注意：有些转染试剂是由抗生素，需要CM缺乏笔/链球菌抑制。 - 第二天，替换以新鲜分化培养基。
- 收获细胞的欲望ð时间点（ 例如，24小时，48小时和72小时），利用定量RT-PCR检查基因破坏效率。收获细胞，使用0.05％胰蛋白酶，加入每孔1 ml，在37℃温育5分钟。加入5毫升，每孔MEF培养基的以中和胰蛋白酶。降速细胞在200×g离心5分钟，并使用用于RNA分离细胞沉淀。
滋养层细胞5.病原感染：仙台病毒感染
- 准备分化的胚胎干细胞
- 为从该MEF转让后的细胞外基质两段文化人类胚胎干细胞（见步骤2.2）。使用含有B-FGF人类胚胎干细胞中。
- 分裂的胚胎干细胞分化上之前，新的细胞外基质板一天。高蜂窝汇合是重要的，因此分裂细胞1:1到一个新的板/孔，这将确保至少50％汇合的第二天。孵育细胞过夜以低氧气培养箱（4％氧气）。<BR />注：不需要在这一步要算人类胚胎干细胞。
- 第二天，替换用分化培养基（含CM BMP4 / A / P和缺乏B-FGF）和培养过夜以低氧气培养箱（4％氧气）的介质。
- 滋养层细胞的仙台病毒感染
- 所需的分化前一天一天，trypsinize使用0.05％胰蛋白酶的分化细胞（单细胞）5分钟，并将其转移到明胶包被的板。添加分化培养基和在低氧气培养箱孵育过夜。
- 第二天，添加培养基感染（这将取决于病毒而变化）。使用CM缺乏含有BMP4 / A / P，以0.5毫升一个6孔板的一个孔青霉素/链霉素。添加仙台病毒对于MOI = 1孵育在低氧气孵化8小时。
- 如果更多的时间点是必要的，删除含有病毒的培养基后4小时，并用BMP4 / A / p CM替换它。收集细胞用于RNA分离使用细胞刮。
- 通过对所涉及的病毒反应18个基因进行定量RT-PCR确定病毒感染的效率。
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Representative Results
hPSCs的体外分化概述
该体外分化方案开始生长在被转换到无饲养为一个通路（ 图1A）的条件的MEF未分化的人类胚胎干细胞。虽然我们在本协议中所述人类胚胎干细胞的分化，我们使用这个协议成功地分化成iPS细胞滋养层细胞。细胞外基质的过渡去除大部分照射的MEF，这是不可取的，需要人的滋养层细胞的纯群体的分析。未分化hPSCs生长在细胞外基质，并与含B-FGF的CM，直到菌落准备传代（约1周）中培养。这将保持之前的诱导BMP4 / A / P-介导的分化多能状态。菌落被打乱成团块〜50-100细胞用分散酶传代的第二时间上的一个细胞外涂覆基质板。传代后的第二天，将粘附细胞准备诱导分化，并且介质被切换到包含缺乏B-FGF BMP4 / A / P上。在分化的细胞增殖为约2周，在此期间，细胞可以被收集用于RNA分离，或用于转染实验。形态学变化出现分化后1-2天已经启动，并从一个代表性实验的结果显示在图1B中示出。请注意，在分化1-2天的细胞在尺寸上大于从第0天（ 图1B）的细胞大。分化的细胞集落迅速增长，而这种变化每天都引人注目。作为分化的进行，细胞分裂和从菌落中心向外膨胀，在向外方向生长（3-5天; 图1B）。相比t时菌落的外部分含有大细胞他的细胞以集落的中心。在分化细胞变得比外基质培养的多能干细胞的黑暗和平坦的;与用于常规细胞培养直立显微镜观察细胞时在细胞亮度变化更明显。个别菌落被分化5天（ 图1B）合并在一起，用细胞生长在相互的顶部上。 4-5分化一天后，将含有多个核的细胞是本（未示出）（ 图1B）。
BMP4 / A / p诱导滋养细胞标志物的分化与表达
