Cell Lineage Analyser og genfunktion undersøgelser under anvendelse af Twin-spot MARCM

Summary

Her præsenteres en protokol for en mosaik mærkningsteknik, der tillader visualisering af neuroner afledt fra en fælles progenitorcelle i to forskellige farver. Dette letter neurale afstamning analyse med mulighed for medfødte-dating individuelle neuroner og studere genfunktion i de samme neuroner i forskellige individer.

Abstract

M osaic ANALYSE med en r epressible c ell m arker (MARCM) er en positiv mosaik mærkningsordning, der har været almindeligt anvendt i Drosophila neurobiologiske undersøgelser for at skildre indviklede morfologier og at manipulere funktionen af gener i delmængder af neuroner inden ellers umærket og uforstyrret organismer. Genetiske mosaikker frembragt i MARCM systemet medieres via stedspecifik rekombination mellem homologe kromosomer inden dividere precursorceller til at fremstille både mærket (MARCM kloner) og umarkerede datterceller under mitosen. En forlængelse af MARCM metode, kaldet twin-spot MARCM (tsMARCM), etiketter begge de to celler afledt fra en fælles stamfader med to forskellige farver. Denne teknik blev udviklet for at muliggøre hentning af nyttige oplysninger fra begge hemi-afstamninger. Ved omfattende analyse af forskellige par tsMARCM kloner, det tsMARCM system giver høj opløsning neurale afstamning Mapping at ​​afsløre den nøjagtige fødsel-rækkefølgen af ​​de mærkede neuroner fremstillet af almindelige progenitorceller. Endvidere tsMARCM systemet udvider også genfunktion undersøgelser ved at tillade den fænotypiske analyse af identiske neuroner i forskellige dyr. Her beskriver vi, hvordan man anvender den tsMARCM systemet for at lette undersøgelser af neural udvikling i Drosophila.

Introduction

Hjernen, består af et stort antal og forskellige typer af neuroner, forlener dyr med evnen til at opfatte, proces, og svare udfordringer fra den ydre verden. Neuroner i den voksne Drosophila centrale hjerne er afledt fra et begrænset antal af neurale stamceller, der kaldes neuroblaster (NBS), under udviklingen ^{1, 2.} De fleste af NBS deltager i hjernen neurogenese i Drosophila gennemgå asymmetrisk division at generere selvfornyende bemyndigede organer og ganglion mor celler (GMC'er), og GMC derefter gå gennem en anden runde af divisionen for at fremstille to datterceller, som differentierer til neuroner ³ (figur 1A ). På grund af de forviklinger af neuronal morfologi og de udfordringer, der er forbundet med at identificere specifikke neuroner, en positiv mosaik mærkning teknologi, mosaik analyse med repressibel celle markør (MARCM), blev opfundet for at gøre det muligt for visualization af en enkelt neuron eller en lille delmængde af neuroner ud af populationen af omkringliggende, umærkede neuroner ^4.

