细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

Summary

这里，我们提出了一个协议，用于一个马赛克标记技术，它允许从一个共同的祖细胞在两种不同颜色来源的神经元的可视化。这有利于与出生约会单个神经元中不同个体的相同的神经元的能力，研究基因功能的神经谱系分析。

Abstract

中号 osaic带有R epressible 有丝米 arker 一 nalysis（MARCM）是一种已被广泛应用在果蝇的神经生物学研究来描绘复杂的形态和内，否则无人盯防和泰然自若操纵基因功能的神经元亚群的积极镶嵌标签制度生物。在MARCM系统中产生遗传马赛克通过同源染色体之间的位点特异性重组内分裂前体细胞的有丝分裂过程中，以产生两个标记（MARCM克隆）和未标记的子细胞介导的。所述MARCM方法的扩展，称为双点MARCM（tsMARCM），标签都从具有两种不同颜色的共同祖先来源的双细胞。这种技术被开发，以使从两个半谱系有​​用信息的检索。通过综合分析对不同tsMARCM克隆的tsMARCM系统允许高分辨率神经系mapping至揭示从共同祖细胞产生的标记的神经元的确切出生顺序。此外，tsMARCM系统还通过允许不同动物的相同神经元的表型分析延伸基因功能的研究。在这里，我们将介绍如何应用tsMARCM系统，方便神经发育研究果蝇 。

Introduction

脑，由广大多样类型的神经元的，赋予动物感知，处理和来自外部世界的挑战的反应能力。成年果蝇中央脑的神经元被从神经干细胞的数量有限的派生，称为神经母细胞（NBS），开发^1,2中。大多数国家统计局参加在果蝇脑内神经发生不对称分裂产生自我更新国家统计局和神经节母细胞（系膜细胞）和系膜细胞然后再通过另一轮分裂产生分化成神经元³两个子细胞（ 图1A ）。由于神经元形态的复杂性，并确定具体的神经元，正面镶嵌标签技术，以阻遏细胞标记物（MARCM）马赛克分析相关的挑战，被发明使visualizat一个单一的神经元即神经元的一小部分出来的周边，未标记的神经元⁴的人口的离子。

MARCM利用翻转酶（FLP）/ FLP识别目标（FRT）系统介导携带阻抑基因，其表达通常抑制报道基因⁴的表达的杂合等位基因的分割前体细胞内的同源染色体之间的位点特异性重组。的有丝分裂后，重组染色体分成双细胞，使得一个单元包含阻抑基因的纯合等位基因，而另一个单元没有阻遏基因的记者的在该小区（和其后代）表现不再⁴受阻。三个克隆型态通常在MARCM实验中发现，当FLP在的NB或系膜是随机诱导：单细胞和双小区GMC克隆，其描绘在单细胞resolutio神经元形态n和多细胞-NB克隆，它揭示了从一个共同的NB（ 图1B）衍生的神经元的整个形态模式。该MARCM技术已在果蝇的神经生物学研究中得到了广泛应用，包括神经类型识别用于重建大脑宽布线网络，神经系分析了披露神经元，参与细胞命运规范基因功能表型特征的发展历史，以及神经元形态发生和分化研究^{5，6，7，8，9，10。}由于传统MARCM只标注诱导有丝分裂重组事件发生后两个子细胞（和系）中的一个，从侧无人盯防的潜在有用的信息丢失。这种限制妨碍了基本M的应用该切换细胞命运在快节奏的许多神经谱系的ARCM系统高分辨率分析或精密在不同动物^11,12相同的神经元基因功能分析。

双点MARCM（tsMARCM）是一种先进的系统，标签从共同祖衍生用两种不同颜色的神经元，从而使有用的信息从双细胞两侧的恢复，从而克服了原有MARCM系统¹¹的限制（ 图2A - 2C）。在tsMARCM系统中，两个RNA干扰（RNAi）为主抑制器是位于前体细胞内的同源染色体的反式位点，并且这些抑制剂的表达独立地抑制它们各自的记者（ 图2B）的表达。继通过FLP / FRT系统介导的位点特异性有丝分裂重组，在TWø基于RNAi的抑制成为分隔成两张细胞，以允许不同的记者（ 图2B）中的表达。两个克隆的图案，与多细胞-NB克隆相关的单细胞克隆和两个小区用GMC相关联的单细胞，通常见于一个tsMARCM实验（ 图2C）。信息从可利用作为另一侧上的参考双子细胞的一侧导出，使得到的高分辨率神经谱系分析，如出生约会标记的神经元，和用于精确调查在不同的动物相同的神经元表型分析神经基因功能^11,12。这里，我们提出一个步骤一步协议描述如何在果蝇进行tsMARCM实验，其可以通过其他实验室使用，以扩大其神经发育的研究（以及其它组织的发展，如适用）。

