Summary
هنا، نقدم بروتوكول لمعدات وضع العلامات الفسيفساء الذي يسمح التصور من الخلايا العصبية المشتقة من خلية سلفية مشتركة في لونين مميزة. هذا يسهل تحليل النسب العصبية لديها القدرة على الخلايا العصبية الفردية التي يرجع تاريخها ولادة ودراسة وظيفة الجين في نفس الخلايا العصبية من مختلف الأفراد.
Abstract
M osaic على nalysis مع ص epressible ج الذراع م arker (MARCM) هو عبارة عن فسيفساء نظام وضع العلامات الإيجابية التي تم تطبيقها على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة لتصوير الأشكال التضاريسية معقدة والتلاعب وظيفة الجينات في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية داخل إنفراد خلاف ذلك، ورابط الجأش الكائنات الحية. وتتوسط الفسيفساء الوراثية الناتجة في النظام MARCM من خلال إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلايا المنقسمة تمهيدا لإنتاج كلا ملحوظ (استنساخ MARCM) والخلايا الوليدة لا تحمل علامات مميزة خلال الانقسام. امتدادا للطريقة MARCM، ودعا التوأم بقعة MARCM (tsMARCM)، والعلامات كلا من الخلايا التوأم مستمدة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة. وقد تم تطوير هذه التقنية لتمكين استرجاع المعلومات المفيدة من كلا نصفي الأنساب. من خلال تحليل شامل أزواج مختلفة من الحيوانات المستنسخة tsMARCM، يسمح نظام tsMARCM عالية الدقة النسب العصبي mappinز لتكشف بالضبط ولادة النظام من الخلايا العصبية المسماة المنتجة من الخلايا الاولية المشتركة. وعلاوة على ذلك، فإن النظام tsMARCM يمتد أيضا الدراسات وظيفة الجين من خلال السماح للتحليل المظهري من الخلايا العصبية متطابقة من الحيوانات المختلفة. هنا، نحن تصف كيفية تطبيق نظام tsMARCM لتسهيل دراسات التنمية العصبية في ذبابة الفاكهة.
Introduction
الدماغ، تتألف من عدد كبير وأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، يمنح الحيوانات مع القدرة على إدراك، عملية، والاستجابة للتحديات من العالم الخارجي. وتستمد الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة المركزي من عدد محدود من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء)، أثناء التطور 1 و 2. أكثر من مصلحة الدولة للاحصاء المشاركة في تكوين الخلايا العصبية في الدماغ في ذبابة الفاكهة الخضوع لتقسيم غير المتماثلة لتوليد مصلحة الدولة للاحصاء تجديد الذات وخلايا العقدة الأم (شهامة)، وشهامة ثم تذهب من خلال جولة أخرى من تقسيم لإنتاج خليتين ابنة أن تفرق في الخلايا العصبية 3 (الشكل 1A ). ونظرا لتعقيد التشكل العصبية والتحديات المرتبطة بتحديد الخلايا العصبية محددة، والإيجابية الفسيفساء التكنولوجيا وضع العلامات، وتحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM)، اخترع لتمكين visualizatأيون من الخلايا العصبية واحدة أو مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية من سكان المحيطة، الخلايا العصبية غير المسماة 4.
MARCM يستخدم flippase (FLP) / FLP الاعتراف الهدف (FRT) نظام للتوسط إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية الفاصل السلائف تحمل أليل متخالف من الجين كاظمة، الذي عادة يحول دون التعبير عن الجينات مراسل 4 التعبير. بعد تقسيم الإنقسامية، يتم فصل الكروموسومات المؤتلف إلى الخلايا التوأم، مثل أن خلية واحدة تحتوي على الأليلات متماثل من الجين كاظمة وخلية أخرى لا يوجد لديه كاظمة الجينات التعبير عن مراسل في تلك الخلية (ونسله) لم يعد منعت 4. عادة ما تكون موجودة ثلاثة أنماط نسيلي في تجربة MARCM عند يسببها FLP عشوائيا في مصلحة الدولة للاحصاء أو شهامة: وحيدة الخلية واثنين من خلية GMC الحيوانات المستنسخة، التي تصور مورفولوجيا الخلايا العصبية في resolutio وحيدة الخليةن، ومتعدد الخلوي-NB الحيوانات المستنسخة، التي تكشف عن أنماط شكلية كاملة من الخلايا العصبية المستمدة من ملاحظة المشترك (الشكل 1B). وقد تم تطبيق هذه التقنية MARCM على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة، بما في ذلك في تحديد نوع الخلايا العصبية لإعادة إعمار شبكات الأسلاك على نطاق الدماغ، وتحليل النسب العصبية للكشف عن تاريخ التنموي من الخلايا العصبية، وتوصيف المظهري وظائف الجينات المعنية في مواصفات مصير الخلايا، والتشكل العصبية والتمايز يدرس 5، 6، 7، 8، 9، 10. لأن MARCM التقليدية تسميات واحد فقط من خليتين ابنة (والأنساب) بعد وقوع الحدث الإنقسامية إعادة التركيب التي يسببها، يتم فقدان المعلومات يمكن أن تكون مفيدة من الجانب غير المراقب. هذا القيد ما يحول دون تطبيق الأساسي Mنظام ARCM إلى عالية الدقة يحلل الكثير من الأنساب العصبية التي تبديل مصائر خلية في وتيرة سريعة أو لدقة التحليلات من وظائف الجينات في الخلايا العصبية متطابقة من مختلف الحيوانات 11 و 12.
التوأم بقعة MARCM (tsMARCM) هو نظام متطور التسميات الخلايا العصبية مشتقة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة، والتي تمكن من التعافي من المعلومات المفيدة من كلا الجانبين من الخلايا التوأم، وبالتالي التغلب على قيود على نظام MARCM الأصلي 11 ( الشكل 2A - 2C). في نظام tsMARCM، واثنين من الحمض النووي الريبي التدخل (رني) القائم على تقع المكثفات في مواقع المتحولة من الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية السلائف، والتعبير عن تلك المكثفات تمنع بشكل مستقل التعبير عن صحفيين كل منها (الشكل 2B). وبعد الإنقسامية إعادة التركيب في مواقع محددة بوساطة من خلال نظام FLP / FRT، وطوماس فيبسفصلت المكثفات س أساس رني تصبح في خلايا التوأم للسماح للتعبير عن صحفيين متميزة (الشكل 2B). نمطين نسيلي، وحيدة الخلية المرتبطة استنساخ وحيدة الخلية والخلية يومين GMC المرتبطة استنساخ عديد الخلايا-NB، وينظر عادة في تجربة tsMARCM (الشكل 2C). معلومات مستمدة من جانب واحد من يمكن استخدامها كمرجع بالنسبة للجانب الآخر الخلايا التوأم، مما عالية الدقة تحليل النسب العصبي، مثل الخلايا العصبية المسماة التي يرجع تاريخها الولادة، والمظهرية ويحلل الخلايا العصبية متطابقة في الحيوانات المختلفة للتحقيق الدقيق وظيفة الجينات العصبية 11 و 12. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة تصف كيفية إجراء التجربة tsMARCM، والتي يمكن استخدامها من قبل مختبرات أخرى لتوسيع نطاق دراستهم التنمية العصبية (فضلا عن تطوير الأنسجة الأخرى، إن وجدت) في ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء tsMARCM جاهزة الذباب عن طريق الجينات المحورة مطلوب 11 و 13
- تولد النسخة الأصلية من الذباب tsMARCM جاهزة من الجينات المحورة التي تتم عن طريق الذباب الفردية 11 (انظر الجدول 1). إجراء مخططات القياسية ذبابة الوراثية المعبر، والتي تم وصفها سابقا، من خلال وضع الجينات المحورة متعددة في أسهم الطيران نفسها 13.
- في خط الوالدين واحد، تجميع الجينات المحورة من FRT 40A، UAS-mCD8 :: GFP (اول صحفي، mCD8 :: GFP، تعبير عن التحوير تحت سيطرة المنبع تسلسل تفعيل المروج، التي تنتج مراسل غشاء المربوطة الكتلة الماوس التمايز 8 البروتين تنصهر مع بروتين فلوري الأخضر)، وUAS-rCD2RNAi (القامع الذي يمنع التعبير عن مراسل الثاني، ورني ضد التعبير عن مجموعة الفئران سو التمايز 2، rcd2) على الذراع الأيسر من كروموسوم 2 الثانية. مكان الأنسجة محددة سائق -GAL4 على X أو 3 الثالثة كروموسوم، إن أمكن.
- في خط الوالدين الآخرين، تجميع الجينات المحورة من FRT 40A، UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض (مراسل الثاني، rCD2 :: طلب تقديم العروض، ومراسل آخر غشاء المربوطة تتكون من البروتين rCD2 تنصهر مع بروتين أحمر فلوري)، وUAS-GFPRNAi (القامع الذي يمنع التعبير عن mCD8 :: GFP، ورني ضد التعبير عن GFP) على الذراع الأيسر من كروموسوم 2 الثانية. ضع الحرارة صدمة (HS) -FLP أو FLP الأنسجة بخاص على X أو 3 الكروموسوم الثالث، إذا كان ذلك ممكنا.
- تولد النسخة الجديدة من الذباب tsMARCM جاهزة من الجينات المحورة التي تتم عن طريق الذباب الفردية 14 (انظر الجدول 1). إجراء مخططات معبر الطيران الجيني القياسية، والتي تم وصفها صreviously، من خلال وضع الجينات المحورة متعددة في أسهم الطيران نفسها 13.
- في خط الوالدين واحد، تجميع الجينات المحورة من موقع FRT وUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (التحوير مجتمعة mCD8 :: GFP والقامع الذي يمنع التعبير عن rCD2 :: طلب تقديم العروض) جنبا إلى جنب في نفس ذراع الثانية 2 أو 3 الثالثة كروموسوم (يشار أزواج المناسبة من الجينات المحورة من FRT وUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i في الجدول 1). وضع سائق الأنسجة محددة، GAL4 على الكروموسومات الأخرى من كروموسوم الموقع FRT المختار، إن أمكن.
- في خط الوالدين الآخرين، تجميع الجينات المحورة من موقع FRT وUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (التحوير الآخرين مجتمعين من rCD2 :: طلب تقديم العروض والقامع الذي يمنع التعبير عن mCD8 :: GFP) في نفس الذراع من الثانية 2 أو 3 الكروموسوم الثالث (أزواج المناسبة من الجينات المحورة من FRT وUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi في الجدول 1). مكان HS-FLP أو الأنسجة محددة، FLP على الكروموسومات الأخرى من كروموسوم الموقع FRT المختار، إن أمكن.
2. الصليب tsMARCM جاهزة الذباب لتوليد tsMARCM النسخ في ذريتها
- الذباب عبر tsMARCM جاهزة معا (على سبيل المثال، وضعت 10-15 الذباب الذكور من الخطوة 1.1.1 أو 1.2.1 و 20-30 أنثى عذراء الذباب من الخطوة 1.1.2 أو 1.2.2 معا) في قارورة ذبابة الغذاء مع الطازجة من صنع عجينة الخميرة على جدار القارورة.
- الحفاظ على عبروا الذباب tsMARCM جاهزة عند 25 درجة مئوية لمدة 2 أيام لتعزيز فرصة التزاوج قبل جمع البويضات المخصبة.
- وكثيرا ما نقل عبر الذباب tsMARCM جاهزة في قوارير yeasted الطازجة لتجنب الازدحام (نزولا الذباب أو استخدام ثاني أكسيد الكربون لتخدير الذباب لتسهيل نقل، الحفاظ على ما لا يزيد عن 80-100 البويضات المخصبة في 10 مل يطير الغذائية عن طريقل لتجنب الكثير من اليرقات).
- ثقافة الحيوانات tsMARCM (أي البويضات المخصبة، مثال على التركيب الوراثي للحيوانات tsMARCM، كما تستخدم في الشكل (3)، هو HS-FLP [22]، ث / ث، UAS-mCD8 :: GFP، UAS-rCD2RNAi، FRT 40A ، GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض، UAS-GFPRNAi، FRT 40A، +، +) التي وضعت في قارورة نقل متسلسل عند 25 درجة مئوية حتى أن تتطور إلى مراحل المطلوب (على سبيل المثال، أجنة ويرقات، أو الشرانق).
- ضع قارورة نقل التي تحتوي على الحيوانات tsMARCM في هذه المرحلة التنموية نفسها إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 10، 20، 30، 40، و 50 دقيقة لتحديد الوقت الأمثل للحرارة صدمة أن يدفع التعبير عن FLP لتوليد استنساخ tsMARCM من الفائدة. تخطي هذه الخطوة في حالة استخدام FLP الأنسجة بخاص في التجربة tsMARCM (يفضل HS-FLP عن النسب العصبي التحليلات؛ وقد وصفت أسباب هذا التفضيل السابق 15).
ملاحظة: كرر الخطوة 2.5 استخدام الوقت الأمثل للحرارة صدمة في التجارب tsMARCM في المستقبل إذا أراد المزيد من الحيوانات المستنسخة tsMARCM المصالح؛ عموما، هو فعل المزيد من التعبير FLP في HS-FLP [22] مقارنة HS-FLP [1] بنفس الوقت الحرارة صدمة. - ثقافة-صدمت حرارة الحيوانات tsMARCM عند 25 درجة مئوية حتى أنها وصلت إلى مرحلة النمو المناسبة، ومن ثم الانتقال إلى الخطوة 3.
3. إعداد، وصمة عار، وأدمغة جبل يطير تحتوي على tsMARCM النسخ
- إعداد أطباق ملقط الحماية. مزيج الجزء ألف (30 ز) والجزء باء (3 ز) من كيت سيليكون إلاستومر مع الفحم المنشط (0.25 جم). يصب الخليط في أطباق مناسبة.
- تشريح اليرقات، العذراء، أو أدمغة البالغين من الحيوانات tsMARCM في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ملقط على طبق ملقط حماية ينظر اليها من خلال المجهر تشريح. وكان من بروتوكول لتشريح ذبابة الدماغ تنازلي ملاحظة:ribed سابقا 16.
- إصلاح العقول ذبابة في لوحة بقعة الزجاج مع برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. معالجة العقول ذبابة في هذه اللوحة بقعة الزجاج للفترة المتبقية من الخطوات.
- شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT (برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 1٪ تريتون X-100) وغسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل من 1٪ PBT (شطف: إزالة PBT وإضافة PBT جديد بسرعة، غسل: إزالة PBT، إضافة PBT جديد، واحتضان العقول ذبابة في PBT جديد باستخدام شاكر المداري).
- احتضان العقول الطاير مع خليط من الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. مثال على مزيج من الأجسام المضادة الأولية غير الفئران CD8 مكافحة الأجسام المضادة (1: 100)، أرنب الأجسام المضادة لمكافحة عن dsRed (1: 800)، ومكافحة Bruchpilot (بدر) الضد الماوس (01:50) في 1٪ PBT تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع).
- شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT، ثم غسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع 1٪ PBT.
- شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT، ثم غسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع 1٪ PBT. جبل لهم على شريحة صغيرة مع كاشف مضادة للتبريد. وضع غطاء من الزجاج الصغيرة على الشريحة الصغيرة لتغطية وحماية العقول ذبابة. ختم حواف الزجاج غطاء والجزئي شريحة متناهية الصغر باستخدام طلاء الأظافر واضحة. تخزين هذه المركبة ومختومة يطير عينات الدماغ في 4 درجات مئوية.
4. خذ، عملية، وتحليل الصور فلوري من tsMARCM النسخ
- التقاط الصور الفلورسنت من tsMARCM استنساخ الابأوم عينات تم إنشاؤه في الخطوة 3.8 باستخدام نظام الفحص المجهري متحد البؤر الاختيار.
- مداخن مشروع tsMARCM الصور الفلورسنت مبائر إلى ثنائية الأبعاد، بالارض الصور باستخدام برامج معالجة الصور المرفق مع نظام الفحص المجهري متحد البؤر من اختيار (انظر الشكل 3B - 3E، الجيل الثالث 3G - 3J، 3L - 3O، و3Q - 3T للحصول على أمثلة من بالارض صور الفلورسنت مبائر).
- حساب عدد الخلايا من الجانبين متعددة الخلوية-NB من الحيوانات المستنسخة tsMARCM باستخدام برامج معالجة الصور المناسبة (على سبيل المثال، فإن وظيفة "خلية مكافحة" في ImageJ 17؛ انظر الشكل 3E، 3J، 3O، و3T للحصول على أمثلة للخلية هيئات من الخلايا العصبية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم النظام tsMARCM لتسهيل النسب العصبي التحليلات والدراسات وظيفة الجين من خلال استرجاع المعلومات الهامة على الخلايا العصبية المستمدة من مصلحة الدولة للاحصاء المشتركة. وقد استخدم هذا النظام لتحديد معظم (إن لم يكن كل) أنواع الخلايا العصبية، وتحديد عدد الخلايا من كل نوع الخلايا العصبية، والتأكد من الولادة ترتيب هذه الخلايا العصبية 11، 12، 18 (انظر قسم مناقشة لمزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام tsMARCM ل إجراء النسب العصبي تحليلات أو دراسات وظائف الجينات). هنا، كنا أربعة استنساخ tsMARCM من المهادية الأمامية الخلايا العصبية الإسقاط حاسة الشم (adPNs في النسب ALad1 العصبي للنظام حاسة الشم ذبابة الفاكهة) المسمى مع GAL4-GH146 كأمثلة لتوضيح كيفية إجراء التجربة tsMARCM 1 و 2. بعد الناجم عن التعبير FLP في المرحلة الجنينية، والاشتراكيةتم الكشف عن ngle والأخضر VL2p adPN المرتبطة 45 adPNs أرجواني في استنساخ tsMARCM (الشكل 3A - 3E). في المقابل، عندما كان المستحث FLP في وقت لاحق، في مراحل اليرقات مختلفة، واحد، adPNs الأخضر (DL1 adPN أو DC3 adPN) أو عدم GH146 + adPNs المرتبطة أعداد مختلفة من adPNs أرجواني (31، 21، أو 15) لوحظت في ثلاثة الآخر استنساخ tsMARCM (الشكل 3F - 3T). تم تحديد ولادة VL2p adPNs قبل ولادة DL1-، DC3- وعدم GH146 + -adPNs عن طريق عد الأرقام الخلية من adPNs في يرتبط بها من الجانبين متعددة الخلوية-NB بهم من الحيوانات المستنسخة tsMARCM (45، 31، 21، و 15 في الشكل 3E، 3J، 3O، و3T، على التوالي). بالإضافة إلى فرز أرقام الهواتف المحمولة، وتعقد من محور عصبي وأنماط الجذعية في الجانبين متعددة الخلوية-NB من الحيوانات المستنسخة tsMARCM يمكن استخدامها لتحديد النسبي الولادة أمر يرتبط بها من الجانبين خلايا يومين GMC للاستنساخ tsMARCM. استنساخ الفسيفساء التي يسببها في مراحل النمو المبكرة عادة ما تحتوي على المزيد من الخلايا العصبية وبالتالي يكون محور عصبي أكثر تعقيدا وأنماط الجذعية، في حين استنساخ الفسيفساء التي يسببها في مراحل نمو أواخر تحتوي على عدد أقل من الخلايا العصبية وبالتالي لها أنماط محواري وشجيري أقل تعقيدا (الشكل 3C - 3D، 3H - 3I ، 3M - 3N، و3R - 3S).
الشكل 1: الرسوم التوضيحية تخطيطي من ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية وثلاثة أنواع من أنماط نسيلي وجدت في التجربة MARCM. (A) رسم تخطيطي يوضح تكوين الخلايا العصبية في الأنساب الأكثر العصبية من الدماغ المركزي ذبابة الفاكهة: neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء) الخضوع لتقسيم غير المتماثلة لتوليد مصلحة الدولة للاحصاء تجديد الذات وخلايا العقدة الأم (شهامة)، وشهامة تقسيم واحد مزيد من الوقت لإنتاج نوعين من الخلايا العصبية ابنة (NS). ويلاحظ (ب) ثلاثة أنماط نسيلي في تجربة MARCM: استنساخ وحيدة الخلية (أ)، عندما هو فعل flippase (FLP) في شهامة، واستنساخ خلايا يومين جي ام سي (ب) واستنساخ متعددة الخلوية-NB (ج )، عند الناجم عن FLP في مصلحة الدولة للاحصاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرسوم التخطيطية للنظام tsMARCM. (A) الذباب tsMARCM الجاهزة: ذبابة الوالدين واحد يحتوي على الجينات المحورة من موقع FRT وUAS-mCD8 :: GFP (اول صحفي)، UAS-rCD2RNAi (القامع الأول الذي يحول دون التعبير عن مراسل الثاني)، والأنسجة -specific -GAL4. يحتوي على الطاير الوالدين الآخرين على FRT UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض (مراسل الثاني)، UAS-GFPRNAi (القامع الثاني الذي يحول دون التعبير عن مراسل الأول)، وHS-FLP. (ب) إن وجود المكثفات على أساس رني اثنين في ذرية الذباب tsMARCM جاهزة عبرت يمنع التعبير عن صحفيين (أي mCD8 :: GFP وrCD2 :: طلب تقديم العروض في G1 و G2 مراحل لوحة B). هو فعل للتعبير عن FLP بفعل الحرارة للصدمات، وFLP ثم تتوسط إعادة التركيب في مواقع محددة من الكروموزومات المتماثلة داخل الخلية تمهيدا الفاصل على ملزم لأهداف الاعتراف FLP (FRTs). وهذا يؤدي إلى الفصل من المكثفات أساس رني في الخلايا التوأم بعد الانقسام الإنقسامية للسماح للتعبير عن صحفيين واضح. ويلاحظ (C) نمطين نسيلي في تجربة tsMARCM: وحيدة الخلية، ويرتبط مع الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية (أ) عند الناجم عن FLP في شهامة، وخلايا يومين GMC، ويرتبط مع الحيوانات المستنسخة متعددة الخلوية-NB(ب) عند الناجم عن FLP في مصلحة الدولة للاحصاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: استخدام أربعة استنساخ tsMARCM من adPNs كأمثلة على كيفية إجراء التجربة tsMARCM في تحليل النسب العصبي. ويوضح أربعة استنساخ tsMARCM من adPNs، مع الرسوم البيانية من أنماط الخلايا العصبية الخاصة (A، F، K، وP)؛ صور مبائر من الدماغ الكلي (B، G، L، وس)، والتي تبين القرن الوحشي (LH، C، H، M، و R)، الفص antennal (AL؛ D، I، N، وS) و سوما(E، J، O، و T)؛ وأنماط الأشكال التضاريسية من الخلايا العصبية. وقد استمدت المرتبطة عديد الخلايا-NB adPNs (أرجواني) من الحيوانات المستنسخة tsMARCM من تحريض FLP للتوسط إعادة التركيب الإنقسامية في adPN ملحوظة في الجنينية، adPNs واحدة (الأخضر VL2p، DL1، DC3، وعدم GH146 + adPNs) (A - E) واليرقات - مراحل (F T). لاحظ أن adPNs واحدة من نصفي الأنساب في نسب العصبي ALad1، مما يؤدي إلى استنساخ tsMARCM ل، adPN الأخضر وحيد المرتبطة adPNs أرجواني في الشكل (3) (لأسباب غير معروفة، الخلايا العصبية من الآخر نصفي نسب العصبية ALad1 يموت النسب). تم تحديد ولادة النظام من VL2p، DL1، DC3، وعدم GH146 + adPNs عن طريق عد الأرقام الخلية من adPNs في الجانبين أرجواني متعددة الخلوية-NB من الحيوانات المستنسخة tsMARCM (45، 31، 21، و 15 ضمن متقطع خطوط لوحات E، Jيا، وT). أنماط محوار وعادة ما تكون أكثر تعقيدا في أرجواني الجانبين متعددة الخلوية-NB عندما يتم الناجم عن استنساخ tsMARCM في مراحل النمو المبكرة (على سبيل المثال، نمط شجيري هو أكثر تعقيدا في لوحة E مقارنة مع فريقي الأول، N، وS). tsMARCM يحلل ومربكة في بعض الأحيان عندما وصفت الخلايا العصبية الأنساب العصبية الأخرى أيضا من قبل السائق نفسه GAL4 (على سبيل المثال، الخلايا العصبية LH الخضراء، يتضح من الأسهم المزدوجة، عرقلة تصور نمط إعداد المحاور من adPNs VL2p في لوحات B و C) . كانت ملطخة neuropiles الدماغ (كما هو موضح باللون الأزرق) مع الأجسام المضادة ضد Bruchpilot (بدر). الوقت للحرارة صدمة: 12 دقيقة (لوحات أ - ه)، لمدة 15 دقيقة (لوحات F - J)، و 35 دقيقة (لوحات K - T). شريط النطاق في لوحات B -
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
الخطوات 1.1.1، 1.2.1، 2.3، 2.5، و 3.2 حاسمة للحصول على نتائج جيدة tsMARCM. ويفضل السائقين -GAL4 الأنسجة المحددة التي لا تعبر عن GAL4 في الأسلاف العصبية للخطوات 1.1.1 و 1.2.1. تجنب الإفراط في الازدحام-الحيوانات التي تزرع في قارورة ذبابة المواد الغذائية في الخطوة 2.3. لأن الكمون الاستقراء، ومستوى التعبير FLP على حرارة صدمة، ومتوسط الوقت الفاصل الأسلاف العصبية (أي مصلحة الدولة للاحصاء وشهامة) ليست معروفة، فمن الأفضل أن تختلف الوقت للحرارة صدمة (10، 20، 30 ، 40، و 50 دقيقة) على عينات مختلفة من نفس النمط الجيني والمرحلة التنموية في الخطوة 2.5. وهذا سوف يسمح لتحديد الوقت للحرارة صدمة الأمثل من أجل الحصول على أفضل نسبة من الحيوانات المستنسخة tsMARCM من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتوخي الحذر أثناء تشريح ذبابة الدماغ في الخطوة 3.2 في أجل الحصول على عينات من الدماغ سليمة. هذا أمر بالغ الأهمية لحساب بدقة أعداد الخلايا العصبية. للعزاءالرماة الذين يرغبون في استخدام tsMARCM لدراسة وظيفة الجينات على الكروموسوم الأسلحة الأخرى (على سبيل المثال، 2R، 3L، و3R)، يجب أن يتم تجميعها الذباب tsMARCM جاهزة كما في الخطوة 1.2 عن طريق اختيار أزواج المناسبة من الجينات المحورة من FRT، UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i، وUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi، التي مبين في الجدول رقم 1. نوصي أيضا أن الذباب tsMARCM استعداد الإناث تحمل HS-FLP على الكروموزوم (على سبيل المثال، HS-FLP [22]، ث، UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض، UAS-GFPRNAi، FRT 40A، +، +)، التي يسهل التجارب tsMARCM المتكررة.
التعديلات، حل المشاكل، والقيود المفروضة على تقنية
كفاءة وperdurance من المكثفات رني وللصحفيين هي المحددات الرئيسية لما إذا كانت النسب العصبي تحليلات ودراسات وظائف الجينات يمكن أن يؤديها بنجاح في التجارب tsMARCM. عموما، فإن الجمع بين perdurance منخفضة من المكثفات رني وللصحفيين المستمدة من الأسلاف العصبية، جنبا إلى جنب مع التعبير عالية من المكثفات رني وللصحفيين في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية، يسمح النتائج tsMARCM أفضل. لأنه سيطر على التعبير من المكثفات رني وصحفيين من قبل السائقين GAL4، يجب على الباحثين تحديد السائقين GAL4 قوية تعبر عن GAL4 في الخلايا العصبية متباينة ولكن ليس في الأسلاف العصبية. على سبيل المثال، GAL4-OK107 هو السائق GAL4 القوي الذي يعبر GAL4 في الجسم الفطر (MB) الأسلاف ومشتقاتها، γ MB، α '/ β "، وα / الخلايا العصبية بيتا 11، 19. وقد لوحظ وضع العلامات غير مخلص لMB الخلايا العصبية جاما في نمطين نسيلي (أي واحدة من الخلايا المرتبطة استنساخ وحيدة الخلية واثنين من خلية GMC المرتبطة استنساخ متعددة الخلوية-NB) عندما استخدمت GAL4-OK107 في التجارب tsMARCM 11 . ومن المثير للاهتمام، فإن القضية المذكورة أعلاه يمكن حلها باستخدام MB247-GAL4، مختلف سائق MB GAL4التي تعبر عن GAL4 في MB الخلايا العصبية متباينة 11.
ليس كل السائقين GAL4 يمكن استخدامها في نظام tsMARCM أو في أنظمة العلامات فسيفساء أخرى (على سبيل المثال، MARCM، Q-MARCM، ومولد التوأم البقعة) 4، 20، 21 إذا لم يتم التعبير عن سائق في الخلايا العصبية في المصالح. لذلك، قبل استخدام tsMARCM لنسب العصبي تحليلات، يجب اختبار السائقين GAL4 لتغطيتها من الخلايا العصبية من الفائدة في MARCM المزدوجة التعبير عن السيطرة مع سائق خلايا عموم (على سبيل المثال، تويولين المروج LexA :: GAD) 22 . ونلاحظ أن الحيوانات المستنسخة tsMARCM في بعض الأحيان لا يمكن تحليلها بشكل لا لبس فيه، وخصوصا عندما يستخدم السائق GAL4 مع نمط التعبير العصبية المعقدة (مثل الأخضر القرن الوحشي (LH) الخلايا العصبية تمنع تصور واضح لنمط صياغة المحاور من VL2p adPN في الشكل 3B و
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
إلى جانب tsMARCM، مولد التوأم بقعة وMARCM جانب شأنه أيضا، على الأقل من الناحية النظرية، والسماح للتصور(تم عرض مقارنة بين هذه التقنيات وضع العلامات الفسيفساء ثلاثة سابقا 15) الخلايا العصبية المستمدة من الأسلاف العصبية شيوعا في لونين مميزة. الحد الأدنى لعدد الجينات المحورة المطلوبة لتجميع مولد التوأم بقعة، النسخة الأصلية من tsMARCM (أو النسخة الجديدة من tsMARCM)، وMARCM جانب هو 4، 8 (أو 6)، و 9 على التوالي. ومع ذلك، tsMARCM هو النظام الوحيد الذي تم استخدامه لإجراء النسب العصبي شامل يحلل 12، 15، 18، 23. إعادة التركيب موقع معين لا يحدث في الخلايا غير الإنقسامية في نظام مولد التوأم بقعة، وهذا يؤدي إلى المشاركة في التعبير عن صحفيين اثنين في نفس الخلية، مما يجعل صعوبة في استخدام هذا النظام لدراسة تطوير المركزي الجهاز العصبي 15. في المقابل، استنساخ الفسيفساء التي تم الحصول عليها في tsMARCM وأنظمة MARCM مصحوبة بمجموعةإعادة المشتقة من الخلايا الإنقسامية. ومع ذلك، لأن النظام MARCM جانب يتطلب اثنين من السائقين المستقلة للسيطرة على التعبير عن صحفيين مختلفة في النظم MARCM التقليدية وQ-MARCM، وهذا يثير المخاوف بشأن وضع العلامات على الخلايا العصبية المستمدة من الأسلاف العصبية شائعة في حالة اثنين من السائقين مستقلة لا بإخلاص تسمية نفس الخلايا العصبية في الأنساب العصبية من الفائدة 15.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان تقنية
باستخدام tsMARCM لإجراء عالية الدقة التحليلات العصبية النسب
من خلال تطبيق النهج المتبع في الشكل (3) لتحليل منهجي استنساخ tsMARCM من adPNs، 40 أنواع من adPNs، مع ما مجموعه 82 الخلايا العصبية، والتي تم تحديدها في دراسة سابقة (12). ومن بين هذه الأنواع 40 من adPNs هناك 35 adPNs أحادي الكبيبي (أي التعصيب والكبيبة واحدة في الفص antennal (AL))، التي السمة relعبد المنعم يوسف المعلومات الشمية إلى مناطق أخرى من الدماغ ذبابة الفاكهة 12 (انظر أرقام 2-4 في يو وآخرون، 2010). وكانت خمسة أنواع أخرى من adPNs adPNs بولي الكبيبي (أي التعصيب الكبيبات متعددة في AL)، والتي يمكن أن تدمج المعلومات حاسة الشم من الجامعة وتوفير مستوى إضافي من التعقيد وظيفي للنظام حاسة الشم 12 (انظر الأرقام 3E-3H و 4Z في يو وآخرون، 2010). adPNs المولد الجنينية لديها الخلايا العصبية واحد فقط لكل نوع، في حين يتم تمثيل adPNs ولد اليرقات عن طريق الخلايا العصبية متعددة لكل نوع، مما يشير إلى أن هناك تفاعل بين خصوصية والتكرار في نظام حاسة الشم 12 (أنظر الشكلين 2-4 في يو وآخرون، 2010). ومن المثير للاهتمام، تتجه الخلايا العصبية المنتجة في بعض النوافذ التنموية للموت، وتوجد أنواع عديدة من adPNs مع عدد ثابت من الخلايا العصبية في النسب العصبي ALad1، مما يشير إلى أن العدد. dوينظم ص وأنواع adPNs لتجميع نظام حاسة الشم بإحكام 12 (انظر الأرقام 2H، 4V، و 5 في يو وآخرون، 2010؛ وكذلك انظر الشكل 3P - 3T).
باستخدام tsMARCM لدراسة بدقة وظائف الجينات
وبالاضافة الى الولادة التي يرجع تاريخها adPNs، كما تم تطبيق tsMARCM لتحديد ولادة النظام من ستة الخلايا العصبية المعقدة المركزية وصفت من قبل GAL4-OK107. هذه الخلايا العصبية ستة يشكلون مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية في النسب العصبي LALv1 التي تساهم في الدوائر المجمع المركزي ذبابة الفاكهة لمراقبة أنماط المحركات المعقدة 2 و 11 (انظر الشكل 4A و4B في يو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، كل من هذه الخلايا العصبية المعقدة المركزية ستة تمتلك مورفولوجيا الخلايا العصبية واضح 11 (انظر الشكل 4D-4H و4O في يو وآخرون، 2009). كل منهم يحمل أنماط محور عصبي متميزة في وقت متأخرالفص الإكسسوارات راؤول (LAL). الخلايا العصبية الأربعة الأولى توزيع التشعبات لمقصورات الفرعية للعقيدات، هيكل الفرعي للمجمع المركزي، في حين أن الخلايا العصبية المتبقيتين تتوقع التشعبات إلى الجسم الإهليلجي، هيكل فرعي آخر من المجمع المركزي. على وجه التحديد، مشاريع الخلايا العصبية المعقدة المركزية الثالثة 3 -born التشعبات تجاه عقيدات بطني، مع وجود نمط المحاور المضغوط في LAL، في حين أن ال 4 -born الخلايا العصبية المركزية المعقدة توزع التشعبات تجاه عقيدات ظهري، مع وجود نمط محور عصبي واسع في وLAL 11 (انظر الشكل 4F و 4G في يو 2009 وآخرون،).
ما وراء الخلايا العصبية تحديد بصورة شاملة، فإن قوة tsMARCM إيجاد مثل لها أفضل من خلال دراسة وظائف الجينات في الخلايا العصبية في المصالح، لأن النظام tsMARCM يسمح المظهرية أفضل يحلل من خلال تمكين فحص الخلايا العصبية متطابقة في الحيوانات المختلفة. على سبيل المثال، tsMARCM بالكشف عن الدهون الزماني واحدتغيير البريد الذي يتطلب زمنيا التشكل غير مناسب (chinmo، وهو بروتين النووي إصبع BTB والزنك) في الخلايا العصبية المعقدة المركزية الثالثة 3 -born 11 (انظر الشكل 4I، 4P، و4W في يو وآخرون، 2009). إذا تميزت طفرة chinmo في النظام MARCM الأصلي (أي الخلايا العصبية الخضراء المسمى واحد، من دون وضع العلامات من الخلايا العصبية المستمدة من الجانبين المرتبطة الخلايا التوأم كمرجع)، والخلايا العصبية -deficient chinmo هو مبين في الشكل 4I من يو وآخرون. ، لكان أخطأ في التعرف عام 2009 حيث -born 4 الجاري، بدلا من -born 3 الثالثة، الخلايا العصبية المركزية المعقدة. قد أدى ذلك إلى سوء فهم وظيفة chinmo عن السيطرة التوجيه محور عصبي بدلا من تحديد الزمني مصير 11 (السهم المزدوج في الشكل 4I من يو وآخرون، 2009). ومع ذلك، باستخدام الجانبين أرجواني متعددة الخلوية-NB من الحيوانات المستنسخة tsMARCM كما الالبريد المرجعية (عن طريق احتساب أعداد الخلايا في الرقم 4M، 4N، و4P من يو وآخرون. ، 2009)، وchinmo الخلايا العصبية -deficient هو مبين في الشكل 4I من يو وآخرون. ، 2009) وقد ثبت أن الخلايا العصبية المعقدة المركزية الثالثة 3 -born، الذي بالتالي أدى إلى الاستنتاج الصحيح أن chinmo وظائف في مواصفات مصير الزمنية لالخلايا العصبية المعقدة المركزية 11. مجتمعة، تسلط الضوء على النتائج المذكورة أعلاه المزايا المهمة للنظام tsMARCM عالية الدقة يحلل المظهرية، وبالتالي الكشف بدقة وظائف الجينات في الخلايا العصبية (أو أنواع أخرى من الخلايا، إن وجدت) للدراسات التنموية العصبية في المستقبل (أو الدراسات التنموية من الآخر مناديل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 104-2311-B-001-034) ومعهد الخلوية والبيولوجيا العضوية، أكاديمية سينيكا، تايوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75x25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No. 1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25 °C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37 °C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., ImageJ) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
- Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
- Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
- Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
- Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
- Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
- Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
- Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
- Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).