MARCM udnytter flippase (FLP) / target FLP anerkendelse (FRT) system til at mediere stedsspecifik rekombination mellem homologe kromosomer i en skillelinje precursorcelle bærer en heterozygot allel af et repressorgen, hvis ekspression normalt inhiberer ekspressionen af et reportergen ^4. Efter den mitotiske deling, er de rekombinante kromosomer opdelt i to celler, således at en celle indeholder homozygote alleler af repressorgenet og det andet celle har ingen repressorgen-ekspressionen af ​​reporteren i denne celle (og dens efterkommere) ikke længere blokeret ^4. Tre klonale mønstre findes normalt i en MARCM eksperiment når FLP er stokastisk induceret i bemyndigede organer eller GMC: encellede og to-celle-GMC-kloner, der afbilder neuronal morfologi ved encellede resolutioN og flercellede-NB-kloner, som afslører hele morfologiske mønstre af neuroner afledt fra en fælles NB (figur 1B). Den MARCM Teknikken har været almindeligt anvendt i Drosophila neurobiologiske undersøgelser, herunder i neuronal identifikation type for rekonstruktion hjerne-dækkende ledninger netværk, neurale afstamning analyser for at videregive den udviklingsmæssige historie af neuroner, fænotypisk karakterisering af gen-funktioner, der er involveret i celle skæbne specifikation, og neuronal morfogenese og differentiering undersøgelser ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Fordi konventionelle MARCM kun etiketter en af ​​de to datterceller (og slægter) efter den inducerede mitotisk rekombination omstændigheder er potentielt nyttige oplysninger fra den umarkerede side tabt. Denne begrænsning til hinder for anvendelsen af ​​de grundlæggende MARCM system høj opløsning analyser af mange neurale slægter, der skifter celleskæbner i hurtig tempo eller til præcision analyser af genfunktioner i identiske neuroner i forskellige dyr ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) er et avanceret system, der etiketter neuroner afledt fra en fælles stamfader med to forskellige farver, som gør det muligt inddrivelse af nyttige oplysninger fra begge sider af de to celler, således at overvinde begrænsningen af det oprindelige MARCM systemet ¹¹ ( Figur 2A - 2C). I tsMARCM systemet, to RNA-interferens (RNAi) -baserede suppressorer er beliggende ved trans-steder af homologe kromosomer i en precursor-celle, og ekspressionen af disse suppressorer uafhængigt inhibere ekspressionen af deres respektive reportere (figur 2B). Efter stedsspecifik mitotisk rekombination medieret gennem FLP / FRT-system, two RNAi-baserede suppressorer bliver adskilt til to celler til at tillade ekspression af særskilte reportere (figur 2B). To klonale mønstre, encellede forbundet med encellede kloner og to-celle-GMC forbundet med multi-cellulære-NB-kloner, der typisk ses i en tsMARCM eksperiment (figur 2C). Oplysninger stammer fra den ene side af de to celler kan anvendes som reference for den anden side, så høj opløsning neurale afstamning analyser, såsom fødsel-dating de mærkede neuroner, og fænotypiske analyser af identiske neuroner i forskellige dyr for den præcise undersøgelse af neural genfunktion ^{11, 12.} Her præsenteres en trin-for-trin-protokol, der beskriver hvordan man fører en tsMARCM eksperiment, der kan bruges af andre laboratorier til at udvide deres undersøgelser af neural udvikling (samt udvikling af andre væv, hvis relevant) i Drosophila.

Protocol

1. Byg tsMARCM-klar Fluer med det nødvendige Transgener ^{11, 13}

1. Generer den oprindelige version af tsMARCM-ready fluer fra transgener, der gennemføres af de enkelte fluer ¹¹ (se tabel 1). Gennemføre standard flyve genetiske krydsende ordninger, som tidligere er blevet beskrevet, ved at sætte flere transgener i de samme flyve bestande ^13.
   1. I én parental linie, samle transgenerne ifølge FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (den første reporter, mCD8 :: GFP ekspression af transgenet er under kontrol af den opstrøms aktiveringssekvens promotor, som frembringer en membran-forankret reporter af muse cluster of differentiation 8-protein fusioneret med grønt fluorescerende protein), og UAS-rCD2RNAi (suppressor der inhiberer ekspressionen af den anden reporter, RNAi mod ekspressionen af rotte klynge of differentiering 2, rcd2) på venstre arm af ^2. kromosomet. Placere vævsspecifik -GAL4 driver på X eller ^3. kromosom, hvis muligt.
   2. I den anden parentale linje, samle transgenerne ifølge FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (den anden reporter, rCD2 :: RFP, den anden membran-forankrede reporter bestående af rCD2 fusioneret med rødt fluorescerende protein), og UAS-GFPRNAi (undertrykkeren, der inhiberer ekspressionen af mCD8 :: GFP; RNAi mod ekspressionen af GFP) på venstre arm af ^2. kromosomet. Placer varme-shock (hs) -FLP eller væv-udtrykke- FLP på X ^3. kromosom, hvis det er muligt.
2. Generer den nye version af tsMARCM-ready fluer fra transgener, der gennemføres af de enkelte fluer ¹⁴ (se tabel 1). Gennemføre standard flyve genetiske krydsende ordninger, som er blevet beskrevet previously, ved at sætte flere transgener i de samme flyve bestande ^13.
   1. I én parental linie, samle transgenerne ifølge et FRT-sted og UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (en samlet transgen mCD8 :: GFP og undertrykkeren, der inhiberer ekspressionen af rCD2 :: RFP) sammen i den samme arm af den ^2. eller ^3. kromosom (passende par af transgener af FRT og UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i er angivet i tabel 1). Placer vævsspecifikke-GAL4 driver på andre end kromosomet af den valgte FRT-stedet, hvis det er muligt kromosomer.
   2. I den anden parentale linje, samle transgenerne ifølge et FRT-sted og UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (den anden kombinerede transgen af rCD2 :: RFP og undertrykkeren, der inhiberer ekspressionen af mCD8 :: GFP) i den samme arm af de 2 ^nd eller ^3. kromosom (passende par af transgener af FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi er angivet i tabel 1). Place hs-FLP eller vævsspecifikke-FLP for andre end kromosomet af den valgte FRT-stedet, hvis det er muligt kromosomer.