Protocol

1.建立使用所需转基因^11，13 tsMARCM准备苍蝇

1. 生成tsMARCM准备苍蝇从被个别苍蝇进行¹¹转基因的原始版本（ 见表1）。进行标飞遗传交叉方案中，其中先前已经描述的，通过将多个转基因在相同的飞股^13。
   1. 在一种亲本系，组装FRT ^40A，UAS - mCD8 :: GFP（第一报告，mCD8 :: GFP的转基因;转基因的表达是上游激活序列的启动子控制，其产生的膜-拴系记者下所述RNAi对大鼠簇0的表达;绿色荧光蛋白融合的分化8蛋白的小鼠群），和UAS-rCD2RNAi（抑制第二记者表达的抑制的˚F分化2，rcd2）在^第 2 ^次染色体的左臂。地点 组织特异性-GAL4驱动在X或^第三染色体，如果可能的话。
   2. 在另一亲本系，组装FRT ^{40A，UAS-rCD2} :: RFP的转基因（第二记者，rCD2 :: RFP;另一膜-拴系的记者由具有红色荧光蛋白融合rCD2蛋白），和UAS-GFPRNAi （抑制mCD8 :: GFP表达的抑制;针对GFP表达的RNA干扰）的2 ^次染色体的左臂。放置热休克（HS）-FLP或组织specific- FLP在X或^第三染色体，如果可能的话。
2. 生成tsMARCM就绪苍蝇从由个人蝇¹⁴进行转基因的新版本（ 见表1）。进行标飞的遗传交叉方案中，已经描述previously，通过将多个转基因在同一飞股票^13。
   1. 在一个亲本线，组装FRT位点和UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i（mCD8 :: GFP和抑制rCD2表达:: RFP抑制器的组合转基因）的转基因一起的同一手臂第2 ^次或^第 3 ^次的染色体（FRT和UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i的转基因的适当对表1中所示）。放置组织特异性-GAL4司机比所选择的FRT位点的染色体，其他可能的话染色体。
   2. 在另一亲本系，组装FRT位点和UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi（rCD2的其他组合的转基因:: RFP和抑制mCD8 :: GFP表达的抑制）在同一臂的转基因第2 ^次或^第 3号染色体（适当对FRT的转基因的UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi在表1中所示）。代替HS-FLP或大于所选择的FRT位点的染色体，其他可能的话染色体组织特异性-FLP。

2.跨tsMARCM准备飞往生成tsMARCM无性系后代

1. 跨tsMARCM就绪苍蝇（ 如，放10-15雄蝇从步骤1.1.1或1.2.1和20-30处女女步骤1.1.2或1.2.2一起飞）在飞食品小瓶新鲜对小瓶的壁订做酵母膏。
2. 保持在25℃的交叉tsMARCM就绪蝇2天收集受精卵之前提高交配的机会。
3. 频繁交叉tsMARCM就绪蝇转移到新鲜yeasted小瓶避免拥挤（点击向下的苍蝇或使用二氧化碳麻醉苍蝇便于转移;通过保持不超过80-100受精卵在一个10毫升飞食品L为了避免过多的孵幼虫）。
4. 培养tsMARCM动物（ 即，受精卵; tsMARCM动物的基因型的一个例子，如在图3中使用的，是HS-FLP ^[22]，w / w的; UAS-mCD8 :: GFP，UAS-rCD2RNAi，FRT ^40A ，GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP，UAS-GFPRNAi，FRT ^40A + +）已在25℃下被放置在串行传送小瓶直到他们开发到所需阶段（ 例如，胚胎，幼体，或蛹）。
5. 放置包含tsMARCM动物在相同发育阶段到37℃水浴10，20，30，40所传送的小瓶中，50分钟，以确定热休克的最佳时间诱导FLP的表达，以产生感兴趣tsMARCM克隆。如果跳过这一步在tsMARCM实验中使用组织specific- FLP（HS-FLP是首选的神经系分析;对于这种偏好的原因先前已被描述¹⁵）。
   注：使用在未来tsMARCM实验热休克的最佳时间，如果感兴趣的更多tsMARCM克隆想重复步骤2.5;通常，更多的FLP表达在诱导HS-FLP ^[22]相比于HS-FLP ^[1]具有相同的热休克的时间。
6. 文化在25℃的热震惊tsMARCM动物，直到他们达到合适的发育阶段，然后进行第3步。