我们在使用定量RT-PCR（QRT-PCR）BMP4 / A / p分化的最初三天检测基因表达的变化。的RNA在分化天1，2中分离，和3，并转换为cDNA。多能干细胞的消失可以评估两个Bý形态，直观地使用显微镜，和通过qRT-PCR，使用多能性基因的引物。 NANOG，多能干细胞的标志物，所述的相对表达水平是通过降低〜分化一天，当细胞用BMP4培养，水平由〜90％在BMP4 / A / P的存在而降低（后75％ 图2）。由2分化一天，比起那些在人类胚胎干细胞的CM培养基（含B-FGF）NANOG的水平是在单独或BMP4 / A / p BMP4培养细胞非常低。这是预期的结果，因为我们没有后分化两天（ 图1B），这是更明亮，相比分化细胞在尺寸较小的观察未分化的细胞。 KRT7和CDX2：BMP4介导的分化来滋养层细胞的效率可以通过qRT-PCR使用特异性两个滋养层标志物的引物直接评估。这两个基因在人多能干不表达细胞，并经过BMP4治疗2-3天的表达增加（ 图2）。使用这里描述的条件，KRT7转录水平上BMP4 / A / p中分化1天增加和分化的第3天保持不变（ 图2）。单独使用时，BMP4表达KRT7有第2天的延迟增加，与以前的意见一致认为激活素/节点抑制剂增加人类胚胎干细胞9的分化率。评估使用这些抑制剂的效率的另一种方法是确定在单独用BMP4处理的细胞，CDX2和KRT7转录物的稳态丰度。 CDX2水平单独使用或者BMP4或BMP4在一起时用激活/交点抑制剂用于分化1-3天相似。然而，KRT7转录较为丰富在这些抑制剂存在，这表明更分化后一天快速分化（ 图2）。 CDX2表达通常峰值在这两个条件下分化2天和第3天（ 图2）后降低。未分化的胚胎干细胞不表达任何KRT7或CDX2（ 图2），符合市场预期。总之，BMP4 / A / p条件迅速分化的胚胎干细胞和胎盘标志物的表达可早在3天的分化检测。
siRNA和质粒DNA的转染和病毒感染用体外来源的滋养层细胞
体外衍生的人滋养层细胞可以用的siRNAs转染到扰乱或者编码或非编码RNA的基因表达。我们开始使用BMP4 / A / p人类胚胎干细胞的分化，进行两回合的siRNA转染的分化天1和2（使用的是75皮摩尔的siRNA）并收集用于RNA分离的细胞。定量RT-PCR是确定或者编码或非编码基因的敲低效率的有效方法。使用两种siRNA到长的不同区域互补，非编码的RNA lncRHOXF1 19，我们得到lncRHOXF1转录（ 图3A）的80％击倒。接下来，我们转1的siRNA（25皮摩尔）的蛋白质编码基因核蛋白U，也分化天1和2，我们观察到在核蛋白ü转录以下两个连续的转染减少了80％。 在体外分化滋养层祖细胞也可以用来研究先天免疫反应。我们2细胞使用仙台病毒以1的MOI进行分化一天的感染和后病毒培养8小时收集细胞。使用定量RT-PCR，我们在感染的细胞（ 图3B），表明活性病毒的亲检测丰富的病毒蛋白的转录（西弗-NP）pagation胚胎细胞。重要的是，感染的细胞（用MOI = 1）不在外观变化和是可行的（数据未示出）。 体外衍生的滋养层细胞也可以用质粒DNA转染。我们进行使用GFP质粒转染，并介绍了该建设成为BMP4 / A / P-处理的细胞分化1天，3天和第成像的GFP翌日（ 图4）。我们通常在24小时转染后获得30-50％的转染效率。总之， 在体外衍生的滋养层细胞可被用于GAIN-和失功能实验。
图1： 体外培养的 人多能干细胞分化为使用BMP4 / A / p早期滋养层细胞。 （A）BMP4的分化示意图的hPSCs使用BMP4 / A / p滋养层细胞。 （B）的D0，d2和BMP4 / A / p分化D6期间HUES9细胞的代表性亮场图像。比例尺=50μM的。该箭头表示未分化的单细胞胚胎干细胞。箭头分化过程中突出的形态特征。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：BMP4 / A / p分化迅速下调的多能性标记NANOG和上调滋养细胞基因CDX2和KRT7。定量RT-PCR分析NANOG（多能性标志物），CDX2和KRT7（滋养层标记）。该值从一式三份的措施平均值。 //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3： 基因破坏和 使用体外 分化的人滋养层细胞 病毒感染 。 （A）的区别，然后用特定的长的siRNA转染的，非编码的RNA lncRHOXF1（左）或连续两天的蛋白质编码基因核蛋白U（右）的胚胎干细胞的定量RT-PCR分析（HUES9）。击倒效率（K D）通常为70-80％，并从一个转染实验的结果示。 （B）感染仙台病毒分化一天2滋养层细胞的仙台病毒蛋白转录物的定量RT-PCR分析（MOI = 1）8小时。误差棒表示SEM。