2. Cross tsMARCM-ready Fluer at generere tsMARCM kloner i deres afkom

1. Cross tsMARCM-ready fluer sammen (f.eks sætte 10-15 mandlige fluer fra trin 1.1.1 eller 1.2.1 og 20-30 jomfru kvindelige flyver fra trin 1.1.2 eller 1.2.2 sammen) i et hætteglas flyve-mad med friske -made gær indsæt på væggen af ​​hætteglasset.
2. Oprethold de krydsede tsMARCM-ready fluer ved 25 ° C i 2 dage for at forbedre chancen for parring før indsamlingen befrugtede æg.
3. Ofte overføre krydsede tsMARCM-ready fluer i frisk yeasted hætteglas for at undgå fortrængning (tryk ned fluer eller brug kuldioxid til at bedøve fluerne for at lette overførslen, holde ikke mere end 80-100 befrugtede æg i en 10 ml fly-mad vial at undgå alt for mange klækkede larver).
4. Kultur de tsMARCM dyr (dvs. befrugtede æg; et eksempel på genotypen af tsMARCM dyr, som anvendes i figur 3, er hs-FLP ^[22], vægt / vægt; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), der er blevet lagt i serielt overført hætteglas ved 25 ° C, indtil de udvikler til de ønskede faser (f.eks embryoner, larver, eller pupper).
5. Placer de overførte hætteglas, der indeholder tsMARCM dyr på samme udviklingstrin til et 37 ° C vandbad i 10, 20, 30, 40 og 50 min for at bestemme det optimale tidspunkt af varme-shock, som inducerer ekspressionen af ​​FLP at generere tsMARCM kloner af interesse. Spring dette trin over, hvis væv-udtrykke- FLP bliver brugt i tsMARCM eksperimentet (hs-FLP foretrækkes til neural afstamning analyser årsagerne til denne præference er blevet beskrevet tidligere ¹⁵).
   BEMÆRK: Gentag trin 2.5 ved hjælp af den optimale tidspunkt af varme-shock i fremtidige tsMARCM eksperimenter, hvis flere tsMARCM kloner af interesse ønsket; generelt, er mere FLP udtryk induceret i hs-FLP ^[22] sammenlignet med hs-FLP ^[1] med det samme varme-shock tid.
6. Kultur varmen-chokeret tsMARCM dyr ved 25 ° C, indtil de har nået en passende udviklingsstadiet, og derefter gå videre til trin 3.