3.准备，着色漆，和粉煤灰山含脑克隆tsMARCM

1. 准备钳保护的菜肴。混合部分A（30克）和有机硅弹性体套件，带活性炭（0.25克）B部分（3克）。将混合物倒入合适的菜肴。
2. 解剖幼虫，蛹，或成人的脑袋上使用通过解剖显微镜观察的镊子保护盘钳在1×磷酸盐缓冲盐水的tsMARCM动物（PBS）中的。注：为飞大脑解剖协议已经说明此前¹⁶ ribed。
3. 固定在玻璃斑点板用含有1×PBS中的4％甲醛在室温下20分钟的飞大脑。处理在该玻璃斑点板为以下步骤剩余的飞大脑。
4. 冲洗苍蝇大脑中（含1×PBS中1％的Triton X-100）1％PBT，每洗三次，每次30分钟，以1％的PBT（漂洗三次：删除PBT和快速添加新PBT;清洗：除去PBT，添加新的PBT和孵化在新的PBT使用定轨振荡器）飞大脑。
5. 孵育初级抗体的混合物飞大脑在4℃或在室温下4小时过夜。初级抗体的混合物的一个例子是大鼠抗CD8抗体（1：100）：含有与小鼠抗Bruchpilot（BRP），以1％的PBT抗体（1:50），兔抗DsRed的抗体（800 1） 5％正常山羊血清（NGS）。
6. 冲洗飞大脑，用1％的PBT三次，然后把它们洗干净三次，每次30分钟，用1％的PBT。
7. 冲洗飞大脑，用1％的PBT三次，然后把它们洗干净三次，每次30分钟，用1％的PBT。它们安装在与抗淬火试剂的微滑动。戴上微型滑动微型玻璃盖覆盖和保护的苍蝇大脑。密封使用透明指甲油微玻璃盖和微滑动的边缘。存储这些装并密封在4℃飞大脑标本。

4.取，处理和分析tsMARCM克隆的荧光图像

1. 捕捉tsMARCM克隆fr的荧光图像嗡使用选择的共聚焦显微镜系统在步骤3.8中创建的样品。
2. tsMARCM共焦荧光图像的项目堆叠成二维，使用具有所选择的共焦显微镜系统提供的图像处理软件扁平的图像（ 见图3B - 3E，3G - 3J，3L - 30， 和3Q - 3T为扁平的例子共聚焦荧光图像）。
3. 计数使用适当的图像处理软件（在ImageJ的¹⁷ 如在“细胞计数”功能tsMARCM克隆的多细胞-NB边的细胞数，参见图3E，3J，3O，和3T用于小区的例子神经元的体）。

Representative Results

该tsMARCM系统已被用于通过检索来自共同的NB衍生的神经元的重要信息，以促进神经谱系分析和基因功能研究。该系统已被用于识别大部分（如果不是全部）的神经元类型，确定每个神经元类型的细胞数量，并确定使用tsMARCM这些神经元的出生顺序^{11，12，18（}见讨论部分的详细说明开展神经系分析和基因功能研究）。在这里，我们使用具有GAL4-GH146标记为实施例anterodorsal嗅觉投射神经元（在果蝇嗅觉系统的ALAD1神经谱系adPNs）四tsMARCM克隆来说明如何进行tsMARCM实验^1,2。后FLP表达处于萌芽阶段，SI诱发45品红adPNs相关ngle，绿色VL2p ADPN在tsMARCM克隆（ - 3E 图3A）进行检测。相反，当FLP在三个其他观察后诱导，在不同的幼虫阶段，单一的，绿色adPNs（DL1 ADPN或DC3 ADPN）或具有不同数目的品红adPNs（31，21，或15）相关联的无GH146 + adPNs tsMARCM克隆（ 图3F - 3T）。 VL2p adPNs之前DL1-，DC3-和无GH146 + -adPNs诞生的诞生是由tsMARCM克隆（45，31，21日与其相关的多细胞-NB双方计数adPNs的细胞数量决定的，和15中分别图3E，3J，3O，和3T）。除了在tsMARCM克隆的多细胞-NB侧计数的细胞数，在轴突的复杂性和树突模式可以被用来确定的它们相关的两个小区的GMC侧的相对出生顺序tsMARCM克隆。在早期发育阶段诱导镶嵌克隆通常含有更多的神经元，因而具有更复杂的轴突和树突的图案，而在晚期发育阶段诱导镶嵌克隆含有较少的神经元，因此具有较不复杂的轴突和树突图案（ 图3C - 3D，3H - 3I ，3M - 3N，和3R - 3S）。

图1： 果蝇神经发生的示意图和三种克隆图案在一个MARCM实验中发现。 （ 一 ）在果蝇脑中枢的神经大部分谱系的示意图说明神经：神经母细胞（NBS）进行的不对称分裂产生自我更新国家统计局和神经节母细胞（系膜细胞），并划分系膜再一次产生两个女儿的神经元（NS）。 （B）的三个克隆图案在一个MARCM实验中观察到：单细胞克隆（a）中，当翻转酶（FLP）被诱导的GMC，和双小区GMC克隆（b）和多细胞-NB克隆（三），当在FLP是NB的诱导。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：tsMARCM系统的示意图。 （A）中tsMARCM就绪蝇：一个亲本蝇含有FRT位点和UAS-mCD8 :: GFP（第一报告），UAS-rCD2RNAi（抑制第二报道的表达第一抑制器）和组织的转基因特异性-GAL4;其他家长飞包含FRT ，UAS-rCD2 :: RFP（第二记者），UAS-GFPRNAi（抑制所述第一报道分子的表达的第二抑制器）和HS-FLP。 （B）的两个基于RNAi的抑制在交叉tsMARCM就绪苍蝇的后代的存在抑制记者（即 mCD8 :: GFP和rCD2 :: RFP在面板B的G1和G2相）的表达。 FLP的表达通过热休克诱导，然后FLP结合后FLP识别目标（FRTS）介导的分割前体细胞内的同源染色体的位点特异性重组。这导致在双细胞中基于RNAi的抑制器的偏析有丝分裂后，以允许不同的记者的表达。 （C）两个克隆模式在tsMARCM实验中观察到：单细胞，单细胞克隆相关的（一）当FLP系膜细胞中诱导，和两个细胞，GMC，与多细胞-NB相关的克隆（二）当FLP在NB的诱导。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：使用adPNs作为如何在一神经谱系分析进行tsMARCM实验例四tsMARCM克隆。 adPNs四个tsMARCM克隆中示出，与他们的神经发生模式（A，F，K和P）的图;整体脑的共焦图象（B，G，L和Q），示出了侧角（LH; C，H，M和R），触角叶（AL; D，I，N和S）和苏摩（E，J，O和T）;和他们的神经元形态的模式。单adPNs（VL2p，DL1，DC3，以及无GH146 + adPNs;绿色）与tsMARCM克隆的多细胞-NB adPNs（品红色）相关联的被FLP的诱导衍生的胚胎以介导有丝分裂重组的ADPN NB （A - E）和幼虫（F - T）阶段。注意，adPNs处于ALAD1神经系，其结果与图3品红adPNs（原因不明，神经元从ALAD1神经的另一半谱系相关联的单个，绿色ADPN的tsMARCM克隆半侧谱系之一沿袭模具）。 VL2p，DL1，DC3，以及无GH146 + adPNs的出生订单是由在tsMARCM克隆（45，31，21的品红多细胞-NB侧计数adPNs的细胞数15内的虚线确定，并且面板E，J线，O和T）。神经突图案通常在品红多细胞-NB两侧更复杂时tsMARCM克隆在早期发育阶段诱导（ 例如，树枝状图案是在图E更复杂相比面板I，N和S）。 tsMARCM分析有时混淆时其他神经谱系的神经元也由相同的GAL4驱动标记（ 例如，绿色的LH神经元，由双箭头所示，阻碍在图B和C中的VL2p adPNs的轴突阐述图案的可视化） 。脑神经纤维（图中蓝色）与抗Bruchpilot（BRP）抗体染色。热休克时间：12分钟（板A - E），15分钟（图F - J）和35分钟（面板的K - T）。比例尺在图B - E，G - J，L - O，和Q - S = 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该议定书中的关键步骤

步骤1.1.1，1.2.1，2.3，2.5和3.2是获得良好tsMARCM结果是至关重要的。不表达在神经祖细胞GAL4组织特异性-GAL4驱动是优选的步骤1.1.1和1.2.1。避免过度拥挤在步骤2.3在飞食品小瓶生长的动物。因为感应延迟，FLP的在热休克的表达水平，和神经祖细胞（ 即，NBS和系膜）的平均分割时间是未知的，这是最好的，以改变热休克的时间（10，20，30 ，40，和50分钟）在步骤2.5中相同的基因型和发育阶段的不同的样品。这将允许的最佳热休克时间的确定，以便获得感兴趣tsMARCM克隆的最佳比例。此外，在步骤3.2，以获得完整的脑样品蝇脑解剖期间小心;这是用于精确地计数神经元细胞数的关键。对于RESE弓箭谁有兴趣使用tsMARCM研究其他染色体臂基因的功能（ 例如，2R，3L和3R），tsMARCM就绪蝇应当通过选择合适的成对FRT，UAS-的转基因的组装如在步骤1.2 mCD8.GFP.UAS-rCD2i， 和UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi，这在表1中表示。我们还建议女性tsMARCM准备苍蝇携带HS-FLP X染色体（ 例如，HS-FLP ^[22]，W; UAS-rCD2 :: RFP，UAS-GFPRNAi，FRT ^40A; + +）上，这便于反复tsMARCM实验。

修改后，故障排除和技术的局限性

RNA干扰抑制器和记者的效率和perdurance是神经系是否分析和基因功能研究可以在tsMARCM实验成功地进行的主要决定因素。一般地，RNA干扰抑制器低perdurance的组合和记者从神经祖细胞衍生出来的，在有丝分裂后神经细胞高表达的RNAi抑制和记者一起，允许更好的tsMARCM结果。由于RNA干扰抑制器和记者的表达是由GAL4驱动程序控制，研究者应该选择表达GAL4在分化的神经元，但不是在神经祖强GAL4驱动程序。例如，GAL4-OK107是，在蘑菇体（MB）的祖细胞和它们的衍生物，MB的γ，α'/β'，α/β的神经元^11,19表示GAL4强烈GAL4驱动。 MBγ神经元的不忠标签必须在两个克隆模式被观察到（ 即，与多细胞-NB克隆有关的单细胞克隆和双细胞GMC关联的单个细胞）时GAL4-OK107在tsMARCM实验¹¹使用。有趣的是，上述问题可以通过使用MB247-GAL4，不同MB GAL4驱动程序来解决在分化的神经元MB表示¹¹ GAL4。

不是所有的GAL4司机可以在tsMARCM系统或在其它镶嵌标签系统中使用（ 例如，MARCM Q-MARCM，和双点发生器^{）4，20，21，}如果驾驶员没有在感兴趣的神经元中表达。因此，分析，GAL4司机应为其在双表达控制MARCM与泛细胞司机感兴趣的神经元的覆盖试验使用前tsMARCM用于神经谱系（ 例如，微管蛋白启动子-的LexA :: ^GAD）22 。我们注意到，tsMARCM克隆有时不能明确分析，尤其是当使用具有复杂的神经表达图案的GAL4驱动程序（ 例如，绿色侧角（LH）的神经元防止VL2p ADPN的轴突拟订图案的清晰的可视化在图3B和例如，MARCM，Q-MARCM，和双点发生器^{）4，20，21，}因为限制与GAL4驱动程序起源。我们也注意到，要进行抢救实验对基因功能的认证，则救援转基因应在5所述RNAi抑制剂的靶序列'或3'转基因救援构建体非翻译区，或另一种双点进行工程化标签系统（ 例如，再加MARCM，Q-MARCM和常规MARCM的组合^）21应予采纳。

关于到现有/替代方法的技术意义

此外tsMARCM，双点发生器以及耦合MARCM还将，至少在理论上，允许的可视化在两种不同颜色常见神经祖细胞衍生的神经元（这三个镶嵌标签技术的比较以前已提出^15）。用于组装双点发生器，（或tsMARCM的新版本）的原始版本tsMARCM所需转基因的最小数量，以及耦合MARCM是4,8（或6），和9中，分别。然而，tsMARCM是已被用来进行全面的神经系分析^{12，15，18，23}的系统。位点特异性重组确实发生在非有丝分裂细胞中的双点发生器系统，这导致在相同的小区中的两位记者的共表达，使其具有挑战性的使用本系统来研究中心的发展神经系统^15。与此相反，在tsMARCM获得镶嵌克隆和耦合MARCM系统一再从有丝分裂细胞。然而，由于耦合MARCM系统需要两个独立的驱动器，以控制在Q-MARCM和常规MARCM系统不同记者的表达，这引起了人们对从共同的神经祖细胞衍生的神经元的标记的关注，如果两个独立的驱动器没有忠实标记感兴趣的¹⁵系神经相同神经元。

掌握技术后，未来的应用方向或

使用tsMARCM进行高分辨率的神经系分析
通过应用在图3中使用，系统地分析adPNs的tsMARCM克隆，40种adPNs的方法，共82元的，在先前的研究确定^了12项。其中40种adPNs中，35个单肾小球adPNs（即支配的触角叶（AL）的单一肾小球），其RELAY嗅觉信息传递给大脑果蝇 ¹²的其他地区（见 图2-4中宇等 ，2010）。其他五种类型adPNs都是聚肾小球adPNs（即支配的AL多个肾小球），这可能嗅觉信息从AL整合和嗅觉系统¹²提供的功能复杂的附加水平（参见图3E-3H和4Z在Yu等 ，2010）。胚胎出生的adPNs具有每类型只有一个神经元，而幼虫出生adPNs由每型多重神经元表示的，这表明有在嗅觉系统¹²特异性和冗余之间相互作用（见图中俞2-4。等 ， 2010）。有趣的是，某些发育窗内产生的神经元是注定要死亡，和许多类型的adPNs都与一个固定数量的ALAD1神经系神经元的发现，表明number和类型adPNs的用于组装嗅觉系统被严格调节^12（见图2H，4V和5在Yu 等人，2010;也参见图3P - 3T）。

使用tsMARCM准确地研究基因功能
除了出生约会adPNs，tsMARCM也被应用以确定GAL4-OK107标记中部六复杂神经元的出生顺序。这六个神经元弥补在LALv1神经谱系神经元向果蝇中央复杂的电路来控制复杂的运动模式^2，11的一小部分（参见图4a和4b在Yu等人 ，2009）。有趣的是，这些中部六复杂的神经元具有明显的神经元形态^11（见图4D-4H和40中宇等 ，2009）。他们都携带不同的轴突模式中后期拉尔附件叶（LAL）。前四个神经元分发其树突到noduli，中央复杂的子结构的子隔室，而其余的两个神经元投射其树突于椭球体，中央复杂的另一个子结构。具体而言，第3 ^次 -born中央复杂的神经元投射其树突向腹侧noduli，随着LAL紧凑轴索图案，而第4 ^次 -born中央复杂的神经元分发其树突向背侧noduli，具有在宽的轴突图案鲎^11（见图4F和4G在Yu 等，2009）。

除了全面识别神经元，tsMARCM的力量将是感兴趣的神经元研究基因功能更好地举例说明，因为tsMARCM系统允许更好的表型通过启用不同的动物相同的神经元的研究分析。例如，tsMARCM检测单时间发在^第三 -born复杂的中央¹¹元，需要按时间顺序不当形态E更改（chinmo，一个BTB-锌指核蛋白）（见图4I，4P前，4w在Yu 等，2009）。如果chinmo突变已特征在于在原MARCM系统（ 即，单绿色标记的神经元，而不从双细胞作为基准的关联的两侧衍生的神经元的标记），如图4I从所示的chinmo缺陷型神经元Yu 等。 ，2009年将有被误认为^第 4 -born，而不是3 ^次 -born，中央复杂的神经元。这将导致chinmo功能的误解，作为控制轴突导向，而不是指定时间的命运^11（来自于图4I双箭头等 ，2009）。然而，通过使用tsMARCM克隆的品红多细胞-NB侧作为第Ë引用（通过计数细胞数 图4M，4N，距离豫园等4P。 ，2009年），来自于等人在图4I所示的chinmo缺陷型神经元。 ，2009）被证明是^第三 -born中央复杂的神经元，因此这导致了正确的结论，即chinmo功能为中心复杂的神经元¹¹颞命运规范。两者合计，上述结果突出tsMARCM系统的高分辨率的表型分析，从而精确地披露的基因功能中的神经元（或其它类型的细胞，如适用）以供将来神经发育研究的重要的优点（或其它的发育研究组织）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones