Abstract
Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA'lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.
Introduction
Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler 1, 2, 3, 4 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır.
embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin 5 farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme geriliği, 1 sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri 6 üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast 7 temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir.
Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun 9, 16 erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri 9, 17 kapsamlı nesil olmadan EVTs, in vitro model sistemi 9, 11 geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA'lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: trofoblast atalarıdır içine ya hESC veya hiPSCs farklılaşma için, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerinde yetiştirilen hPSCs BMP4 / A / P ile farklılaşmayı başlamadan önce iki pasaj koşullarını serbest besleyici geçişi yapılır. Bu işlem, farklılaşmış hücre MEF kontaminasyonu ortadan kaldırır. Burada, HESC farklılaşması için bir protokol mevcut ve aynı protokol hiPSCs uygulanabilir.
1. Kültür ve Işınlanmış Fare Embriyonik Fibroblastlar üzerinde hESC Kurtarma (MEFS) (preparatlar)
- MEF'ler gama-radyasyon
- % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin (pen / strep) ile DMEM, ve 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) MEFS kültürlenmesi için ortam 500 ml olun.
- Birincil MEFS bir şişe çözülme ve hücrelerin kültürlenmesi için MEF orta kullanın. MEF kültür ortamı kullanılarak 30 plakalara birincil MEFS genişletin.
NOT: oksijen konsantrasyonları bu aşama için kritik öneme sahip değildir, bu yüzdenHer iki kuvöz içinde (% 4), fizyolojik ya da ortam (% 20) koşullar kullanılabilir. - MEFS hasat. plakalardan MEFS çıkarmak ve konik tüp hücrelerin aktarımı için% 0.25 tripsin kullanın. Bir ışınlama aracı haline MEFS yerleştirin ve 3.500 griler hücreleri maruz bırakmaktadır.
NOT: süre ışınlayıcı ünitesi içindeki kaynağın etkinliği bağlıdır. - MEF kültür ortamı ile ışınlanmış MEFS tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını.
- Bir santrifüj kullanılarak MEFS Pelet,% 50 MEF kültür ortamı ve ortam (% 80 FBS ve% 20 MEF kültür ortamı) dondurma% 50 hücre ilave edin. Kısım şişe başına 1 x 10 6 hücre.
- bir gecede -80 ° C derin dondurucuda ışınlanmış MEF şişeleri yerleştirin ve sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen aktarabilirsiniz.
- Kültür için dondurulmuş MEFS ve hESC çözülme
- HESC ortamının 500 ml yapmak: DMEM / F-12,% 20 serum Replacası, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0.1 mM beta-merkaptoetanol ve 1 x Pen / Strep.
- hESC çözülme önce MEFS bir gün bir şişe çözülme. Kat her bir 1 ml kullanılarak,% 0.1 jelatin ile bir 6 yuvalı plaka. Oda sıcaklığında, en az 20 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra jelatin çıkarın.
- Sıvı azot içinde depolama MEF'ler bir şişe çıkarın ve 37 ° C su banyosu içinde şişeyi bırakın. sadece küçük buz kristalleri kalır aralıklı kadar flakon izleyin. Hızla 15 ml konik tüp içinde MEF ortamın 9 ml flakon içeriğini aktarmak.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı aspire ve MEF ortamında hücre pelletini. 6 yuvalı bir plaka uzerinde eşit MEFS kısım. gece boyunca 37 ° C düşük oksijen (% 4) inkübatör içine plaka koyun.
- MEFS üzerinde hESC rutin kültür
- sıvı azot bir HESC şişe çıkarın ve hızlı bir şekilde 3 ile flakon çözülme7 ° C su banyosu. Yavaşça HESC ortamın 9 ml içeren 15 ml konik bir tüp içine hESC pipet ve 5 dakika 200 x g'de aşağı doğru döndürün. Ortamı çıkarın ve HESC ortamı, 1 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri.
- Aşama 1.2.4 hazırlanan levhadan MEF orta aspire ve HESC ortamının 1 ml. HESC ortamına Kaya önleyicisi Y-27632 (10 uM) ekleyin. MEFS üzerine hESC aktarın.
- gece boyunca 37 ° C düşük oksijenli (% 4) inkübatör içine hücreleri yerleştirin. Günlük HESC orta yerine. 4X de dik bir mikroskop altında görüntülendi Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak.
- Geçiş HESC her 4-6 günde hücre konfluent ve HESC kolonilerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pasajlanması gün önce MEFS bir tabak hazırlayın. Hücreler geçit hazır olduğunuzda, HESC orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile iyice yıkayın.
- 1 mg / ml kollajenaz ekleme (37 ° C önceden ısıtılmış), 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve kolajenaz çıkarın. W, Hücrelerin PBS ile kül oyuk başına HESC ortamın 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak, küçük topaklar içine hücreleri kazıyın. Yeni MEF kaplı iyi (ler) içine askıya hücre kümeleri aktarın.
MEF'lerden HESC 2. Geçiş besleyici-hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde Koşulları
- Hazırlayın MEF Orta (CM) Buzdolabı
- % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF'ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz).
NOT: Bir mikroskop kullanılarak gözlenen Bekâr hücreler ortamda yüzer. Ertesi gün, MEF orta kaldırmak ve B-FGF eksik hESC orta 25 ml ekleyin. - inkübasyondan 24 saat sonra koşullu ortam toplanır. 12 günlük bir süre boyunca her gün taze ortam ile değiştirin. 0.22 um bir filtre ile toplanmıştır cm filtre. Önce kullanmak CM taze B-FGF ekleyin.
Not: CM, -80 ° C'de dondurulmuş ve 1 yıla kadar depolanabilir. Seçenek olarak ise, 2 hafta boyunca 4 ° C'de CM saklayın.
- % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF'ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz).
- Geçiş MEFS üzerinde kültür hESC besleyici serbest hücre dışı matriks kaplı plakalar.
- Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması
- Buz üzerinde hücre dışı matrisin bir kısım (yaklaşık 3-4 saat) çözülme. buz soğukluğunda ipuçları, tek bir soğuk 50 ml konik tüp, ve DMEM / F12 ortamı transfer buz soğukluğunda DMEM 24 ml hücre dışı matrisin 2 mg kullanarak / F-12 (dilüsyon Sunucunun hücre dışı matris konsantrasyonuna bağlıdır ).
- Hemen buz 50 ml konik tüp transferi ve 4 ° C'de saklayın. Kaplama doku kültürü plakaları için, oyuk seyreltilmiş hücre dışı matrisin uygun miktarda (örneğin, 6-oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 1 mi). plakayı kaplamak için girdap ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- B-FGF (10 ng / ml) ihtiva eden CM kullanılarak MEF'lerden (adım 1.3 gibi) Geçiş HESC.
- Aspire yeni plakadan ekstraselüler matriks kaldırmak ve B-FGF içeren CM ekleyin. Bir pipet kullanarak MEF plaka kazınmış hücresel kümeleri aktarın ve hücre dışı matriks kaplı plaka içine bölmeyin. gece boyunca 37 ° C'de, düşük oksijen inkübatörde inkübe edin.
- günlük B-FGF orta CM değiştirin; ortamın miktarı, kültür şişesi boyutuna bağlı olacaktır. bir 6-iyi de için orta 2 ml kullanın. Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak.
- Geçiş hESC mikroskop altında bakıldığında koloniler parlak her 6-7 gün.
Not: hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyütülmüş HESC koloniler, MEF-kültürlenmiş hücrelerden daha büyük bir büyür. - besleyici içermeyen hücreler geçiş hazır olduğunuzda, reklama göre yıkayın, orta kaldırmakPBS kaldırmak için bir pipet, aspirat kullanılarak PBS Ding 1 mi, ilave 0.5 mg / ml dispaz bir pipetle (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- oyuk başına 2 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra aspire hücrelerin PBS ile yıkayın. kuyu başına CM 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak küçük öbekler içine hücreleri kazıyın.
- Yeni hücre dışı matris kaplı tabak içine askıya hücre kümeleri Plate; Hücreler 24 saat sonra uymalıdır.
- Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması
BMP4 / A / P Kullanma hESC 3. Farklılaşma
- farklılaşma ortamı hazırlayın. Kullanım CM (B-FGF eksik) ekleyin (taze) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) ve PD173074 (0.1 uM). kullanımdan önce CM bu inhibitörleri ekleyin.
- % 4 oksijen ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlendi 1 geçişi için hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC kullanın. hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerine ilk geçişten sonra,Hücreler 24 saat takmak edelim. Sonraki gün, farklılaşma başlatır. (B-FGF ihtiva) cm çıkarın ve BMP4 / A / P (6 çukurlu bir levha içinde çukur başına 2 mi) ihtiva eden CM ile değiştirin. % 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücrelerin kültürlenmesi devam edin.
- BMP4 / A / P ihtiva eden cm (2 ml / oyuk bir 6-yuvalı plaka) 2 günde değiştirin. Aspire eski orta kaldırmak ve bir pipet kullanarak yeni CM ekleyin. B-FGF (kabul farklılaşma gün 2) BMP4 ekleme ve kaldırdıktan sonra ikinci gününde, hücre morfolojisi, bir mikroskop kullanılarak gözlenen büyük görünen değişecektir.
NOT: Parlak yuvarlak kenarları sergileyen farklılaşmamış hücreler, mevcut olmayacaktır. - İstenen zaman noktalarında hücreler toplanır. Farklılaştırılmış hücreler yaklaşık 2 hafta sonra bölünmesi durur. Bu süre içinde Transfect hücreleri (bir sonraki bölüme bakınız).
siRNA'lar veya plazmid DNA ile trofoblastik hücrelerin 4. transfeksiyonu
- Transfeksiyon için, trofoblastik hücrelerin hazırlanması
- MEFS bunları aktardıktan sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın.
- farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün en az% 50 confluency sağlayacak olan, iyi / yeni bir plaka üzerine 1: Yüksek hücresel confluency önemlidir, bu nedenle hücreler 1 ayrıldı. düşük oksijenli gece boyunca inkübatör içinde inkübe hücreleri.
Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. - Sonraki gün, farklılaştırma ortamının orta yerine (CM 6 plaka ml / oyuk BMP4 / A / P ihtiva eden B-FGF eksik 2 kullanılarak). Aspirasyon ile eski orta alın ve bir pipet kullanılarak, yeni, orta (2 mi) aktarın. gece boyunca, düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) hücreleri yerleştirin.
- İstenilen zaman-kadar hücreleri ayırt(Gün 1 ve 14 arasında) işaret etmektedir. Transfeksiyondan bir önceki gün, 5 dakika için% 0.05 tripsin kullanılarak Hücreleri tripsinize edin. Bir jelatin kaplı plaka üzerine istenen confluency (transfeksiyon reaktif protokolüne bağlı olarak) bunları Plakalı (kaldırmak için 20 dakika ve aspirat için bir doku kültürü plakası% 0.1 jelatin ekleyin). (B-FGF eksik) BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve gece inkübe edin.
- Sonraki gün, hücrelere taze farklılaşma orta ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfeksiyonu siRNA'lar. Plazmid DNA, bir uygun lipofektamin reaktif kullanın.
- Her transfeksiyon reaktifi için tarif edildiği gibi ürün, protokol takip edin. düşük oksijen inkübatör içinde gece boyunca hücrelerin, hücrelerin her bir / plaka siRNA lipofektamin kompleksleri transfer yavaşça karıştırın ve kültür.
NOT: Bazı transfeksiyon ayıraçları CM Kalem / Strep eksik gerektiren antibiyotikler tarafından inhibe edilir. - Ertesi gün, taze farklılaşma medya ile değiştirin.
- arzu hücreleri Hasatd zaman noktaları (örneğin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) kantitatif RT-PCR kullanılarak gen bozulması verimliliğini kontrol etmek. hasat hücreleri için, oyuk başına 1 ml ilave edilmesi ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe,% 0.05 tripsin kullanın. Tripsin nötralize etmek için, göz başına MEF ortamın 5 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri Spin ve RNA izolasyonu için hücre pelletini kullanın.
Trofoblastik Hücreleri 5. Patojen Enfeksiyon: Sendai Viral Enfeksiyon
- Farklılaşması için hESC hazırlanması
- MEF'lerden transferinden sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın.
- farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün, en az% 50 konfluent sağlayacak yeni bir plaka / çukur üzerine 1: Yüksek hücre birbirine karışmaya önemli için ayrı hücreler 1 olduğu. düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) 'de bir gece boyunca inkübe hücreleri. <Br /> Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur.
- Sonraki gün, düşük oksijenli bir inkübatör (% 4 oksijen) farklılaşma madde (ihtiva BMP4 / A / P ve eksik B-FGF) ve gece boyunca kültür ortamı değiştirin.
- Trofoblastik hücrelerin Sendai viral enfeksiyon
- Bir gün istenen farklılaşma bir gün önce, 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanılarak (tek hücre) ayırt Hücreleri tripsinize edin ve jelatin kaplı plaka aktarın. farklılaşma ortamı ilave edin ve düşük oksijenli inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe edilir.
- Sonraki gün, (bu virüs ile ilgili olarak değişir), enfeksiyon için orta ekleyin. 6 oyuklu plakanın bir kuyu için 0.5 ml kullanılarak BMP4 / A / P ihtiva eden Pen / Strep eksik kullanımı CM. MOI, düşük oksijen inkübatör 8 saat 1. inkübe for = Sendai virüsü ekleyin.
- ek zaman noktaları gerekli ise, 4 saat sonra virüs içeren orta kaldırmak ve BMP4 / A / P CM ile değiştirin. hücreleri toplayınRNA izolasyonu için bir hücre kazıyıcı kullanarak.
- Viral cevap 18 yer alan genlerin QRT-PCR gerçekleştirilerek viral enfeksiyonun etkinliğini belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPSCs İn Vitro Farklılaşma Bakış
Bu in vitro farklılaştırma protokolü bir pasaj (Şekil 1A) şartlarını serbest besleyici geçişi yapılır MEFS yetişen farklılaşmamış hESC ile başlar. Bu protokolde hESC farklılaşma tarif ederken, başarılı trofoblastik hücrelerin içine hiPSCs ayırt etmek için bu protokolü kullanılır. ekstraselüler matriks geçiş insan trofoblastik hücrelerin saf popülasyonları gerektiren analizler için istenmemektedir ışınlanmış MEFS, çoğunluğu kaldırır. Ayrım hPSCs hücre dışı matris üzerinde büyütülmüş ve koloniler pasajlarının (yaklaşık bir haftalık) için hazır olana kadar CM B-FGF içeren kültürlenmiştir. Bu BMP4 / A / P-aracılı farklılaşma uyaran önce pluripotent durumunu korur. koloniler ~ kümeleri içine 50-100 hücreleri bozulurdispaz kullanarak bir hücre dışı matris kaplı plaka üzerine bir kez pasajlandı. Pasajlanması gün sonra, yapışan hücreler farklılaşma ikna etmek için hazırız ve orta B-FGF eksik BMP4 / A / P içermesi geçer. farklılaşmış hücreler hücre RNA izolasyonu için toplanır ve transfeksiyon deneyleri için de kullanılabilir ve bu süre içinde, yaklaşık 2 hafta, çoğalır. Morfolojik değişiklikler farklılaşmadan sonra 1-2 gün başlatılmıştır ve temsilci bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 1 B 'de gösterilmiştir görünür. Farklılaşma günlerde 1-2 hücreleri gün 0 (Şekil 1B) hücrelerin daha büyük boyutta olduğuna dikkat edin. farklılaşmış hücre kolonisi hızla büyüyor ve bu değişiklik her gün belirgindir. Farklılaşma ilerledikçe, hücre bölünmeleri ve dışarıya doğru büyüyen, koloninin merkezinden dışarı genişletmek (Şekil 1B günler 3-5). koloninin dış kısmı t kıyasla daha büyük hücreleri içerenkoloninin merkezinde o hücreleri. ayırt hücrelerin ekstrasellüler matriks üzerinde kültüre pluripotent kök hücrelerden daha koyu ve düz hale; Rutin Hücre kültürü için kullanılan dik bir mikroskop ile hücrelerin görüntülerken, hücre parlaklık değişiklikler daha belirgindir. Bireysel koloniler hücre birbirinin üzerinde büyüyen, farklılaşma 5 gün (Şekil 1B) ile birbirine birleştirilir. Farklılaşma günde 4-5 sonra birden fazla çekirdek içeren hücreleri (Şekil 1B), mevcut (gösterilmemiştir) bulunmaktadır.
BMP4 / A / P Trofoblast Markerlerinin Farklılaşma ve Anlatım İndükler
Biz kantitatif RT-PCR (QRT-PCR) kullanılarak BMP4 / A / P farklılaşma ilk üç gün boyunca gen ifadesi değişikliklerini inceledik. RNA, farklılaşma gün 1, 2 izole ve 3 ve cDNA'ya dönüştürülmüştür. pluripotent kök hücrelerin yok olması, hem b değerlendirilebilirY morfolojisi, bir mikroskopla görsel olarak ve QRT-PCR ile, pluripotense genler için primerler kullanılarak. NANOG, pluripotent kök hücrelerin bir markeri, bağıl ifade seviyelerinin azaltılır ~% 75 hücreleri BMP4 ile kültürlenmiştir ve seviyeleri (BMP4 / A / P mevcudiyetinde ~% 90 oranında azaltılır farklılaşma bir gün sonra Şekil 2). Farklılaşma 2 gün olarak, Nanog'un seviyeleri (B-FGF ihtiva eden) HESC CM ortamı içinde kıyasla BMP4 tek başına ya da BMP4 / A / P kültürlenmiş hücreler için çok düşüktür. Biz daha parlak ve farklılaşmış hücrelere göre daha küçük boyutlu olan farklılaşma iki gün (Şekil 1B), sonra farklılaşmamış hücreler gözlemlemek yok, çünkü bu, beklenen bir sonuçtur. KRT7 ve CDX2: trofoblastik hücrelerin BMP4 aracılı farklılaşma etkinliği, doğrudan iki trofoblast edilen markerler için spesifik primerler kullanılarak QRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu genlerin her ikisi de, insan pluripotent kök olarak ifade edilmezHücreler ve BMP4 tedavi 2-3 gün sonra sentezleme artar (Şekil 2). Burada tarif edilen koşullar kullanılarak, KRT7 transkript seviyeleri (Şekil 2) BMP4 / A / P ortamı içinde farklılaşma günde 1 geliştirmek ve farklılaşmasının ilk 3 gün sabit kalır. Yalnız BMP4 kullanarak KRT7 ifade Aktivin / Düğüm inhibitörleri hESC 9 farklılaşması oranını artırmak önceki gözlemlerle uyumludur 2 gün kadar gecikmiş bir artış vardır. Bu inhibitörlerin kullanılmasının etkinliğini değerlendirmek için başka bir yol, tek başına BMP4 ile tedavi edilen hücrelerde CDX2 ve KRT7 transkriptlerinin kararlı durum bolluk belirlemektir. Aktivin / Düğüm inhibitörleri ile birlikte tek başına BMP4 veya BMP4 ya kullanırken CDX2 seviyeleri farklılaşma gün 1-3 için benzer. Bununla birlikte, KRT7 transkript daha önerir, bu inhibitörler varlığında, farklılaşmanın bir gün sonra daha fazladırhızlı farklılaşma (Şekil 2). CDX2 sentezleme tipik haliyle her iki durum için farklılaşma 2. günde zirveleri ve 3. günde (Şekil 2) sonra azalır. Beklendiği gibi farklılaşmamış hESC, KRT7 veya CDX2 (Şekil 2) ya ifade yoktur. Sonuç olarak, BMP4 / A / P şartları hızlı hESC ayırt ve plasental markör ifade erken farklılaşma 3. gün olarak tespit edilebilir.
İn Vitro Kullanımı siRNA'lar ve plazmid DNA transfections ve Viral Enfeksiyonlar Trofoblastik Hücreleri -türevlenmiş
İn vitro türetilmiş insan trofoblastik hücrelerin kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan RNA'lar, ya gen ekspresyonunu bölmek için siRNA'lar transfekte edilebilir. Biz, farklılaşma gün 1 ve 2 (siRNA'lar 75 pmol kullanarak) siRNA transfections iki tur gerçekleştirilen BMP4 / A / P ile hESC farklılaşma başlattıve RNA izolasyonu için hücreler toplanır. Kantitatif RT-PCR kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan genlerin biri için, yok etme etkisi belirlemek için etkili bir yöntemdir. RNA lncRHOXF1 19 kodlayıcı olmayan uzun bölgelere tamamlayıcı iki siRNA'lar kullanarak, lncRHOXF1 transkriptlerinin (Şekil 3A)% 80 demonte elde edilmiştir. Daha sonra, daha da farklılaşma gün 1, protein kodlayıcı gen hnRNP U, bir siRNA (25 pmol) transfekte edilmiş ve 2 iki ardışık transfections aşağıdaki hnRNP U transkript% 80 azalma gözlenmiştir. Nitro farklılaşmış trofoblast progenitör hücrelerinde doğal immün yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Bu Sendai virüsü kullanan 2 hücreleri 1 arasında bir MOI'da farklılaşma gün enfeksiyonları uygulandı ve viral inkübasyondan 8 saat sonra hücreler toplandı. QRT-PCR kullanarak, aktif viral pro işaret enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 3B), bol miktarda virüs proteini transkript (sev-NP) tespittrofoblastik hücrelerin pagation. Önemli olarak, enfekte edilmiş hücreler (MOI kullanarak = 1) görünümünü değiştirmek ve yaşayabilir olmayan (veriler gösterilmemiştir). Nitro türevi trofoblastik hücrelerin da plazmid DNA ile transfekte edilebilir. Biz bir GFP plazmid kullanarak transfections gerçekleştirilen ve bu farklılaşma 1 gün ve günde 3 BMP4 / A / P-tedavi hücrelerin içine inşa ve GFP ertesi gün (Şekil 4) için görüntülenmiştir tanıttı. Biz genellikle 24 saat sonrası transfeksiyon de% 30-50 transfeksiyon verimliliği elde etti. Sonuç olarak, nitro türevi trofoblastik hücrelerin gain- ve zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir.
Şekil 1: BMP4 / A / P ile erken trofoblastik hücrelerin insan pluripotent kök hücrelerinin in vitro türevleri. (A) BMP4 farklılaşma şematik BMP4 / A / P ile trofoblastik hücrelerin hPSCs arasında. (B) BMP4 / A / P farklılaşma d0, d2 ve d6 sırasında HUES9 hücrelerinin Temsilcisi parlak alan görüntüler. Ölçek çubuğu = 50 uM. ok uçları ayırt edilmez tek hücreli hESC belirtir. oklar farklılaşma sırasında morfolojik özellikleri vurgulamak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: BMP4 / A / P farklılaşma hızla Pluripotency işaretleyici nanog downregüle ve trofoblast genleri CDX2 ve KRT7 upregüle. NANOG (Pluripotency işaretleyici), CDX2 ve KRT7 (trofoblast belirteçleri) için Mah-PCR analizi. değerler üçlü önlemlerinden ortalamasıdır. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Gen bozma ve in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelerin kullanılarak viral enfeksiyon. (A) hESC QRT-PCR analizi (HUES9) farklılaştırılmış ve daha sonra RNA lncRHOXF1 (solda) ya da iki gün üst üste protein kodlayıcı gen hnRNP U (sağda) kodlamayan, uzun özel siRNA'lar ile transfekte. demonte verimlilik (KD), tipik olarak% 70-80, ve bir transfeksiyon deneyinde elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. (B) 8 saat Sendai virüsü ile enfekte farklılaşma gün 2 trofoblastik hücrelerin Sendai viral protein transkript QRT-PCR analizi (İçişleri Bakanlığı 1 =). Hata çubukları SEM'i belirtir."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelere giriş plazmidinin DNA. farklılaşma Gün 1 ve Gün 3 trofoektoderm projenitör hücrelerine GFP plazmidi DNA transfeksiyonu, ertesi gün görüntülendi. Ölçek çubuğu = 50 uM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi, koryokarsinom hücre hatları ve extravillous trofoblast hücre çizgileri kullanılarak mümkün değildir belirli alt soy e trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını araştırmak için yararlıdır. Nitro türevi trofoblastik hücrelerin, aynı zamanda siRNA'lar 19 ile zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir. Buna ek olarak, HESC ya hiPSCs genetik transgen endüklenebilir ifadesi için değiştirilebilir ES 19 ya da endojen loci 20 de haberci genlerin sokulması için ve bu hücreler de burada tarif edilen koşullar kullanılarak trofoblastik hücrelerin içine ayırt edilebilir.
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
HESC trofoblastik progenitör hücreleri elde etmek CM farklılaşma ortamından B-FGF (FGF2) atlamak için zorunludur. Kültür ortamı içinde BMP4 ile birlikte B-FGF varlığı mezoderm ve endoderm atalarıdır 16 ifadesini artırır. Trofoblast farklılaşma ortamında B-FGF dahil güncel bir çalışmada BMP4 aracılı farklılaşma yerine trofoblastlar 21 mezoderm ve endoderm hücreleri üretir bulundu açıklamak inanılmaktadır. Birlikte Aktivin A ve BMP4 B-FGF endoderm ve mezoderm farklılaşma doza bağımlı bir şekilde 22 teşvik o, köklü birs = "xref"> 23. Fare, epiblast, ilkel trofoblast gelişimi ve ilkel endoderm soylar FGF sinyal yollarının 24 bağlıdır. BMP4 farklılaşma 21, 25 sağlamak için kullanıldığı zaman hESC ayırt olarak, B-FGF'nin neden olduğu sinyal mezoderm oluşumu için gereklidir. Bunun aksine, BMP4 ile birlikte, her iki FGF ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının engellenmesi, HESC türevi trofoblast progenitörlerinin syn oluşmasını teşvik eder ve mezoderm ve ilkel endoderm progenitörlerin 26 oluşumunu önler.
Tekniğin Sınırlamalar
trofoblast atalarıdır için hPSC farklılaşma bu protokol ile en tipik sorun MEFS üzerinde hESC veya hiPSCs bir baskın farklılaşmamış nüfusu ile başlayan ile ilişkilidir. hPSCs hem iç hem de dış kenarlarında farklılaşmış hücreleri birikir içinKolonilerin, günlük farklılaşma miktarını izlemek için ve farklılaşmış koloniler (veya koloniler kısımlarını) kaldırmak için önemlidir. farklılaşmış hücrelerin varlığı hücreleri, hücre-dışı matrise transfer edilir, özellikle farklılaşma sürecine karmaşık hale getirebilir. farklılaşmış hücrelerin hızla CM huzurunda dışı matris üzerinde çoğalacak ve bu hücreler hızla kültürü devralmak ve hPSCs dışı yarışacak. Nedenle, ekstraselüler matriks hücreleri aktarmadan önce MEFS yetişen hPSCs sağlıklı, farklılaşmamış koloniler ile başlamak idealdir.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Bu farklılaşma protokolünü kullanırken, elde edilen trofoblast ataları hücre tipleri heterojen bir karışımıdır. Trofoblastlar villöz sitotrofoblastlar, sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous sitotrofoblastlar oluşmaktadır(EVTs) 27. Villöz sitotrofoblastlar EVTs ve SYN isteklerini elde atalarıdır. BMP4 diferansiye hPSCs plasental özel markörlerin gen ya da proteinin sentezlenmesi ile tanımlanmıştır villöz sitotrofoblastlar, Syns ve EVTs 9, 15, bir karışımını oluşturur. Tat farklılaşma yolları HLA-G salgılanmasının (EVTs karakteristik) veya (Syns den), insan koriyonik gonadotropin 28, 29 ile ayırt edilebilir. Son zamanlarda, düğüm Aktivin / sinyallemesinin engellenmesi hESC EVT farklılaşmasını yana ve bu inhibisyon çıkarılması SYN 17 farklılaşmasını yana olduğu gösterilmiştir. Nitekim, bir önceki yayın hESC ayırt etmek tek başına BMP4 kullanarak SYN hücreleri 26 çoğunlukla üretir bulundu. BMP4 / A / P ve klimalı ortam (B-FGF eksik) kullanarak veriler, oradaEVT ve farklılaşma 5. günde, saf EVT ya EŞZ popülasyonları EVTs izolasyonu için boncuk konjüge edilmiş HLA-G gibi hücre yüzeyi işaretçileri kullanılarak ilave saflaştırma arzu edilirse, 29 mümkün göre, mevcut EŞZ hücreleri her ikisi de. Sonuç olarak, burada tarif edilen kültür yöntemi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hPSCs gelen trofoblastik hücrelerin önemli miktarlarda üretmek için etkili bir yoldur. Bu protokol, SYN isteklerini ve EVTs hem ürettiğinden erken insan plasenta incelenmesi için uygun bir model sistem. Bu hücreler, ilaç keşfi ve genetik mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