3. Forbered, Bejdse, og Mount flyve Brains indeholdende tsMARCM Clones

1. Forbered pincet-beskyttelse retter. Bland del A (30 g) og del B (3 g), Silicone Elastomer Kit med aktiveret trækul (0,25 g). Hæld blandingen i passende retter.
2. Dissekere larval, puppe eller voksne hjerner ud af de tsMARCM dyr i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) ved anvendelse af pincetter på en pincet-beskyttelse skålen betragtes gennem et dissektionsmikroskop. BEMÆRK: En protokol til flue hjernen dissektion har været faldenderibed tidligere ^16.
3. Fix fluen hjerner i et glas spot plade med 1x PBS indeholdende 4% formaldehyd ved stuetemperatur i 20 minutter. Proces fluen hjerner i dette glas spot plade for resten af ​​trinene.
4. Skyl flyve hjerner tre gange med 1% PBT (1x PBS indeholdende 1% Triton X-100) og vaske dem tre gange i 30 min hver i 1% PBT (skyl: Fjern PBT og tilføje nye PBT hurtigt, vask: Fjern PBT, tilføje nye PBT og inkuberes fluen hjerner i den nye PBT bruger en orbitalryster).
5. Inkubér flyve hjerner med blandingen af ​​primære antistoffer natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur. Et eksempel på blanding af primære antistoffer er rotte-anti-CD8-antistof (1: 100), kanin-anti-DsRed antistof (1: 800), og muse-anti-Bruchpilot (BRP) antistof (1:50) i 1% PBT indeholdende 5% normalt gedeserum (NGS).
6. Skyl flyve hjerner tre gange med 1% PBT, og derefter vaske dem tre gange i 30 min hver med 1% PBT.
7. Skyl flyve hjerner tre gange med 1% PBT, og derefter vaske dem tre gange i 30 min hver med 1% PBT. Montere dem på en mikro objektglas med et anti-quenching reagens. Sæt en mikro dækglas på mikro dias til at dække og beskytte flyve hjerner. Seal kanter mikro dækglasset og mikro slide hjælp klar neglelak. Opbevar disse monteret og forseglet flyve hjerne prøver ved 4 ° C.

4. Tag, Proces, og Analyser Fluorescerende Billeder af tsMARCM Clones

1. Capture fluorescerende billeder af tsMARCM kloner frabout prøverne blev oprettet i trin 3.8 ved hjælp af konfokal mikroskopi foretrukne system.
2. Projekt stakke af tsMARCM konfokal fluorescerende billeder i to-dimensionelle, fladtrykt billeder med billedbehandling software leveres med konfokal mikroskopi foretrukne system (se figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, og 3. kvartal - 3T for eksempler på fladtrykt konfokal fluorescerende billeder).
3. Tæl celle antallet af de multi-cellulære-NB sider af tsMARCM kloner bruger en passende billedbehandling software (f.eks den "Cell Counter" funktion i ImageJ ^17, se figur 3E, 3J, 3O, og 3T for eksempler på cellen organer neuroner).

Representative Results

Den tsMARCM systemet er blevet anvendt til at lette neurale afstamning analyser og genfunktion undersøgelser ved at hente vigtige oplysninger om neuroner afledt af almindelige bemyndigede organer. Systemet er blevet brugt til at identificere de fleste (hvis ikke alle) neuronale typer, fastlægge celle antallet af hver neuronal type, og fastslå fødsel-rækkefølgen af disse neuroner ^{11, 12, 18} (se Diskussion Sektion for detaljer om brug tsMARCM til gennemføre neurale afstamning analyser eller genfunktion undersøgelser). Her brugte vi fire tsMARCM kloner af anterodorsal olfaktoriske projektion neuroner (adPNs i ALad1 neurale afstamning af Drosophila olfaktoriske systemet) mærket med GAL4-GH146 som eksempler til at illustrere, hvordan at foretage en tsMARCM eksperiment ^{1, 2.} Efter FLP blev induceret i fosterstadiet, en single, grøn VL2p adPN forbundet med 45 magenta adPNs blev påvist i en tsMARCM klon (figur 3A - 3E). I modsætning hertil, da FLP blev induceret senere, på forskellige larvestadier, enlige, grønne adPNs (DL1 adPN eller DC3 adPN) eller no-GH146 + adPNs forbundet med forskellige antal magenta adPNs (31, 21, eller 15) blev observeret i tre andre tsMARCM kloner (Figur 3F - 3T). Fødsel VL2p adPNs før fødsel DL1-, DC3- og ingen GH146 + -adPNs blev bestemt ved at tælle celletal af adPNs i deres associerede flercellede-NB sider af tsMARCM kloner (45, 31, 21, og 15 i figur 3E, 3J, 3O, og 3T, henholdsvis). Ud over at tælle celleantal, kompleksiteten af ​​axonale og dendritiske mønstre i de flercellede-NB sider af tsMARCM kloner kan anvendes til at bestemme den relative fødsel ordens deres tilknyttede to-celle-GMC sider aftsMARCM kloner. Mosaik kloner induceret på tidlige udviklingsstadier indeholder normalt flere neuroner og dermed have mere kompleks axonal og dendritiske mønstre, mens mosaik kloner induceret på sene udviklingsstadier indeholder færre neuroner og dermed har mindre komplekse axonal og dendritiske mønstre (figur 3C - 3D, 3H - 3I , 3M - 3N, og 3R - 3S).