“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图4： 质粒DNA引入到 体外 分化的人类滋养细胞。 GFP的质粒DNA的转染分化天1和第3天滋养外胚层祖细胞，可视翌日。比例尺=50μM的。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们提出了分化的hESC入滋养层祖细胞的基本步骤。这个协议最近被优化以迅速分化的hESC与除了激活素/ Nodal信号抑制剂，增加分化为滋养层细胞和避免胚层祖细胞，其通常单独用BMP4治疗观察到的产生。该模型BMP4系统允许滋养层沿袭规格和扩展的最早阶段的审查。此外，这种BMP4模型系统也调查滋养层细胞向特定子谱系，使用绒毛膜细胞系和绒毛外滋养细胞系，这是不可能的分化是有用的。 体外衍生的滋养层细胞，也可用于使用的siRNA 19失功能实验。此外，胚胎干细胞或人iPS细胞可以被遗传修饰为transgen的诱导表达 ES 19或报告基因中的内源性基因座20的插入，并且这些细胞可以分化成使用此处所描述的条件滋养层细胞。
该议定书中的关键步骤
当务之急是要忽略从CM分化培养基B-FGF（FGF2）从人类胚胎干细胞滋养层获得的祖细胞。 B-FGF的存在下，在培养基中BMP4一起增强中胚层和内胚层祖细胞16的表达。 B-FGF的滋养分化培养基中包括被认为是解释为什么最近的一项研究发现，BMP4介导的分化产生中胚层和内胚层细胞，而不是滋养细胞21。它是完善的那个B-FGF与活化素A和BMP4一起促进定形内胚层和中胚层分化以剂量依赖的方式22，S =“外部参照”> 23。在小鼠中，外胚层，滋养外胚层的发展，和原始内胚层谱系依赖于FGF信号途径24。在鉴别的hESC，需要为中胚层形成的B-FGF诱导的信号时BMP4被用于诱导分化21,25。与此相反，两个FGF和激活素/ Nodal信号通路的抑制，用BMP4在一起，有利于在hESC衍生滋养层祖细胞的SYN形成和防止胚层和原始内胚层祖细胞26的形成。
该技术的局限性
本协议HPSC分化为祖细胞滋养层最典型的问题是与MEF中对人类胚胎干细胞或iPS细胞的未分化的主要人群开始有关。因为hPSCs积聚在内部和外部边缘两者分化的细胞菌落，每日监测分化的量和去除分化集落（或菌落的部分）是很重要的。分化的细胞的存在可以复杂化的分化过程中，特别是当细胞被转移到细胞外基质。分化的细胞将迅速增殖的CM中存在的细胞外基质，并且这些细胞将迅速接管培养和出竞争hPSCs。因此，理想的是首先将细胞转移到胞外基质前上生长的MEF hPSCs的健康，未分化菌落。
关于到现有/替代方法的技术意义
当使用该分化方案，所得到的滋养层祖细胞的细胞类型的非均相混合物。滋养是由代绒毛滋养细胞，合体（SYN包）和绒毛外滋养细胞的（EVTs）27。代绒毛滋养细胞是生成EVTs和SYN包的祖先。 BMP4分化hPSCs将产生绒毛细胞滋养层，SYN包，和EVTs 9，15，其已通过具体的胎盘标志物的基因或蛋白质表达所定义的混合物。的不同的分化途径可以由HLA-G的分泌（EVTs的特性）或人绒毛膜促性腺激素（从SYN包）28，29加以区别。最近，已经表明，激活素/ Nodal信号的抑制有利于从人类胚胎干细胞的EVT分化，和去除这种抑制的有利于分化的SYN 17。事实上，早期的出版物发现，使用单独BMP4分化的胚胎干细胞生成SYN多为26的细胞。用BMP4 / A / P和条件培养基（缺少B-FGF）的数据表明，有都EVT和本由分化一天5.如纯的EVT或SYN人群期望，附加的纯化使用细胞表面标志物，如HLA-G缀合到珠粒EVTs的分离，有可能29 SYN细胞。总之，这里所描述的培养方法是生成显著量从hPSCs滋养层细胞，可用于各种应用的有效方法。因为这个协议同时生成的SYN和EVTs，它是用于检查早人胎盘的合适模型系统。这些细胞可用于多种应用，包括药物发现和遗传工程。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
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