Abstract
Geïnspireerd op het succes van eerdere kanker nanomedicijnen in de kliniek hebben onderzoekers een groot aantal nieuwe formuleringen in het afgelopen decennium gegenereerd. Echter, slechts een klein aantal van nanomedicijnen goedgekeurd voor klinisch gebruik, terwijl de meerderheid van nanomedicijnen onder klinische ontwikkeling teleurstellende resultaten hebben opgeleverd. Een belangrijk obstakel voor de succesvolle klinische toepassing van nieuwe kanker nanomedicijnen is het ontbreken van een duidelijk inzicht de in vivo prestatie. Dit artikel heeft een strenge procedure voor het in vivo gedrag van nanomedicijnen in tumordragende muizen systemische, weefsel, eencellige en subcellulaire niveaus karakteriseren via de integratie van positron emissie tomografie computed tomography (PET-CT), radioactiviteit kwantificatiemethoden flowcytometrie en fluorescentie microscopie. Met deze aanpak kunnen onderzoekers nauwkeurig evalueren roman nanoschaal formuleringen in de relevante muismodellen van Cancer. Deze protocollen kunnen de mogelijkheid om de meest veelbelovende kanker nanomedicijnen identificeren met een hoog translationeel potentiële of om te helpen bij de optimalisatie van kanker nanomedicijnen voor toekomstige vertaling hebben.
Introduction
Nanogeneeskunde verschuift het paradigma van de behandeling van kanker ontwikkeling 1. Geïnspireerd door de enorme klinische impact van eerdere kanker nanomedicijnen, zoals liposome- en albumine-based nanotherapies 2, 3, hebben veel nieuwe formuleringen geproduceerd in het afgelopen decennium. Uit recente analyses van de eerste klinische succes van deze kanker nanomedicijnen geven aan dat slechts enkele daarvan zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik 4, 5. Een belangrijk obstakel voor de klinische toepassing van nieuwe kanker nanomedicijnen is hun beperkte verbetering van de therapeutische index vergeleken met de directe toediening van het vrije therapeutische verbindingen 6. Als zodanig nauwkeurige evaluatie van de in vivo prestatie van nanomedicijnen op systemische, weefsel en cellulaire niveaus in preklinische diermodellen essentieel identify mensen met een optimale therapeutische indices voor toekomstige klinische vertaling.
Nanomaterialen kunnen radioactief gemerkte voor de kwantitatieve karakterisering in levende dieren met een positron emissie tomografie (PET) beeldvorming, die uitstekende gevoeligheid en reproduceerbaarheid van alle klinische beeldvormende modaliteiten 7 heeft zijn. Bijvoorbeeld 89 Zr-gelabelde langdurig circulerende nanomedicijnen zijn gekarakteriseerd in muismodellen van kanker 8, 9, 10, en in andere ziektemodellen 11. Bovendien kan de bloed halfwaardetijd en biodistributie van het nanogeneesmiddelen uitgebreid geëvalueerd door ex vivo radioactiviteit gemeten in afzonderlijke weefsels 8. Daarom radioactief zorgt voor de kwantitatieve evaluatie van nanomedicijnen bij systemische en weefsel niveaus.
Belangrijker radiolabeled nanomedicijnen algemeen niet bij de enkele-cel of subcellulaire niveaus kan worden geanalyseerd door de beperkte ruimtelijke resolutie van het radioactieve signaal. Daarom fluorescentielabelling blijkt een complementaire modaliteit voor de evaluatie van nanodeeltjes met optische beeldvormingstechnieken zoals flowcytometrie en fluorescentie microscopie 12 zijn. Hiertoe kunnen nanodeeltjes gemerkt met radio-isotopen en fluorescerende labels kwantitatief in vivo worden beoordeeld door nucleaire beeldvorming en ex vivo door telling van radioactiviteit, en ze kunnen ook uitgebreid worden gekarakteriseerd op cellulair niveau optische beeldvorming.
Eerder hebben we modulaire procedures ontwikkeld om radioactieve en fluorescerende labels nemen in verschillende nanodeeltjes, waaronder high-density lipoproteïne (HDL) 11 liposomen 9, 10, polymere nanodeeltjes, antilichaamfragmenten en nanoemulsions 10, 13. Deze gelabelde nanodeeltjes hebben geleid tot kwantitatieve karakterisering in relevante diermodellen op verschillende niveaus, waarbij de optimalisatie van deze nanomaterialen geleid voor hun specifieke toepassingen. In de huidige studie, het doel is liposomaal nanodeeltjes the gebruiken meest gevestigde nanomedicine platform 14 -als voorbeeld uitgebreide procedures tonen een duaal-gelabelde nanodeeltjes genereren en karakteriseren grondig in een klassieke syngene melanoom B16-F10 muismodel 15 . Uit de resultaten, we zijn ervan overtuigd dat deze karakterisering van nanodeeltjes aanpak kan worden aangepast aan andere kanker nanomedicijnen in relevante muismodellen te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedure bestaat uit de dubbele radioactieve en fluorescente labeling van nanodeeltjes, in vivo PET-CT-beeldvorming, ex vivo biodistributie metingen en ex vivo immunokleuring en flowcytometrie analyse. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Voorbereiding van de Dual-gelabelde liposomen
OPMERKING: Syngene B16 melanoma tumoren worden geïnduceerd door injectie van 300.000 B16-F10 cellen in de achterkant flanken van C57BL / 6 muizen onder narcose het inhaleren 2% -isoflurane bevattende zuurstof. Gebruik steriele reagentia en instrumenten steriel werkruimte tijdens de operatie. Na de operatie zorgvuldig te observeren de dieren tot hun herstel van anesthesie. Zet de dieren terug in hun kooien alleen wanneer ze volledig bewustzijn en mobiliteit te herwinnen. Huisvesten ze in steriele kamers voor dieren met xenogetransplanteerde tumoren. Tumoren met een groottevan 300 mm 3 zijn ideaal voor karakterisering van nanodeeltjes vanwege hun uitgesproken verhoogde permeabiliteit en retentie effecten (EPR), die nanodeeltjes accumulatie kan verhogen. De gedetailleerde protocollen worden hieronder gegeven.
- In een rondbodemkolf, los een mengsel van 20 mg lipiden in 2 ml chloroform dat 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phophocholine (DPPC), cholesterol, 1,2-sn disearoyl- -glycero- 3-fosfoethanolamine-poly (ethyleenglycol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamine (DSPE-DFO) 8, en 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonzuur ( DiIC12 [5] -DS) en molaire verhoudingen van 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% en 0,1% respectievelijk.
Opmerking: Dit lipidepreparaat is zeer vergelijkbaar met de liposomale formulering van doxorubicine momenteel in de kliniek 2. De resulterende liposomen van onze procedure zal nauw bootsen de in vivo prestatie van de klinische nanomedicine. - Gebruik een rotatieverdamper het organische oplosmiddel te verwijderen en een dunne lipide film bij kamertemperatuur. Voeg 20 ml PBS en ultrasone trillingen gedurende 30 min tot liposomaal nanodeeltjes genereren door een 3,8-mm ultrasoonapparaat tip en een amplitude van 30 W, met voldoende koeling op ijs.
- Centrifugeer het liposoom oplossing bij 4000 xg gedurende 10 min op de aggregaten van de nanodeeltjes met PBS middels centrifugale filtratie (molecuulgewicht cut-off (MWCO verwijderen en wassen: 100 kDa) om vrije lipiden en resterende organische oplosmiddel te verwijderen de liposomen concentraat stellen die. blijven in de bovenste kamer, en overbrengen naar een nieuwe buis. de liposomen kunnen in een koelkast in PBS worden bewaard tot 1 week voor de volgende stappen.
- Voor kwaliteitscontrole, kenmerken de liposomen door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Specifiek, meng 50 pl liposomen met 950 gl PBS, en daarna het mengsel over in de dimensionering cuvette. Plaats de cuvette in de analyzer en meet het deeltjematen en hun grootteverdeling. De deeltjesgrootte en de grootteverdeling (polydispersiteitsindex (PDI)) naar verwachting 90 zijn - 120 nm en 0,1 - 0,2 respectievelijk.
- Voor radiolabeling, meng de gezuiverde liposomen, overeenkomend met 2 mg lipiden in PBS bij een pH tussen 6,9 en 7,1 met 1 mCi 89 Zr-oxalaat bij 37 ° C gedurende 2 h in een 1,5 ml buis (totaal volume: ~ 100 ui). Verwijder de vrije, ongereageerde 89 Zr door centrifugale filtratie (MWCO = 100 kDa), zoals in stap 1,3. Was het retentaat met steriele PBS en vul het aan het gewenste volume. 95% - de radiochemische opbrengst moet 80 zijn.
VOORZICHTIGHEID! Het werken met radioactieve stoffen is sterk gereguleerd. Instellingen moeten worden gecertificeerd en voorzien van de nodige faciliteiten, opleiding van personeel, en een strikte controle van de radioactiviteit gebruik. Onderzoekers moeten passende opleiding krijgen en draag persoonlijke beschermingsmiddelen en dosimetrie ringen / badges bij het hanteren van radioactiviteit. - Na radiolabeling, bepalen de grootte van de nanodeeltjes door middel van dynamische lichtverstrooiing. De grootte en de PDI zullen naar verwachting binnen hetzelfde bereik als de metingen in stap 1.4 10.
LET OP: Als radioactieve monsters niet zijn toegestaan in de flowcytometer of fluorescentie microscoop, kunnen niet-radioactieve nat Zr-oxalaat worden gebruikt om liposomen te labelen in stap 1.5. Deze niet-radioactieve liposomen dezelfde kenmerken als hun radioactieve analoga. Een voorstelling van deze procedure is gegeven in Figuur 2.
2. In vivo PET-CT-beeldvorming en Biodistribution van Dual-gelabelde liposomen
- Injecteer 100 ui van duaal-gelabelde liposomen wet ongeveer 300 uCi radioactiviteit in tegengehouden melanoma muizen (C57BL / 6, vrouwelijk, 10 - 16 weken oud) door hun staart aderen, ongeveer 10 mCi 89 Zr / kg lichaamsgewicht.
- Om de halfwaardetijd te bepalen, trekt bloed uit de staartader van verdoofde dieren onder de 2% isofluraan-met zuurstof met behulp van 28-G insuline spuiten. Verzamel de bloed (10-20 ui) in vooraf gewogen buizen bij 2 min, 15 min, 1 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur en 48 uur na injectie. Weeg het bloed door verschil radioactiviteit te bepalen volgens een gammateller en bereken radioactiviteitsconcentratie als percentage geïnjecteerde dosis per gram (% ID / g).
OPMERKING: Voer de procedure uit in een kamer uitgerust met een anesthesie-systeem, het herstel kooien, verwarming en een biohazard kap. Zorg ervoor dat de dieren volledig te herstellen en krijgen normaal mobiliteit na de procedure voor het overzetten van herstel kooien met kooien. Huis-tumordragende dieren aangewezen ruimten dieren toegediendradioactieve materialen. - 24 of 48 uur na de injectie van de liposomen, imago van de muizen in een klein dier microPET-CT-scanner 10. Leg de verdoofde dier horizontaal op zijn buik en houd het verdoofde. Dien 2% isofluraan-zuurstof via een neuskegel. Toepassing oogzalf om zijn ogen voor de scan om te voorkomen dat ze uitdrogen.
- Voer een whole-body PET statische scan opname ten minste 50 miljoen samenvalt evenementen, met een duur van 15 minuten. Stel de energie en toeval timing raam op 350-700 keV en 6 ns, respectievelijk. Daarna, het uitvoeren van een 5-min computertomografie (CT) scan. Stel de röntgenbuis een spanning van 80 kV en een stroom van 500 uA; de CT-scan maakt gebruik van 120 rotatie stappen voor een totaal van 220 graden, met ongeveer 145 ms per frame 10.
- Na de PET-CT-scan, onmiddellijk te offeren de muizen door kooldioxide stikken en bevestig de dood door pinching de poten van de dieren. Eenmaal bevestigd, uit te voeren cervicale dislocaties.
- Verwijder het bloed in muisweefsels door eerst opensnijden van het rechteratrium en het injecteren van 20 ml PBS in de linker ventrikel, en vervolgens de relevante weefsels zoals tumoren, lever, milt, longen, nieren, spieren en andere 16 verzamelen.
- Weeg de weefsels, de radioactiviteitsinhoud door gamma telling 8, 9 meet en berekent het weefsel radioactiviteit accumulatie als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram (% ID / g).
3. Ex Vivo flowcytometrie en Immunokleuring
OPMERKING: Injecteer 100 ui fluorescerende liposomen in muizen melanoma via de staartader in een dosis van 0,5 mg kleurstof per kg lichaamsgewicht. Als radioactieve monsters niet zijn toegestaan in de flowcytometer en fluorescentie microscoop, moeten niet-radioactieve liposomen worden gebruikt.
- Offer de muizen 24 uur na injectie, zoals in stap 2,5, en het verzamelen van de tumoren, die moet worden opgeslagen in koude PBS.
- Voor flowcytometrie als volgt te werk 17:
- Bereid een enzym cocktail bestaande uit een mengsel van gezuiverd collagenase I en II (4 U / ml), hyaluronidase (60 U / ml) en DNase I (60 U / ml) in flowcytometrie buffer (PBS met 0,5% BSA en 1 mM EDTA).
- Meng 100 mg tumorweefsel met 200 pi enzym cocktail buffer in een 1,5 ml tube en snijd het weefsel in kleine stukjes met fijne schaar. Voeg nog 1,3 mL enzymcocktail in de buis en de inhoud ervan over een 6-wells plaat.
- Schud de 6-well plaat op een horizontale schudinrichting geplaatst in een 37 ° C oven gedurende 60 minuten bij 60 rpm.
- Was het weefsel homogenaat met flowcytometrie buffer 3 keer om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Vlekken op de cellen met een cocktail van antilichamen die specifiek zijn biomarkers waaronder CD45, CD11b, Ly6C, CD 11 c,CD64, CD3, MHCII en CD31 (1: 200 verdunning voor antilichamen kloon zijn verschaft in de materialen spreadsheet). Identificeer relevante celtypen en het bepalen van hun gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van DiIC12 (5) -DS in elke cel populatie met een passende flowcytometrie analyse software.
- Voor immunokleuring als volgt te werk:
- Plaats een tumor in een cassette gevuld met een optimale snij-medium (OCT) en bevriezen op droog ijs.
- Maak 6-um ingevroren secties van tumorweefsel en leg ze op histologie glasplaatjes; de onderdelen moeten op de grootste doorsneden van de tumor, waarbij de meest representatieve gegevens over het weefsel verschaffen.
- Vlekken op de biomarkers (bv CD31 voor endotheliale cellen) van belang met de overeenkomstige antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD31, kloon MEC13.3). Bevestig de secties met paraformaldehyde; blokkeren met serum overeenkomen met de soorten oorsprong van de secundaire antilichamen; incubat met primaire antilichamen gedurende 12 uur bij 4 ° C en daarna met secundaire antilichamen gedurende 2 uur; en tot slot, wassen met PBS en bedek met dekglaasjes. Afbeelding de gekleurde dia's met een Leica rechtopstaande confocale microscoop SP5 13, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een overzicht van de procedure. Figuur 2 toont schematisch de syntheseprocedure van de duaal-gelabelde liposomen in stap 1 10 beschreven. Figuur 3 toont een representatief PET-CT beeld (figuur 3a), radioactieve kwantificering van PET imaging (figuur 3b), bloed halfwaardetijd (figuur 3c) en biodistributie (figuur 3d) van radioactieve nanodeeltjes, zoals beschreven in stap 2. figuur 3a, de liposomen zeer ophopen in de tumor, die wordt bevestigd door de kwantificering van de beeldvormende resultaten in Figuur 3b. Verder liposomen tonen een bloed halfwaardetijd van ongeveer 10 uur in Figuur 3c. De ex vivo biologische verdeling bevestigt de hoge tumor accumulatie van liposomen. Tenslotte Figuur 4 geeft een typische gating procedure relevante cellen te identificeren in een tumor voor single-cell level onderzoek nanodeeltjes accumulatie (Figuur 4a en b), waarvoor de algemene opbouw van de nanodeeltjes in tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) geeft. Een afbeelding vertegenwoordiger confocale microscopie toont ook de overlap tussen de nanodeeltjes en endotheelcellen (Figuur 4c).
Figuur 1. Schematische weergave van de in vivo Nanomedicine karakterisering Procedure. Deze procedure omvat de etikettering van nanodeeltjes met zowel radioactieve en fluorescerende labels; de karakterisering van radioactief gelabelde nanodeeltjes met een PET-CT-beeldvorming, bloed halfwaardetijd metingen en biologische verdeling evaluaties; en de single-cell en sub-cellulaire analyse van fluorescente nanodeeltjes door middel van flowcytometrie en immunostaining respectievelijk. De technieken, van links naar rechts geven toenemende ruimtelijke resolutie van nanodeeltjes in vivo accumulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Synthese orde van Dual-gelabelde liposomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van in vivo karakterisering van radioactief gelabeld Nanodeeltjes. (a) PET-CT-beelden van een Tumor-dragende muizen met nanodeeltjes injectie en (b) PET-afgeleide opnamewaarden in meerdere weefsels (n = 3). (c) Bloed- radioactieve halfwaardetijd van een radioactief nanodeeltje, en (d) het biodistributie op 24 uur na injectie (n = 3). De fout bars zijn de standaarddeviatie. Gewijzigd ten opzichte van referentie-8, met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve resultaten van de in vivo karakterisering van TL-nanodeeltjes. (a) Een typische flowcytometrie gating procedure tumor geassocieerde immuun cellen, tumorcellen en endotheelcellen (EC), en (b) het kwantificeren van nanoparti identificerenkel accumulatie in deze cellen 8. Een representatief beeld van 3 biologische herhalingen. (c) image Vertegenwoordiger immunofluorescentie toont de specifieke targeting van een RGD-geconjugeerd nanoemulsion aan cellen in tumoren 13 endotheliale. Gewijzigd ten opzichte van referenties 8 en 13, met toestemming. Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol:
De hoge kwaliteit van duaal-gelabelde liposomen is de sleutel voor het produceren van consistente resultaten gedurende een lange periode. Gratis fluorescerende kleurstoffen of 89 Zr ionen kunnen totaal verschillende targeting patronen te genereren en moet volledig worden verwijderd tijdens de zuiveringsstap. Bovendien, als het immuunsysteem experimentele kanker nanomedicine prestaties aanzienlijk beïnvloedt het gebruik van immuuncompetente muismodellen de voorkeur verdienen, zoals de B16-F10 melanoma model in C57BL / 6 muizen, die in dit protocol werd gebruikt. Als de tumor micro-omgeving of een bepaalde combinatie van genetische veranderingen is een belangrijke factor zou patiënt afgeleide tumor xenograft modellen ideaal keuzes.
Wijziging en het oplossen van problemen:
Onze werkwijze biedt een eenvoudige en betrouwbare manier om de in vivo prestatie van nanomedicijnen in evaluatie van tumor-dragende eenij dieren. Deze procedure dient als ruggengraat specifieke experimenten bouwen om kanker nanomedicijnen karakteriseren voor verschillende toepassingen. Zo kunnen onderzoekers kwantitatieve in vivo farmacokinetiek van het nanomateriaal bij PET-CT scans worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen aan dezelfde dieren 17 bepalen; ze kunnen biodistributie informatie van nanomaterialen verzamelen door het analyseren van andere weefsels, zoals de dikke darm, dunne darm, pancreas, hersenen, huid, thymus, maag, of speekselklieren, zoals in andere publicaties 18, 19, 20, 21; of ze kunnen de single-cell en subcellulaire specificiteit van nanomedicijnen in andere dan tumoren relevante weefsels te beoordelen door cytometry toepassing van deze stroming en immunokleuring protocol.
Beperkingen van de Techniek:
Dit protocol requires enkele gespecialiseerde onderzoeksinfrastructuur-met inbegrip van radiochemie en imaging-faciliteiten en technische expertise in radiolabeling, kleine dieren imaging, en immunologie. Daarom zou het idealiter worden uitgevoerd door een multidisciplinair team van onderzoekers met expertise op de betrokken gebieden. Onze eigen ervaring leert dat de optimale uitvoering van deze procedure vereist een zorgvuldige planning en efficiënte samenwerking.
Het is vermeldenswaard dat de specifieke protocollen en voorgestelde middelen in dit manuscript beste geschikt voor radioactief merken op lipide gebaseerde nanopartikels. Echter, kan het concept van duaal-gelabelde nanodeeltjes worden gebruikt voor andere formuleringen die nanodeeltjes, bijvoorbeeld op basis van goud nanokristallen, polymeren of zelfs virale partikels te karakteriseren. In deze gevallen zullen verschillende labeling strategieën vereist. Het is belangrijk om de grote verscheidenheid van radioactieve isotopen gebruikt in biomedische beeldvorming benadrukken, zoals Zr 89, 18 64 Cu, 68Ga en 123I, om maar een paar 7. De keuze van de radio-isotoop moet worden gebaseerd op de specifieke eigenschappen van het nanomateriaal onderzochte, vooral de bloedsomloop halfwaardetijd, zodat een volledige karakterisering op latere tijdstippen. Ook andere factoren, zoals etikettering chemie of isotoop beschikbaarheid, kan de keuze beïnvloeden. Voor deze studie werd 89 Zr gekozen omdat de lange fysische halfwaardetijd (t 1/2 = 78,4 uur) is vergelijkbaar met het bloed halfwaardetijd van liposomen. Van de nota, kan dit protocol ook worden uitgevoerd met andere isotopen, zoals 99mTc, 111, of 125 I, dat in de handel verkrijgbaar en geschikt voor beeldvorming met SPECT-scan (SPECT) zijn. Evenzo DilC werd gekozen vanwege zijn hoge hydrofobiciteit en derhalve hoge belastingen efficiëntie in liposomen. Andere fluorescerende kleurstoffen met ongunstige fysisch-chemische properties kunnen direct worden geconjugeerd aan de 17 fosfolipiden.
Betekenis van de technieken:
Deze procedure geeft een hoge translationeel potentieel na aanpassing aan nanomedicijnen in klinische studies te evalueren. De 4 belangrijkste technieken, namelijk PET-CT-beeldvorming, radioactiviteit meten, flow cytometrie en immunohistochemie-worden routinematig gebruikt voor oncologische diagnose bij patiënten. Daarom kan deze preklinische procedure gemakkelijk worden vertaald naar de in vivo prestatie van nanomedicijnen in de klinische fase evalueren. Bovendien is de grotere omvang van menselijke organen in vergelijking met muizen maakt meer nauwkeurige analyse van PET-CT beeldvorming 22, waarbij de invasieve biopsie radioactiviteitsmeting van nanomedicine accumulatie kan vervangen. In deze instelling, niet-invasieve, imaging-geleide protocollen kunnen worden ontwikkeld om stratificeren patiënten en om te helpen homogeniseren patiëntresultaten 10. Developing radioactieve nanomaterialen vereist nog steeds een aanzienlijke investeringen in infrastructuur. Als alternatief kunnen niet-radioactieve beeldvormende technieken gebaseerd op magnetische resonantie beeldvorming (MRI) werden snel ontwikkelende in het afgelopen decennium. Bijvoorbeeld, magnetisch beeldvorming (MPI) gebruik kleine ijzeroxide nanodeeltjes (10 tot 20 nm) en kan veel meer kwantitatieve evaluatie van nanomedicijnen gelabeld met ijzeroxide nanodeeltjes in vivo dan de huidige MRI-technieken 23 verschaffen. Klinische toepassing van MPI kan er meer onderzoekers robuuster gebruiken in vivo beeldvorming technieken om de in vivo prestatie van kanker nanogeneesmiddelen evalueren.
Toekomstige toepassingen:
Zodra onderzoekers beheersing van deze protocollen, kunnen ze de procedures gelden voor de meeste fluorescente en radioactief duaal gelabelde, nieuwe materialen, zoals peptiden, proteïnen, antilichamen, antilichaamfragmenten, enzovoort karakteriseren. deze procedureskan wetenschappers helpen om de in vivo prestatie van nieuwe biomedische materialen grondig te evalueren en om mensen met een grote translationele potentieel te identificeren.
Tot slot willen we een uitgebreid nanomedicine karakterisering procedure die systemische, weefsel, eencellige en subcellulair niveau nanomedicine accumulatie informatie kunnen verschaffen introduceren. Momenteel is de meerderheid van kanker nanomedicijnen nog niet in fase I klinische proeven vanwege hun suboptimale farmacokinetiek, biologische distributies en toxiciteitsprofielen. Anderzijds, de grote heterogeniteit van de behandeling reactie op nanogeneeskunde machtigt gezelschap imaging strategie voor de selectie van patiënten die bijzonder kunnen profiteren van deze experimentele nanogeneesmiddelen. Wij zijn van mening dat de goedkeuring van deze procedure de gemeenschap kan helpen om veelbelovende nanomedicijnen met een hoog translationeel potentieel te identificeren in preklinische diermodellen en, met de juiste aanpassingen, kan ook helpen klinischeonderzoekers patiënten vatbaar nanotherapy identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avantilipids | 850355 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DSPE-PEG2000 | Avantilipids | 880120P | |
| DSPE-DFO | Home made | 110634 | Perez-Medina et al., JNM, 2014 |
| DiIC12[5]-DS | AAT Bioquest | 22051 | |
| Centrifugal filter | Vivaproducts | VS2061 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-100 | |
| Radio-HPLC | Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps | N/A | |
| 89Zr-oxalate | MSKCC | Synthesized in house | TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.) |
| Micro PET-CT | Siemens | Inveon Micro-PET/CT | |
| Gamma counter | PerkinElmer | 2470-0150 | |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Fortessa | Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | ||
| B16-YFP melanoma cells | Home made | N/A | Salmon et al., Immunity, 2016 |
| Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 | 128025 | Biolegend | |
| MHCII (M5/114/152)--APC | 107613 | Biolegend | |
| CD45 (30-F11)--BV510 | 103137 | Biolegend | |
| CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 | 139313 | Biolegend | |
| CD11b (M1/70)--BV605 | 101237 | Biolegend | |
| CD3 (17A2)--BV711 | 100241 | Biolegend | |
| CD31 (13.3)--PE | 561073 | Biolegend | |
| CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 | 117327 | BD Biosciences | |
| CD31 (13.3) no fluorophore | 550274 | BD Biosciences |
References
- Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
- Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
- Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
- Juliano, R.
- Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
- Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
- Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
- Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
- Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
- Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. , (2016).
- Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. , (2015).
- Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
- Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
- Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065 (2014).
- Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. , (2015).
- Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123 (2015).
- Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
- Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).