Figur 1: skematiske illustrationer af Drosophila neurogenese og de tre typer af klonale mønstre findes i en MARCM eksperiment. (A) Et skematisk diagram, der illustrerer neurogenese i de fleste neurale afstamninger af Drosophila centrale hjerne: neuroblaster (NBS) undergår et asymmetrisk division at generere selvfornyende bemyndigede organer og ganglion mor celler (GMC), og GMC opdele en gang mere for at fremstille to datterceller neuroner (NS). (B) Tre klonede mønstre observeres i en MARCM eksperiment: encellede-kloner (a), når flippase (FLP) induceres i GMC, og to-celle-GMC-kloner (b) og multi-cellulære-NB-kloner (c ), når FLP induceres i bemyndigede organer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Skematisk tegning af de tsMARCM systemet. (A) tsMARCM-ready fluer: én parental flue indeholder transgenerne ifølge et FRT-sted og UAS-mCD8 :: GFP (den første reporter), UAS-rCD2RNAi (den første suppressor der inhiberer ekspressionen af den anden reporter), og et væv -specifikke -GAL4; den anden parentale flue indeholder en FRT UAS-rCD2 :: RFP (den anden reporter), UAS-GFPRNAi (den anden suppressor der inhiberer ekspressionen af den første reporter), og hs-FLP. (B) Tilstedeværelsen af de to RNAi-baserede suppressorer i afkommet af de krydsede tsMARCM-ready fluer inhiberer ekspressionen af reportere (dvs. mCD8 :: GFP og rCD2 :: RFP i G1 og G2 faser af felt B). Ekspressionen af ​​FLP er fremkaldt af varme-shock, og FLP medierer så stedspecifikke rekombination af homologe kromosomer inden en skillelinje forstadie celle efter binding til mål FLP anerkendelse (FRTS). Dette resulterer i adskillelse af RNAi-baserede suppressorer i twin celler efter mitotiske deling for at tillade ekspressionen af ​​distinkte reportere. (C) To klonede mønstre observeres i en tsMARCM eksperiment: encellede, der er forbundet med encellede kloner (a) når FLP induceres i GMC, og to-celle-GMC, der er forbundet med multi-cellulære-NB-kloner(B) når FLP induceres i bemyndigede organer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Brug fire tsMARCM kloner af adPNs som eksempler på, hvordan man kan gennemføre en tsMARCM eksperiment i et neuralt afstamning analyse. Fire tsMARCM kloner af adPNs er illustreret med diagrammer over deres neurogenese mønstre (A, F, K, og P); konfokale billeder af den samlede hjerne (B, G, L og Q), der viser den laterale horn (LH, C, H, M, og R), den antennal lobe (AL, D, I, N og S) og soma(E, J, O og T); og mønstre i deres neuronale morfologier. Single adPNs (VL2p, DL1, DC3, og ingen GH146 + adPNs; grøn) er forbundet med multi-cellulære-NB adPNs (magenta) af tsMARCM kloner blev afledt ved induktion af FLP at mediere mitotisk rekombination i adPN NB i fosterstadiet (A - E) og larver (F - T) etaper. Bemærk, at adPNs er en af de hemi-slægter i ALad1 neurale afstamning, hvilket resulterer i tsMARCM kloner af en enkelt, grøn adPN forbundet med magenta adPNs i figur 3 (af ukendte årsager, neuroner fra den anden hemi-slægt af ALad1 neurale afstamning matrice). Fødslen-orden VL2p, DL1, DC3, og ingen GH146 + adPNs blev bestemt ved at tælle celle numre af adPNs i magenta flercellede-NB sider af tsMARCM kloner (45, 31, 21 og 15 inden for den stiplede linjer af panelerne E, J, O og T). De neurit mønstre er normalt mere kompleks i magenta flercellede-NB siderne, når de tsMARCM kloner induceres på tidlige udviklingsstadier (f.eks den dendritiske mønster er mere kompleks i panel E sammenlignet med paneler I, N og S). tsMARCM analyser er undertiden forvirrende, når neuroner i andre neurale slægter er også mærket med samme GAL4 driver (fx grønne LH neuroner, vist med dobbeltpilene, hindrer visualisering af axonal udarbejdelse mønstret af VL2p adPNs i paneler B og C) . Brain neuropiles (vist med blåt) blev farvet med antistof mod Bruchpilot (BRP). Heat-shock tid: 12 min (paneler A - E), 15 min (paneler F - J), og 35 min (paneler K - T). Scale bar i paneler B - G - J, L - O, og Q - S = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Trin 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, og 3.2 er kritiske for at opnå gode tsMARCM resultater. Vævsspecifikke -GAL4 drivere, der ikke udtrykker GAL4 i neurale progenitorer foretrækkes til trin 1.1.1 og 1.2.1. Undgå over-fortrængning af dyrene, der dyrkes i de fly-food hætteglas i trin 2.3. Fordi induktion latenstid, ekspressionsniveauet af FLP upon varmechok, og den gennemsnitlige skillelinje tid af neurale stamceller (dvs. NBS og GMC'er) ikke er kendte, er det bedst at variere varmechok tid (10, 20, 30 , 40, og 50 min) på forskellige prøver af den samme genotype og udviklingsstadiet i trin 2.5. Dette vil give mulighed for bestemmelse af den optimale varmechok tid for at opnå det bedste forhold mellem tsMARCM kloner af interesse. Derudover være forsigtig under flyve hjerne dissektion i trin 3.2 for at opnå intakte hjerne prøver; dette er afgørende for præcist at tælle neuronale celle numre. For resebueskytter, der er interesseret i at bruge tsMARCM for at studere funktionen af gener på andre kromosom arme (f.eks 2R, 3L, og 3R), tsMARCM-ready fluer skal samles som i trin 1.2 ved at vælge passende par af transgener af FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i, og UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, som er angivet i tabel 1. Vi anbefaler også, at de kvindelige tsMARCM-klar fluer bære hs-FLP på X-kromosomet (f.eks hs-FLP ^[22], w; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), som letter gentagne tsMARCM eksperimenter.

Ændringer, fejlfinding og begrænsninger Teknik

Effektiviteten og perdurance af RNAi undertrykkere og journalister er de vigtigste determinanter for, hvorvidt neurale afstamning analyser og genfunktion undersøgelser med held kan udføres i tsMARCM eksperimenter. Generelt kombinationen af ​​lav perdurance af RNAi suppressorer ogjournalister afledt af neurale stamceller sammen med høj ekspression af RNAi undertrykkere og journalister i post-mitotiske neuroner, tillader bedre tsMARCM resultater. Fordi ekspression af RNAi undertrykkere og journalister er kontrolleret af GAL4 chauffører, bør forskerne vælge stærke GAL4 drivere, der udtrykker GAL4 i differentierede neuroner, men ikke i neurale stamceller. For eksempel GAL4-OK107 er en stærk GAL4 driver, der udtrykker GAL4 i champignon krop (MB) stamfædre og deres derivater, MB γ, α '/ β', og a / p neuroner ^{11, 19.} Unfaithful mærkning af MB y-neuroner er blevet observeret i to klonale mønstre (dvs. encellede forbundet med encellede kloner og to-celle-GMC forbundet med multi-cellulære-NB kloner) når GAL4-OK107 blev anvendt i tsMARCM forsøg ¹¹ . Interessant nok kan den ovennævnte spørgsmål løses ved hjælp MB247-GAL4, en anden MB GAL4 driverder udtrykker GAL4 i differentierede MB neuroner ^11.

Ikke alle GAL4 drivere kan bruges i tsMARCM system eller i andre mosaik mærkningsordninger (f.eks MARCM, Q-MARCM, og twin-spot generator) ^{4, 20, 21,} hvis føreren ikke er udtrykt i neuroner af interesse. Derfor, før du bruger tsMARCM for neural slægt analyser, GAL4 chauffører bør testes for deres dækning af de neuroner af interesse i dual-udtryk-kontrol MARCM med en pan-celle driver (f.eks tubulin-promotor-LexA :: GAD) ²² . Vi bemærker, at tsMARCM kloner kan undertiden ikke analyseres utvetydigt, især når der anvendes en GAL4 driver med et komplekst neural ekspressionsmønster (f.eks grøn lateral horn (LH) neuroner forhindre klar visualisering af axonal udarbejdelse mønster af VL2p adPN i figur 3B og (f.eks MARCM, Q-MARCM, og twin-spot generator) ^{4, 20, 21} fordi begrænsningen stammer med GAL4 driver. Vi bemærker også, at, til at udføre redningsaktioner forsøg med godkendelse af gen-funktioner, bør redning transgenerne blive manipuleret med target sekvenser af RNAi undertrykkere i 5 'eller 3' utranslaterede regioner af de transgene rednings-konstruktioner, eller et alternativt to-spot mærkning (f.eks koblet MARCM, en kombination af Q-MARCM og konventionel MARCM) der bør vedtages ^21.

Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder

Udover tsMARCM, twin-spot generator og koblede MARCM vil også, i det mindste i teorien, give mulighed for visualisering afneuroner afledt af almindelige neurale stamceller i to forskellige farver (en sammenligning af disse tre mosaik teknologier mærkning er tidligere blevet præsenteret ^15). Det mindste antal transgener kræves for montage twin-spot generator, den originale version af tsMARCM (eller den nye version af tsMARCM), og koblede MARCM er 4, 8 (eller 6), og 9, hhv. Men tsMARCM er det eneste system, der er blevet anvendt til at udføre omfattende neurale afstamning analyser ^{12, 15, 18, 23.} Stedspecifik rekombination forekommer i ikke-mitotiske celler i dobbelte stedet generatorsystem, og dette fører til co-ekspression af de to reportere i den samme celle, hvilket gør det svært at bruge dette system til at undersøge udviklingen af ​​den centrale nervesystem ^15. I modsætning hertil mosaik kloner opnået i tsMARCM og koblede MARCM systems are afledt af mitotiske celler. Men fordi den koblede MARCM kræver to uafhængige chauffører til at styre ekspressionen af ​​de forskellige journalister i Q-MARCM og konventionelle MARCM systemer, dette giver anledning til bekymring om mærkning af neuroner, der stammer fra fælles neurale stamfædre, hvis de to uafhængige chauffører ikke trofast mærke de samme neuroner i de neurale slægter af interesse ^15.

Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Teknik

Brug tsMARCM at gennemføre høj opløsning neurale afstamning analyser
Ved at anvende den metode, der anvendes i figur 3 til systematisk at analysere tsMARCM kloner af adPNs, 40 typer af adPNs, med i alt 82 neuroner, blev identificeret i en tidligere undersøgelse ^12. Blandt disse 40 typer af adPNs, 35 var uni-glomerulære adPNs (dvs. der innerverer en enkelt glomerulus i antennal lap (AL)), der relay olfaktoriske information til andre regioner i Drosophila hjernen ¹² (se Figur 2-4 i Yu et al., 2010). De øvrige fem typer af adPNs var poly-glomerulære adPNs (dvs. innerverer multipel glomeruli i AL), som kunne integrere olfaktoriske oplysninger fra AL og give et ekstra niveau af funktionel kompleksitet til olfaktoriske system, ¹² (se figur 3E-3H og 4Z i Yu et al., 2010). Embryonale-fødte adPNs har kun én neuron per type, hvorimod larvestadium-fødte adPNs repræsenteres af flere neuroner per type, hvilket antyder, at der er samspil mellem specificitet og redundans i lugtesystemet ¹² (se figur 2-4 i Yu et al., 2010). Interessant er neuroner produceret i visse udviklingsmæssige vinduer bestemt til at dø, og mange typer af adPNs findes med et fast antal neuroner i ALad1 neurale afstamning, hvilket antyder, at number og typer af adPNs til at samle det olfaktoriske system stramt reguleret ¹² (se figur 2H, 4V, og fem i Yu et al, 2010;. også se figur 3P - 3T).

