Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.
Abstract
M osaic nalysis עם arker ג r epressible ell מ (MARCM) היא מערכת תיוג פסיפס חיובית כי כבר מיושמת באופן נרחב במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית לתאר מורפולוגיות מסובכות כדי לתפעל את הפונקציה של גנים תת קבוצות של נוירונים בתוך אחר לא מסומן ו שאנן אורגניזמים. פסיפסים גנטיים שנוצרו במערכת MARCM באים לידי ביטוי בתיווכם רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים ההומולוגיים בתוך חלוקת תאים מבשרים לייצור הן (שיבוטי MARCM) מסומן לתאים בת לא מסומנים במהלך מיטוזה. הארכת תוקפה של שיטת MARCM, MARCM תאום המקום שנקרא (tsMARCM), תוויות הן של תאי התאום נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים. טכניקה זו פותחה כדי לאפשר שהליפה של מידע שימושי משני-השושלות החמות. על ידי מקיף וניתוח זוגות שונים של שיבוטי tsMARCM, מערכת tsMARCM מתירה mappin שושלת עצבית ברזולוציה גבוההז כדי לחשוף את הלידה-הסדר המדויק של נוירונים שכותרתו מופק ובתאים משותפים. כמו כן, מערכת tsMARCM גם מרחיבה מחקרים לתפקד גנים על ידי מתיר הניתוח פנוטיפי של נוירונים זהים של בעלי חיים שונים. כאן אנו מתארים כיצד ליישם את מערכת tsMARCM כדי להקל על מחקרים של ההתפתחות העצבית תסיסנית.
Introduction
המוח, מורכב ממספר עצום וסוגים מגוונים של נוירונים, מעניק חיות עם היכולת לתפוש, תהליך, ולהגיב לאתגרים מהעולם החיצוני. נוירונים של המוח המרכזי תסיסנית המבוגר נגזרים ממספר מצומצם של תאי גזע עצביים, neuroblasts שנקרא (NBS), במהלך התפתחות 1, 2. רוב NBS המשתתפים neurogenesis המוח תסיסנית עוברים חלוקה סימטרית לייצר NBS עצמית חידוש תאים אמא גנגליון (GMCs), ואת GMCs ואז לעבור לעוד סיבוב של חלוקת לייצר שני לתאי הבת כי להתמיין נוירונים 3 (איור 1 א ). בגלל המורכבות של מורפולוגיה עצבית ואת האתגרים הקשורים בזיהוי נוירונים ספציפיים, טכנולוגית תיוג פסיפס חיובית, ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM), הומצא כדי לאפשר visualizatיון של נוירון בודד או קבוצה קטנה של נוירונים מתוך אוכלוסיית נוירונים שמסביב, ללא תווית 4.
MARCM מנצל את flippase (FLP) / היעד הכרה FLP (FRT) מערכת לתווך רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא המפריד מבשר נושאת אלל הטרוזיגוטיים של גן מדכא, שביטויים בדרך כלל מעכב את הביטוי של הגן הכתב 4. לאחר חלוקת mitotic, הכרומוזומים רקומביננטי מופרדים לתאים התאום, כך תא אחד מכיל אללים הומוזיגוטים של הגן מדכא והתא השני אין גן-the מדכא ביטוי של הכתב בתא כי (וצאצאיו) הוא כבר לא חסם 4. שלושה דפוסי המשובטים נמצאים בדרך כלל ניסוי MARCM כאשר FLP מושרה stochastically ב- NBS או GMCs: תא בודד ושני תאים-GMC שיבוטים, המתארים מורפולוגיה העצבית ב resolutio תא בודדn, ומשכפל רב התאי-NB, המגלה דפוסי מורפולוגיים כולו של נוירונים נגזרו NB משותף (איור 1 ב). טכניקת MARCM הוחלה נרחבת במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית, לרבות זיהוי סוג עצבי לשחזור רשתות חיווט-רחב מוח, שושלת עצבית ניתוחית לחשוף את ההיסטוריה ההתפתחותית של נוירונים, אפיון פנוטיפי של פונקציות גן מעורבות מפרט גורל תא, ומורפוגנזה עצבית והבחנה לומדת 5, 6, 7, 8, 9, 10. בגלל MARCM הקונבנציונלי רק תוויות אחד משני התאים הבת (שושלות) לאחר אירוע רקומבינציה mitotic המושרה, מידע שימושי פוטנציאלי מהצד המסומן הולך לאיבוד. מגבלה זו מונעת את היישום של M הבסיסימערכת ARCM כדי ברזולוציה גבוהה מנתח של שושלות עצביות רבות לעבור גורלות תא קצב מהיר או דיוק מנתח של פונקציות גן בנוירונים זהה של בעלי חיים שונים 11, 12.
Twin-spot MARCM (tsMARCM) הנו מערכת מתקדמת המאפשרים תוויות נוירונים נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים, אשר מאפשרת שחזור של מידע שימושי משני צידי תאי התאומים, ובכך להתגבר על המגבלה של מערכת MARCM המקורית 11 ( איור 2 א - 2C). במערכת tsMARCM, שתי התערבות RNA (RNAi) מבוססת מדכאי ממוקמים ב-אתרי טרנס של כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא מבשר, והביטוי של מדכאים אלה באופן עצמאי לעכב את הביטוי של העיתונאים שלהם (איור 2 ב). בעקבות רקומבינציה mitotic באתר ספציפי בתיווכם של מערכת FLP / FRT, את two מדכאים מבוססים RNAi להיות הפרדה לתאים התאום להתיר את הביטוי של עיתונאים נפרדים (איור 2 ב). שני דפוסים משובטים, תא בודד הקשורים שיבוטי תא בודד ושני תאים-GMC הקשורים שיבוטים רבים תאי-NB, נתפסים בדרך כלל בניסוי tsMARCM (איור 2 ג). מידע נגזר צד אחד של תאי התאומים יכול להיות מנוצל כהפניה עבור הצד השני, מה שמאפשר שושלת עצבית ברזולוציה גבוהה מנתח, כגון לידת היכרויות הנוירונים שכותרתו, פנוטיפי מנתח של נוירונים זהים בחיות שונות לחקירה המדויקת של תפקוד גן עצבי 11, 12. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול המתאר כיצד לערוך ניסוי tsMARCM, אשר ניתן להשתמש בהם על ידי מעבדות אחרות כדי להרחיב את לימודיהם של ההתפתחות העצבית (כמו גם התפתחות של רקמות אחרות, אם זה אפשרי) תסיסנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית tsMARCM המוכן זבובי שימוש החובה Transgenes 11, 13
- צור את הגרסה המקורית של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 11 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטיים רגילות זבוב, אשר תוארו בעבר, על ידי צבת transgenes המרובה באותו המניות לטוס 13.
- באחד קו הורי, להרכיב את transgenes של FRT 40A, כטב"מ- mCD8 :: GFP (הכתב הראשון, mCD8 :: GFP; ביטוי של transgene הוא תחת השליטה של אמרגן רצף הפעלה במעלה הזרם, אשר מייצרת עיתונאי קשור-קרום של העכבר מקבץ של חלבון בידול 8 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו כטב"מ-rCD2RNAi (להלן מדכא כי מעכב התבטאות הכתב השני, את RNAi נגד ביטוי o אשכול עכברושf בידול 2, rcd2) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מקום רקמות ספציפיות הנהג -GAL4 על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר.
- בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של 40A FRT, כטב"מ-rCD2 :: RFP (הכתב השני, rCD2 :: RFP; כתב הקרום קשור אחרים מורכבים של חלבון rCD2 התמזג עם חלבון פלואורסצנטי אדום), ו כטב"מ-GFPRNAi (את מדכא זה מעכב את הביטוי של ה- GFP :: mCD8, את RNAi נגד הביטוי של ה- GFP) על יד שמאל של כרומוזום 2 nd. מניחים-הלם חום (hs) -FLP או FLP specific--רקמה על X או 3 rd כרומוזום, במידת האפשר.
- צור את הגרסה החדשה של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט 14 (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטי רגילות זבוב, אשר תוארו previously, על ידי הצבת transgenes מרובים באותו מניות לטוס 13.
- באחד קו הורית, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב"מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (א transgene בשילוב של mCD8 :: GFP ואת מדכא כי מעכב התבטאות rCD2 :: RFP) ביחד באותו זרוע 2 nd או 3 rd כרומוזום (זוגות מתאימים של transgenes של FRT ו כטב"מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i מסומנים בטבלה 1). מניח נהג הרקמות הספציפי-GAL4 בכרומוזומים מלבד כרומוזום של אתר FRT הנבחר, אם אפשר.
- בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב"מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi (את הגן המשולב אחרים של rCD2 :: RFP ואת המדכא כי מעכב התבטאות mCD8 :: GFP) באותה הזרוע של כרומוזום 2 nd או 3 rd (זוגות מתאימים של transgenes של FRT כטב"מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi מסומנים בטבלה 1). מקום hs-FLP או רקמות ספציפיות-FLP על הכרומוזומים למעט כרומוזום של האתר FRT הנבחר, אם אפשר.
2. הצלב tsMARCM מוכן מתקיף צור tsMARCM המשובטים בקרב צאצאיהם"
- הצלב tsMARCM מוכן זבובים יחד (למשל, לשים 10-15 זבובים זכרים משלב 1.1.1 או 1.2.1 ו- 20-30 הנשי בתולה זבובים משלב 1.1.2 או 1.2.2 יחד) בבקבוקון מזון-fly עם טרי להדביק שמרים -made על הקיר של הבקבוקון.
- לשמור על זבובי tsMARCM המוכנים חצו במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לשפר את הסיכוי של הזדווגות לפני איסוף ביצים מופרות.
- לעתים קרובות להעביר את הזבובים tsMARCM המוכנים חצו לתוך צלוחיות yeasted הטרי כדי למנוע צפיפות (להקיש את הזבובים או להשתמש פחמן דו חמצני כדי להרדים את הזבובים כדי להקל על ההעברה; לשמור על לא יותר מ 80-100 ביצים מופרות בתוך מזון לטוס 10 מיליליטר דרךl להימנע מדי הזחלים בקעו).
- תרבות החיות tsMARCM (כלומר, ביצים מופרות; דוגמה של הגנוטיפ של חיות tsMARCM, כפי שמוצג באיור 3, הוא hs-FLP [22], w / w; כטב"מ- mCD8 :: GFP, כטב"מ-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / כטב"מ-rCD2 :: RFP, כטב"מ-GFPRNAi, 40A FRT; +; +) אשר נקבע ב הצלוחיות הועברו הסדרה של 25 מעלות צלזיוס עד שהם מפתחים לשלבים הרצויים (למשל, עובר, הזחלים, או גלמים).
- מניח את הבקבוקונים הועברו המכילים חיות tsMARCM באותו שלב התפתחותי כדי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10, 20, 30, 40, ו -50 דקות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי של הלם חום שגורם ביטוי של FLP על מנת ליצור את שיבוטים של עניין tsMARCM. דלג על שלב זה אם FLP רקמות specific- נמצא בשימוש בניסוי tsMARCM (hs-FLP היא מועדפת עבור שושלת עצבית מנתח; הסיבות להעדפה זו תוארו בעבר 15).
הערה: חזור על שלב 2.5 באמצעות הזמן האופטימלי של הלם חום בניסויים tsMARCM בעתיד אם יותר שיבוטים tsMARCM עניין מבוקשים; בדרך כלל, ביטוי FLP יותר מושרה hs-FLP [22] לעומת hs-FLP [1] עם הזמן חום הלם אותו. - תרבות החיות tsMARCM-בהלם חום של 25 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחותי המתאים, ולאחר מכן המשך לשלב 3.
3. כן, כתם, מוח טס הר המכיל tsMARCM המשובטים
- הכינו מאכלים מלקחיים-הגנה. מערבבים חלק (30 גרם) וחלק ב '(3 גרם) של ערכת אלסטומר סיליקון עם פחם פעיל (0.25 גרם). יוצקים את התערובת לתוך מנות המתאימות.
- לנתח זחל, גלמים או מוחות בוגרים מתוך חי tsMARCM המלוחים פוספט שנאגר 1x (PBS) באמצעות מלקחיים על צלחת מלקחיים-הגנה מוצגת באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הערה: פרוטוקול לנתיחת מוח לטוס כבר יורדתribed בעבר 16.
- תקן את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית עם PBS 1x המכיל פורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לעבד את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית זה לשארית המדרגות.
- שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT (PBS 1x המכיל 1% Triton X-100) ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד PBT 1% (לשטוף: להסיר PBT ולהוסיף PBT חדשים במהירות; לשטוף: להסיר PBT, להוסיף חדשים PBT, דגירת מוח הזבוב בתוך PBT החדש באמצעות שייקר מסלולית).
- דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים ראשוניים הוא עכברוש נוגדן אנטי CD8 (1: 100), נוגדן אנטי DsRed ארנב (1: 800), ועכבר אנטי Bruchpilot (BRP) נוגדנים (1:50) ב 1% PBT המכיל 5% נסיוב עז נורמלי (NGS).
- שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT.
- שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. הר אותם בשקופית מיקרו עם מגיב אנטי מרווה. שים כוס כיסוי מיקרו בשקופית מיקרו לכסות ולהגן על המוח זבוב. חותם את הקצוות של השקופית זכוכית מיקרו כיסוי מיקרו באמצעות לק ברור. אחסן רכוב אלה וחתומים לטוס דגימות מוח על 4 מעלות צלזיוס.
4. קחו, תהליך, ולנתח תמונות פלורסנט משובטים tsMARCM
- צלמו תמונות הניאון של fr שיבוטים tsMARCMאום הדגימות שנוצרו בשלב 3.8 באמצעות מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה.
- ערימות הפרויקט של תמונות ניאון confocal tsMARCM לתוך דו מימדי, שטוח התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מסופק עם מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה (ראה איור 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, ו 3Q - 3T לדוגמאות של בברוטליות תמונות ניאון confocal).
- לספור את מספר הסלולרי של הצדדים רב תאיים-NB של שיבוטים tsMARCM באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (למשל, הפונקציה "מונה תא" ב ImageJ 17; ראה 3E איור, 3J, 3O, ו 3T לדוגמאות של התא גופות נוירונים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת tsMARCM נעשה שימוש כדי להקל על שושלת עצבית מנתח ומחקרי תפקוד הגן באמצעות אחזור מידע חשוב על נוירונים נגזרו NBS המשותף. המערכת נעשתה שימוש כדי לזהות את רוב (אם לא כל) סוגי נוירונים, לקבוע את המספר הסלולרי של כל סוג עצבי, ותוודא הלידה מהסדר של נוירונים אלה 11, 12, 18 (ראה פרטים בפרק הדיון לקבלת פרטים אודות שימוש tsMARCM כדי לנהל שושלת עצבית מנתח או מחקרי תפקוד גן). כאן, אנחנו השתמשנו בארבעה שיבוטי tsMARCM של נוירונים הקרנת הרחת anterodorsal (adPNs בשושלת העצבית ALad1 של מערכת ההרחה תסיסנית) שכותרתו עם GAL4-GH146 כמו דוגמאות כדי להמחיש כיצד לערוך ניסוי 1 tsMARCM, 2. לאחר ביטוי FLP הושרה בשלב העוברי, סיngle, ירוק VL2p adPN הקשורים 45 adPNs מגנטה זוהה שיבוט tsMARCM (איור 3 א - 3E). לעומת זאת, כאשר FLP הושר מאוחר יותר, בשלבי זחל שונים, יחיד, adPNs הירוק (DL1 adPN או DC3 adPN) או לא-GH146 + adPNs הקשורים מספרים שונים של adPNs מגנט (31, 21, או 15) נצפו שלושה האחרים שיבוטים tsMARCM (איור 3F - 3T). לידתה של VL2p adPNs לפני יום הלידה של DL1-, DC3- ואין-GH146 + -adPNs נקבעה על ידי ספירת המספרים הסלולריים של adPNs ב הצדדים רב התאי-NB הקשורים בם של שיבוטי tsMARCM (45, 31, 21, ו -15 באיור 3E, 3J, 3O, ו 3T, בהתאמה). בנוסף לספירת המספרים הסלולריים, את המורכבות של אקסונלית ודפוסי הדנדריטים הצדדים הרב התאי-NB של שיבוטי tsMARCM ניתן להשתמש כדי לקבוע את הלידה-הסדר היחסי של הצדדים שני תאים-GMC הקשורים בם שלשיבוטי tsMARCM. שיבוטי פסיפס המושרים בשלבים התפתחותיים מוקדם בדרך כלל מכילים יותר נוירונים ובכך יש אקסונלית מורכבת יותר ודפוסי הדנדריטים, ואילו שיבוטי פסיפס המושרים בשלבי התפתחותיים מאוחר מכילים נוירונים פחות ולכן יש דפוסי axonal ו הדנדריטים פחות מורכבים (איור 3 ג - 3D, 3H - 3I , 3M - 3N, ו 3R - 3S).
איור 1: איורי סכמטי הנוירוגנזה תסיסנית ואת שלושת הסוגים של תבניות משובטות נמצאים בניסוי MARCM. (א) neurogenesis סכמטי תרשים סכמטי המתאר בשושלות העצביות ביותר של המוח המרכזי תסיסנית: neuroblasts (NBS) עובר חלוקה סימטרית ליצור NBS העצמית חידוש תאי אמא גנגליון (GMCs), ו GMCs לחלק עוד פעם אחת כדי לייצר שני נוירונים הבת (NS). (ב) שלושה דפוסי המשובטים הם נצפו בניסוי MARCM: שיבוטים-תא בודד (א), כאשר flippase (FLP) מושרה GMCs, ומשכפל שני תאים-GMC (ב) ו- שיבוטים רב תאיים-NB (ג ), כאשר FLP מושרה nBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דיאגרמות סכמטי של מערכת tsMARCM. (א) זבובים tsMARCM מוכן: זבוב הורים אחד מכיל transgenes של אתר FRT ו כטב"מ-mCD8 :: GFP (הכתב הראשון), כטב"מ-rCD2RNAi (להלן מדכא הראשון אשר מעכב את הביטוי של עיתונאי השני), וכן רקמות -specific -GAL4; לטוס הורים אחרים מכיל FRT כטב"מ-rCD2 :: RFP (הכתב השני), כטב"מ-GFPRNAi (להלן מדכא השני כי מעכב התבטאות של הכתב הראשון), ו HS-FLP. (ב) הנוכחות של שני משתיקים מבוססים RNAi ב הצאצאים של הזבובים tsMARCM המוכנים חצו מעכב התבטאות הכתבים (כלומר, mCD8 :: GFP ו rCD2 :: RFP בשלבי G1 ו G2 של לוח ב '). הביטוי של FLP הוא מושרה על ידי חום בהלם, FLP אז מתווכת רקומבינציה האתר ספציפי של כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא מבשר המפריד על קשירת מטרות הכרת FLP (FRTs). התוצאה היא הפרדה של המדכאים המבוססים RNAi בתאי התאום לאחר חלוקת mitotic להתיר את הביטוי של עיתונאים ברורים. (C) שני דפוסים המשובטים הם נצפו בניסוי tsMARCM: תא בודד, הקשורים שיבוטי תא בודד (א) כאשר FLP מושרה GMCs, ושני תאים-GMC, הקשורים שיבוטים רבים תאי-NB(ב) כאשר FLP מושרה NBS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: שימוש ארבעה שיבוטים tsMARCM של adPNs כדוגמאות איך לערוך ניסוי tsMARCM בניתוח השושלת עצבית. ארבעה שיבוטים tsMARCM של adPNs מומחשים, עם דיאגרמות של דפוסי נוירוגנזה שלהם (A, F, K, ו- P); תמונות confocal של המוח הכולל (B, G, L, ו- Q), מראה את הצופר לרוחב (LH; C, H, M, ו- R), האונה מחושים (AL; D, I, N, ו- S) ו סומה(E, J, O, T); ואת דפוסי המורפולוגיות שלהם העצביות. adPNs הרווק (VL2p, DL1, DC3, ולא-GH146 + adPNs; ירוק) קשור רב תאי-NB adPNs (מג'נטה) של שיבוטי tsMARCM נגזר על ידי האינדוקציה של FLP לתווך רקומבינציה mitotic ב NB adPN בבית העוברי (A - E) ו זחל - שלבים (F T). שים לב adPNs האחד-השושלות החמות בשושלת העצבית ALad1, שתוצאתה שיבוטי tsMARCM של adPN יחיד, ירוק הקשורים adPNs מגנט באיור 3 (מסיבות לא ידועות, נוירונים מן השושלת החמה השנייה של עצבית ALad1 שושלת למות). לידתה-סדר VL2p, DL1, DC3, ולא-GH146 + adPNs נקבע על ידי ספירת המספרים הסלולריים של adPNs בצד רב התאי-NB מגנט של שיבוטי tsMARCM (45, 31, 21, ו -15 בתוך מקווקו שורות של לוחות E, J, O, T). דפוסי neurite הם בדרך כלל יותר מורכבים הצדדים רב תאיים-NB מגנטה כאשר שיבוטים tsMARCM הם המושרה בשלבים התפתחותיים מוקדם (למשל, דפוס הדנדריטים הוא יותר מורכב פאנל E לעומת לוחות I, N, ו- S). tsMARCM מנתח לפעמים מבלבלים כאשר נוירונים של שושלות עצביות אחרות גם מסומנים על ידי אותו הנהג GAL4 (למשל, הנוירונים LH ירוק, שמוצג על ידי לחיצה כפולה חיצים, לחסום את להדמיה של דפוס שכלול axonal של adPNs VL2p בפאנלים B ו- C) . neuropiles המוח (בכחול) הוכתמו נוגדנים נגד Bruchpilot (BRP). זמן חום הלם: 12 דק '(לוחות A - E), 15 דקות (לוחות F - J), ו -35 דקות (לוחות K - T). בר סולם ב 'לוחות -
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
צעדים 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, ו -3.2 הם קריטיים להשגת תוצאות tsMARCM טובות. רקמות ספציפיות נהגי -GAL4 כי אינו מבטא GAL4 ב אבות עצביים הם העדיפו צעדים 1.1.1 1.2.1. הימנע צפיפות גדולה החיות גדלו צלוחיות-אוכל לטוס בשלב 2.3. מכיוון חביון האינדוקציה, את רמת הביטוי של FLP אפון-הלם חום, ובפעם המפריד הממוצעת של אבות עצביים (כלומר, NBS ו GMCs) אינם ידועים, עדיף לגוון את הזמן החום-הלם (10, 20, 30 , 40, ו -50 דק ') על מדגמים שונים של גנוטיפ זהה ואת השלב ההתפתחותי בשלב 2.5. זה יאפשר קביעת הזמן חום הלם האופטימלי כדי להשיג את היחס הטוב ביותר של שיבוטי tsMARCM עניין. בנוסף, יש להיזהר במהלך דיסקציה מוח לטוס בשלב 3.2 כדי להשיג דגימות במוח שלמות; זה הנו קריטי לספור מספרי תאים עצביים במדויק. עבור reseקשתים המעוניינים באמצעות tsMARCM ללימוד הפונקציה של גנים על כרומוזום נשק אחר (למשל, 2R, 3L, ו 3R), זבובי tsMARCM מוכנים צריכים להתגודד כמו בשלב 1.2 ידי בחירת זוגות מתאימים של transgenes של FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i, ו כטב"מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi, אשר מסומנים בטבלה 1. גם אנו ממליצים כי נקבות הזבוב מוכנים tsMARCM לשאת hs-FLP על כרומוזום X (למשל, hs-FLP [22], w; כטב"מ-rCD2 :: RFP, כטב"מ-GFPRNAi, 40A FRT; +; +), אשר מקלת ניסויי tsMARCM חזרו.
שינויים, פתרון בעיות, ומגבלות של הטכניקה
יעילות perdurance של מדכאי RNAi וכתבים הם הגורמים העיקריים אם שושלת עצבית מנתח ומחקרי תפקוד הגן ניתן לבצע בהצלחה בניסויי tsMARCM. באופן כללי, שילוב של perdurance הנמוכה של מדכאי RNAi וכתבים נגזרו אבות עצביים, יחד עם הביטוי הגבוה של מדכאי RNAi וכתבים בנוירונים שלאחר mitotic, מתירים תוצאות tsMARCM טובות יותר. בגלל בעת מדכאי RNAi והכתבים נשלטת על ידי נהגי GAL4, חוקרים צריכים לבחור נהגי GAL4 חזקים המבטאים GAL4 בנוירונים בדיל אך לא אבות עצביים. לדוגמה, GAL4-OK107 הוא נהג GAL4 חזק המבטא GAL4 בגוף פטריות (MB) אבות ותולדותיהם, γ MB, α '/ β', ו α / β נוירונים 11, 19. תיוג Unfaithful של נוירונים γ MB נצפה בשני דפוסי משובטים (כלומר, תא בודד הקשורים שיבוטי תא בודד ושני תאים-GMC הקשורים שיבוטים רב התאי-NB) כאשר GAL4-OK107 שמש בניסויי tsMARCM 11 . מעניין לציין, שיש את הבעיה הנ"ל ניתן לפתור באמצעות MB247-GAL4, נהג GAL4 MB שונההמבטא GAL4 בנוירונים MB הבדיל 11.
לא כל מנהלי GAL4 ניתן להשתמש במערכת tsMARCM או במערכות תיוג פסיפס אחרים (למשל, MARCM, Q-MARCM, גנרטור התאום-spot) 4, 20, 21 אם הנהג אינו מתבטא בתאי העצב של עניין. לכן, לפני שימוש tsMARCM עבור שושלת עצבית ניתוחי, נהגה GAL4 צריך להיבדק על הסיקור שלהם של נוירונים של עניין MARCM כפול ביטוי השליט עם נהג פאן תאים (למשל, אמרגן-LexA טובולין :: GAD) 22 . נציין כי שיבוטי tsMARCM לפעמים לא ניתן לנתח באופן חד משמעי, במיוחד כאשר נהג GAL4 עם דפוס ביטוי עצבי מורכב משמש (למשל, קרן לרוחב ירוקה (LH) נוירונים למנוע להדמיה ברורה של המבנה שכלול axonal של VL2p adPN באיור 3 ב ו
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
מלבד tsMARCM, גנרטור התאום ספוט מצמידים MARCM היה גם, לפחות בתיאוריה, לאפשר הדמיה שלנוירונים נגזרו אבות עצביים משותפים בשני צבעים שונים (השוואה של שלוש טכנולוגיות תיוג פסיפס אלה הוצגו בעבר 15). המספר המינימאלי של transgenes הנדרש להרכבת גנרטור התאום-spot, את הגרסה המקורית של tsMARCM (או את הגרסה החדשה של tsMARCM), ו MARCM המצמיד הוא 4, 8 (או 6), ו -9, בהתאמה. עם זאת, tsMARCM היא המערכת היחידה כי נעשה שימוש כדי לנהל שושלת עצבית מקיפה מנתח 12, 15, 18, 23. רקומבינציה ספציפי אתר אכן מתרחש בתאים שאינם mitotic במערכת גנרטור תאום המקום, וזה מוביל את שיתוף הביטוי של שני הכתבים באותו התא, מה שהופך אותו מאתגר להשתמש במערכת זו כדי לחקור את הפיתוח של המרכזים 15 מערכת העצבים. לעומת זאת, שיבוטים פסיפס שהושגו tsMARCM ומערכות MARCM מצמידיםמחדש שמקורם בתאי mitotic. עם זאת, מכיוון שמערכת MARCM המצמידה דורשת שני נהגים עצמאיים לשלוט הביטוי של העיתונאים השונים Q-MARCM ומערכות MARCM קונבנציונליים, זה מעלה שאלות לגבי התיוג של נוירונים נגזרו אבות עצביים משותפים אם שני נהגים עצמאיים לא נאמנו לתייג אותו הנוירונים השושלות העצביות של ריבית 15.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג הטכניקה
שימוש tsMARCM לנהל ניתוחי שושלת עצבית ברזולוציה גבוהה
על ידי יישום הגישה המשמשת איור 3 באופן שיטתי לנתח שיבוטי tsMARCM של adPNs, 40 סוגים של adPNs, עם סך של 82 נוירונים, אותרו במחקר קודם 12. בין 40 סוגים אלה של adPNs, 35 היו adPNs חד-גלומרולרי (כלומר, innervating glomerulus יחיד באונה מחושים (AL)), אשר relאיי מידע חוש הריח לאזורים אחרים במוח תסיסנית 12 (ראה איורים 2-4 Yu et al., 2010). סוגי חמשת האחרים של adPNs היו adPNs פולי-גלומרולרי (כלומר, innervating glomeruli מרובים באזור אל), אשר יכול לשלב מידע חוש הריח מן AL ולספק רמה נוספת של מורכבות תפקודית למערכת חוש הריח 12 (ראה איורים 3E-3H וגם 4Z ב יו et al., 2010). AdPNs יליד עוברי יש רק אחד נוירון לכל סוג, ואילו adPNs זחל יליד מיוצג על ידי נוירונים מרובים לכל סוג, דבר המצביע על כך שיש גומלין בין סגולי ויתיר במערכת ההרחה 12 (ראה איורים 2-4 Yu et al., 2010). מעניין לציין, כי נוירונים מיוצרים בתוך חלונות התפתחותי מסוימים נידונים למות, וסוגים רבים של adPNs נמצאים עם מספר קבוע של תאי עצב בשושלת העצבית ALad1, דבר המצביעים על כך number וסוגי adPNs להרכבת מערכת ההרחה מוסדר בחוזקה 12 (ראה 2H הדמוי, 4V, ו -5 יו et al, 2010;. גם ראה איור 3P - 3T).
שימוש tsMARCM ללמוד פונקציות גן במדויק
מלבד adPNs לידה-היכרויות, tsMARCM גם יושם כדי לקבוע את סדר הלידה של שישה נוירונים מורכבים המרכזיים שכותרתו ידי GAL4-OK107. נוירונים אלה שישה לפצות בקבוצה קטנה של תאי עצב בשושלת העצבית LALv1 שתורמים המעגלים של המתחם המרכזי תסיסנית לשלוט דפוסי מנוע מורכבים 2, 11 (ראה איור 4 א ו -4 ב ב יו et al., 2009). מעניין לציין, כי כל אחד מששת אלה נוירונים המרכזי מורכב בעל מורפולוגיה עצבית ברורה 11 (ראה איור 4D-4H ו 4O ב יו et al., 2009). כולם נושאים דפוסי אקסונלית ברורים ז"להאונה אביזר RAL (LAL). הארבעה נוירונים הראשונים להפיץ הדנדריטים שלהם לתתי-תאים של noduli, מבנה תת-של המתחם המרכזי, ואילו שני נוירונים הנותרים להקרין הדנדריטים שלהם לגוף אליפסואיד, אחר-מבנה תת של המתחם המרכזי. באופן ספציפי, הנוירון המורכב המרכזי -born 3 rd פרויקטי דנדריטים שלה אל noduli הגחון, עם דפוס אקסונלית קומפקטי LAL, ואילו 4 th נוירון המורכב המרכזי -born מפיץ דנדריטים שלה אל הגב noduli, עם דפוס axonal רחב 11 LAL (ראה איור 4F ו 4G ב יו et al., 2009).
מעבר נוירונים לזיהוי באופן מקיף, את הכוח של tsMARCM היה יודגמו טוב יותר על ידי לימוד פונקציות גן בנוירונים של עניין, שכן מערכת tsMARCM מתיר פנוטיפי טוב מנתח בכך שהיא מאפשרת בדיקה של נוירונים זהים בעלי חיים שונים. לדוגמא, tsMARCM מזהה שומן זמני יחידדואר שינוי הדורש כרונולוגית morphogenesis הולם (chinmo, חלבון גרעיני אצבע BTB-אבץ) בנוירונים מורכבות מרכזי -born 3 rd 11 (ראה איור 4i, 4p, ו 4W ב יו et al., 2009). אם מוטצית chinmo התאפיין במערכת MARCM המקורי (כלומר, הנוירונים ירוקים שכותרתו יחידים, ללא התיוג של נוירונים נגזרו הצדדים הקשורים של תאי תאום כהפניה), הנוירון chinmo -deficient שמוצג באיור 4i מ יו ואח '. , היה misidentified 2009 4 th -born, ולא -born 3 rd, נוירון מורכב מרכזי. זה היה גורם הפירוש המוטעה של פונקצית chinmo כשולט הדרכת axonal במקום לציין 11 גורל זמני (לחצן חץ כפול באיור 4i מ- Yu et al., 2009). עם זאת, על ידי שימוש הצדדים רב התאי-NB מגנט של שיבוטי tsMARCM כמו הדואר הפניה (באמצעות ספירת מספרי התא 4m איור, 4n, ו 4P מ- Yu et al. 2009), הנוירון -deficient chinmo שמוצג באיור 4i מ- Yu et al. 2009) הוכח להיות הנוירון המורכב המרכזי -born 3 rd, ולפיכך הוביל למסקנה הנכונה כי chinmo פונקציות במפרט גורל זמני נוירונים מורכב מרכזי 11. יחדיו, התוצאות הנ"ל מדגישות את היתרונות החשובים של מערכת tsMARCM עבור ברזולוציה גבוהה מנתח פנוטיפי, ובכך לחשוף פונקציות גן במדויק בנוירונים (או סוגים אחרים של תאים, אם רלוונטי) ללימודי התפתחותי עצביים בעתיד (או מחקרים התפתחותיים של אחרים רקמות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (MOST 104-2311-B-001-034) והמכון סלולארית וביולוגיה והאורגניזמית, Academia Sinica, טייוואן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75x25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No. 1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25 °C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37 °C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., ImageJ) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
- Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
- Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
- Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
- Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
- Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
- Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
- Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
- Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).