Brug af tsMARCM til præcist studere genfunktioner
Udover fødsel-dating adPNs har tsMARCM også blevet anvendt til at bestemme fødsel-ordre af seks centrale komplekse neuroner mærket af GAL4-OK107. Disse seks neuroner udgør en lille delmængde af neuroner i LALv1 neurale afstamning, der bidrager til kredsløbet i Drosophila centrale kompleks til at styre indviklede motordrevne mønstre ^{2, 11} (se figur 4a og 4b i Yu et al., 2009). Interessant, idet hver af disse seks centrale komplekse neuroner har en distinkt neuronal morfologi ¹¹ (se figur 4D-4h og 4o i Yu et al., 2009). Alle af dem bærer tydelige axonale mønstre i slutningenral tilbehør lap (LAL). De første fire neuroner distribuere deres dendritter til sub-rum i noduli, en sub-struktur af den centrale kompleks, mens de resterende to neuroner projicerer deres dendritter til ellipsoiden kroppen, en anden sub-struktur af den centrale kompleks. Konkret ^3. -born centrale kompleks neuron projekter sine dendritter til de ventrale noduli, med en kompakt axonal mønster i LAL, mens 4 ^th -born centrale kompleks neuron distribuerer sine dendritter til dorsale noduli, med en bred axonal mønster i LAL ¹¹ (se figur 4f og 4g i Yu et al., 2009).

Beyond omfattende identificere neuroner, vil kraften i tsMARCM være bedre eksemplificeret ved at studere genfunktioner i neuroner af interesse, da tsMARCM systemet tillader bedre fænotypiske analyser ved at muliggøre undersøgelse af identiske neuroner i forskellige dyr. For eksempel tsMARCM detekterer en enkelt tidsmæssig fedte forandring, der kræver kronologisk upassende morfogenese (chinmo, en BTB-zink finger nuklear protein) i ^3. -born centrale komplekse neuroner ¹¹ (se figur 4i, 4p, og 4w i Yu et al., 2009). Hvis chinmo mutationen var blevet karakteriseret i den oprindelige MARCM systemet (dvs. enkelt grøn-mærkede neuroner uden mærkning af neuroner afledt fra de associerede sider af de to celler som reference), chinmo deficiente neuron vist i figur 4i fra Yu et al. 2009 ville være blevet fejlagtigt som den ^4. -born, snarere end den ^3. -born, central kompleks neuron. Dette ville have resulteret i fejlfortolkning af chinmo funktion som kontrollerende axonal vejledning i stedet angive tidsmæssig skæbne ¹¹ (dobbelt-pil i figur 4i fra Yu et al., 2009). Men ved hjælp af magenta flercellede-NB sider af tsMARCM kloner som the reference (via tælle celletal i Figur 4m, 4n, og 4p fra Yu et al. , 2009), den chinmo deficiente neuron vist i figur 4i fra Yu et al. , 2009) viste sig at være den ^3. -born centrale kompleks neuron, som derfor førte til den korrekte konklusion, at chinmo funktioner i tidsmæssig skæbne specifikation for centrale komplekse neuroner ^11. Tilsammen ovenstående resultater fremhæve de vigtige fordele ved tsMARCM systemet for høj opløsning fænotypiske analyser, og dermed præcist afsløre genfunktioner i neuroner (eller andre typer af celler, hvis relevant) til fremtidige neurale udviklingsmæssige undersøgelser (eller de udviklingsmæssige undersøgelser af andre væv).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones