Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Abstract

M osaic bestudeert de analyse met een r epressible c ell m Arker (MARCM) is een positief mozaïek etikettering systeem dat op grote schaal in Drosophila neurobiologische studies heeft toegepast op ingewikkelde morfologie verbeelden en om de functie van genen in subsets van neuronen in anderszins ongemarkeerde en onverstoorbaar te manipuleren organismen. Genetische mozaïeken gegenereerd in het systeem MARCM uitgeoefend via plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen in delende voorlopercellen zowel gemerkt (MARCM klonen) en ongemarkeerde dochter cellen tijdens mitose. Een uitbreiding van de MARCM methode, genaamd tweeling ter plaatse MARCM (tsMARCM), label beide twee cellen afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren. Deze techniek werd ontwikkeld voor het opvragen van nuttige informatie van beide hemi-lineages inschakelen. Door uitvoerig analyseren van verschillende paren tsMARCM klonen, het tsMARCM systeem maakt hoge-resolutie neurale afkomst mapping om de exacte geboorte-orde van de gelabelde neuronen geproduceerd uit gemeenschappelijke voorlopercellen te onthullen. Bovendien is het systeem tsMARCM zich ook genfunctie studies door toe de fenotypische analyse van identieke neuronen van verschillende dieren. Hier beschrijven we hoe u de tsMARCM systeem om studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in Drosophila bevorderen toe te passen.

Introduction

De hersenen, bestaande uit een groot aantal en verschillende soorten neuronen, begiftigt dieren de mogelijkheid om waar te nemen, te verwerken en te reageren op de uitdagingen van de buitenwereld. Neuronen van de volwassen Drosophila centrale hersenen zijn afgeleid van een beperkt aantal neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI), tijdens de ontwikkeling ^{1, 2.} Het grootste deel van de AI's die deelnemen aan de hersenen neurogenese in Drosophila ondergaan asymmetrische divisie zelf-vernieuwing NBs en ganglion moeder cellen (GMC's) te genereren, en de GMC ga dan via een andere ronde van de divisie twee dochter cellen die differentiëren tot neuronen ³ te produceren (Figuur 1A ). Vanwege de complexiteit van neuronale morfologie en de uitdagingen in verband met het identificeren van specifieke neuronen, een positieve mozaïek labeling technologie, mozaïek analyse met een onderdrukbare cel marker (MARCM), werd uitgevonden om het mogelijk te maken visualization van een enkel neuron of een klein deel van neuronen uit van de bevolking van de omgeving, niet-gemerkte neuronen ^4.

MARCM gebruikt de flippase (FLP) / FLP beeldherkenning (FRT) systeem plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen bemiddelen bij een scheidslijn voorlopercel die een heterozygote allel van een repressor gen, waarvan de expressie normaal remt de expressie van een reportergen ^4. Na de mitotische deling, worden de recombinante chromosomen gescheiden in twee cellen, zodanig dat één cel homozygote allelen van het repressor-gen en de andere cel geen repressor gen de expressie van het in die cel (en de nakomelingen) niet langer ⁴ geblokkeerd. Drie klonen patronen zijn meestal te vinden in een MARCM experiment wanneer FLP stochastisch wordt geïnduceerd in NBs of GMC's: single-cell en twee-cell-GMC-klonen, die neuronale morfologie bij single-cell resolutio verbeeldenn en meercellige NB-klonen, die volledige morfologische patronen van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke NB (Figuur 1B) tonen. De MARCM techniek is op grote schaal toegepast in Drosophila neurobiologische studies, waaronder in neuronale typeaanduiding voor het reconstrueren van brain-breed bedrading netwerken, neurale afkomst analyses voor de openbaarmaking van de ontwikkelingsgeschiedenis van neuronen, fenotypische karakterisatie van genfuncties betrokken bij het lot van de cel specificatie en neuronale morfogenese en differentiatie studies ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Omdat conventionele MARCM alleen etiketten één van de twee dochtercellen (en lijnen) na de geïnduceerde mitotische recombinatie evenement wordt mogelijk nuttige informatie uit de vrijstaande kant verloren. Deze beperking verzet tegen de toepassing van de fundamentele MARCM systeem om hoge-resolutie analyse van de vele neurale geslachten die cel lot te schakelen in snel tempo of precisie analyses van gen functies in dezelfde neuronen van verschillende dieren ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) is een geavanceerd systeem dat neuronen afkomstig uit een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren etiketten, waarbij de terugwinning van nuttige informatie uit beide zijden van de twee cellen mogelijk maakt, waardoor de beperking van het oorspronkelijke MARCM systeem ¹¹ (overwinnen Figuur 2A - 2C). In het tsMARCM systeem, twee RNA interferentie (RNAi) gebaseerde dempers liggen op trans-plaatsen van homologe chromosomen in een voorlopercel en de expressie van de suppressors de expressie van hun respectieve reporters (figuur 2B) onafhankelijk remmen. Naar aanleiding van site-specific mitotische recombinatie gemedieerd door de FLP / FRT-systeem, de two RNAi-gebaseerde suppressors worden gescheiden in twee cellen om de expressie van verschillende reporters (figuur 2B) toe. Twee klonale patronen, eencellige geassocieerd met eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige NB-klonen, worden typisch gezien in een tsMARCM experiment (figuur 2C). Informatie afkomstig van de ene kant van de twee cellen kan worden gebruikt als referentie voor de andere zijde, waardoor een hoge-resolutie neurale stam analyses, zoals geboorte uit het gemerkte neuronen en fenotypische analyses van dezelfde neuronen verschillende dieren nauwkeurig onderzoek van neurale genfunctie ^{11, 12.} Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol beschrijft hoe een tsMARCM experiment, dat door andere laboratoria kunnen worden gebruikt om hun onderzoek van neurale ontwikkeling verbreden voeren (alsook de ontwikkeling van andere weefsels, indien van toepassing) in Drosophila.

Protocol

1. Build tsMARCM-ready Vliegen met de juiste transgenen ^{11, 13}

1. Genereer de originele versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen ¹¹ (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die eerder zijn beschreven, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden ^13.
   1. In één ouderlijn Monteer de transgenen van FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (de eerste reporter, mCD8 :: GFP, expressie van het transgen onder de controle van de stroomopwaartse activeringssequentie promoter, die een membraan-gebonden reporter produceert van muis CD-merker 8-eiwit gefuseerd met groen fluorescent eiwit) en UAS-rCD2RNAi (de suppressor dat de expressie van de tweede reporter afremt, RNAi tegen de expressie van rat cluster of differentiatie 2, rcd2) op de linkerarm van de ^2e chromosoom. Plaats weefsel-specifieke -GAL4 driver op de X of ^3e chromosoom, indien mogelijk.
   2. In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (de tweede verslaggever, rCD2 :: RFP, de andere membraan-tethered reporter bestaande uit rCD2 eiwit gefuseerd met rood fluorescerend eiwit), en UAS-GFPRNAi (de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP afremt, RNAi tegen de expressie van GFP) op de linkerarm van de ^2e chromosoom. Plaats heat-shock (hs) -FLP of weefsel-specificiteit FLP op de X of ^3e chromosoom, indien mogelijk.
2. Genereer de nieuwe versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen ¹⁴ (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die zijn beschreven previously, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden ^13.
   1. In één ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (een gecombineerde transgene van mCD8 :: GFP en de suppressor dat de expressie van rCD2 :: RFP remt) samen in dezelfde arm van de ^2e of ^3e chromosoom (passend paar van FRT transgenen en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i zijn weergegeven in tabel 1). Plaats weefselspecifieke-GAL4 driver uitzondering het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen.
   2. In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (de andere gecombineerde transgene van rCD2 :: RFP en de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP remt) in dezelfde arm van de 2 ^e of 3 ^e chromosoom (passende paren van transgenen van FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi zijn aangegeven in tabel 1). Plaats hs-FLP of weefselspecifieke-FLP uitzondering van het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen.

2. Cross tsMARCM-ready Flies te genereren tsMARCM Clones in hun nageslacht

1. Cross tsMARCM-ready vliegen elkaar (bv, zet 10-15 mannelijke vliegen vanaf stap 1.1.1 of 1.2.1 en 20-30 maagdelijke vrouwelijke vliegt vanaf stap 1.1.2 of 1.2.2 samen) in een fly-food flacon met verse Ambachtelijk gist plakken op de muur van de flacon.
2. Handhaaf de gekruiste tsMARCM ready vliegen bij 25 ° C gedurende 2 dagen om de kans op paring verbeteren voor het verzamelen van bevruchte eieren.
3. Vaak dragen de gekruiste tsMARCM-ready vliegen in vers gegist flesjes om te voorkomen dat verdringing (tik naar beneden de vliegen of gebruik maken van kooldioxide om de vliegen verdoven om de overdracht te vergemakkelijken, houden niet meer dan 80-100 bevruchte eieren in een 10 ml fly-food vial te veel larven te voorkomen).
4. Cultuur tsMARCM dieren (bijvoorbeeld bevruchte eieren, een voorbeeld van het genotype van tsMARCM dieren, zoals in figuur 3, is hs-FLP ^[22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, +, +) die in de serieel overgedragen flesjes gelegd bij 25 ° C totdat zij ontwikkelen om de gewenste fasen (bijvoorbeeld embryo's, larven, of poppen).
5. Plaats de overgedragen flacons die tsMARCM dieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium bevatten een 37 ° C waterbad gedurende 10, 20, 30, 40 en 50 min naar het optimale tijdstip van warmte-schok die de expressie van FLP induceert het gegenereerd moet worden tsMARCM klonen van belang. Sla deze stap over als weefsel-specificiteit FLP wordt gebruikt in de tsMARCM experiment (hs-FLP heeft de voorkeur voor neurale lineage analyses; de redenen voor deze voorkeur zijn eerder beschreven ¹⁵).
   OPMERKING: Herhaal stap 2.5 met behulp van de optimale tijd van heat-shock in de toekomst tsMARCM experimenten als meer tsMARCM klonen van belang worden gezocht; over het algemeen is er meer FLP expressie geïnduceerd in hs-FLP ^[22] in vergelijking met hs-FLP ^[1] met dezelfde heat-shock tijd.
6. De cultuur van de warmte geschokt tsMARCM dieren bij 25 ° C totdat ze de juiste ontwikkelingsstadium bereikt, en ga dan naar stap 3.

3. Bereid, Vlek, en Mount Fly Brains bevattende tsMARCM Clones

1. Bereid pincet-bescherming gerechten. Meng deel A (30 g) en deel B (3 g) van het Silicone Elastomer kit met geactiveerde kool (0,25 g). Giet het mengsel in de juiste gerechten.
2. Ontleden larven, popstadium of adulte hersenen van de tsMARCM dieren 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van pincet op een forceps-bescherming schotel gezien door een dissectie microscoop. LET OP: Een protocol voor vlieg hersenen dissectie is desc geweestribed eerder ^16.
3. Bevestig de vlieg hersenen op een glazen plaat plek met 1x PBS met 4% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Verwerk de vlieg hersenen in dit glas plek plaat voor de rest van de stappen.
4. Spoel de vlieg hersenen drie maal met 1% PBT (1x PBS bevattende 1% Triton X-100) en was ze drie keer gedurende 30 min elk in 1% PBT (spoelen: verwijder PBT en nieuw PBT snel toevoegen, wassen, verwijderen PBT, voeg nieuwe PBT en incubeer de vlieg hersenen in de nieuwe PBT met behulp van een rondschudapparaat).
5. Incubeer de vlieg hersenen met het mengsel van primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een voorbeeld van het mengsel van primaire antilichamen rat anti-CD8 antilichaam (1: 100), konijn anti-DsRed antilichaam (1: 800) en muis anti-Bruchpilot (Brp) antilichaam (1:50) in 1% PBT met 5% normaal geit serum (NGS).
6. Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT.
7. Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT. Brengen ze op een micro dia met een anti-quenching reagens. Zet een micro dekglas op de micro dia te dekken en de bescherming van de vlieg hersenen. Sluit de randen van de micro dekglas en micro dia met behulp van duidelijke nagellak. Bewaar deze gemonteerd en afgedicht hersenen exemplaren vliegen bij 4 ° C.

4. Neem, Process, en analyseren Fluorescent Beelden van tsMARCM Clones

1. Capture fluorescerende beelden van tsMARCM klonen frOM de monsters gemaakt in stap 3.8 met behulp van de confocale microscopie systeem van uw keuze.
2. Project stapels tsMARCM confocale fluorescente afbeeldingen in tweedimensionale afgevlakte beelden gebruiken met confocale microscopie gekozen systeem geleverd beeldverwerkingssoftware (zie figuur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O en 3Q - 3T voorbeelden van afgeplatte confocale fluorescente beelden).
3. Tel het aantal cellen van meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen met een geschikte beeldverwerking software (bijvoorbeeld de functie "Cell Counter" in ImageJ ^17, zie figuur 3E, 3J, 3O en 3T voorbeelden van de cel organen van neuronen).

Representative Results

Het tsMARCM systeem is gebruikt om neurale lineage analyses en genfunctie studies vergemakkelijkt door het ophalen van belangrijke informatie over neuronen afgeleid van gemeenschappelijke NBs. Het systeem is gebruikt om de meeste (zo niet alle) neurontypen zijn en stelt het aantal cellen per neuronale typen en gaat na geboorte-volgorde van deze neuronen ^{11, 12, 18} (zie de bespreking voor meer details over het gebruik tsMARCM te voeren neurale afkomst analyses of genfunctie studies). Hier gebruikten we vier tsMARCM klonen van anterodorsal olfactorische projectie neuronen (adPNs in de ALad1 neurale geslacht van de Drosophila olfactorisch systeem) gelabeld met GAL4-GH146 als voorbeelden om te illustreren hoe een tsMARCM experiment ^{1, 2} uit te voeren. Na FLP expressie werd geïnduceerd bij de embryonale fase, een single, groene VL2p adPN geassocieerd met 45 magenta adPNs werd ontdekt in een tsMARCM kloon (Figuur 3A - 3E). Wanneer daarentegen FLP later werd geïnduceerd op verschillende larvale stadia, één, groene adPNs (DL1 adPN of DC3 adPN) of niet-GH146 + adPNs geassocieerd met verschillende aantallen magenta adPNs (31, 21, of 15) waargenomen in drie andere tsMARCM klonen (Figuur 3F - 3T). De geboorte van VL2p adPNs voorafgaand aan de geboorte van DL1-, DC3- en no-GH146 + -adPNs werd bepaald door het tellen van het aantal cellen van adPNs in hun bijbehorende meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen (45, 31, 21, en 15 in figuur 3E, 3J, 3O en 3T, respectievelijk). Naast het tellen van het aantal cellen, de complexiteit van de axonale en dendritische patronen in de meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen kunnen worden gebruikt om de relatieve orde van geboorte bijbehorende duplex-GMC zijden van het bepalentsMARCM klonen. Mozaïek klonen geïnduceerd bij de vroege ontwikkelingsstadia normaal bevatten meer neuronen en hebben dus meer complexe axonen en dendrieten patronen, terwijl mozaïek klonen geïnduceerd bij late ontwikkelingsstadia minder neuronen bevatten en dus minder complex van axonen en dendrieten patronen (figuur 3C - 3D, 3H - 3I 3M - 3N en 3R - 3S).

Figuur 1: schematische illustraties van Drosophila neurogenese en de drie soorten klonale patronen in een MARCM experiment. (A) Een schematisch diagram neurogenese in de meeste neurale lineages van de centrale hersenen Drosophila: neuroblasts (NBs) ondergaan een asymmetrische divisie zelfvernieuwend NBs en ganglion moedercellen (genererenGMC's), en GMCS verdeel nog een keer tot twee dochter neuronen (NS) te produceren. (B) Drie klonale patronen worden waargenomen in een MARCM experiment eencellige klonen (a), wanneer flippase (FLP) wordt geïnduceerd in GMCs en twee cel-GMC klonen (b) en meercellige-NB klonen (c ), wanneer FLP wordt geïnduceerd in NBs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schema's van de tsMARCM systeem. (A) tsMARCM ready vliegen: een ouderlijk vlieg transgenen bevat van een FRT-plaats en UAS-mCD8 :: GFP (de eerste reporter), UAS-rCD2RNAi (de eerste suppressor dat de expressie van de tweede reporter remt), en een tissue -specifieke -GAL4; de andere ouderlijke vlieg bevat een FRT UAS-rCD2 :: RFP (de tweede reporter), UAS-GFPRNAi (de tweede suppressor dat de expressie van de eerste reporter remt) en hs-FLP. (B) De aanwezigheid van de twee-gebaseerde RNAi onderdrukkers in het nageslacht van de gekruiste tsMARCM ready vliegen remt de expressie van reporters (bijv mCD8 :: GFP en rCD2 :: RFP in de G1 en G2 fasen van paneel B). De expressie van FLP wordt geïnduceerd door hitte-shock, en vervolgens FLP medieert het plaatsspecifieke recombinatie van homologe chromosomen in een delende voorlopercel na binding aan FLP doelstellingen herkenning (FRTS). Dit resulteert in de scheiding van de RNAi-gebaseerde suppressors in de twee cellen na mitotische deling van de expressie van verschillende reporters mogelijk. (C) Twee klonale patronen worden waargenomen bij een experiment tsMARCM: eencellig, geassocieerd met eencellige klonen (a) wanneer FLP geïnduceerd in GMCs en twee cel-GMC, geassocieerd met meercellige NB-klonen(B) wanneer FLP wordt geïnduceerd in NBs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Het gebruik van vier tsMARCM klonen van adPNs als voorbeelden van hoe een tsMARCM experiment in een neuraal lineage analyse. TsMARCM vier klonen van adPNs geïllustreerd, schetsen van de neurogenese patronen (A, F, K en P); confocale beelden van het totale hersenen (B, G, L en Q), waarin de laterale hoorn (LH, C, H, M en R), de antennaal kwab (AL, D, I, N en S) en de soma(E, J, O en T); en de patronen van de neuronale morfologieën. Single adPNs (VL2p, DL1, DC3, en no-GH146 + adPNs; groen) geassocieerd met meercellige-NB adPNs (magenta) van de tsMARCM klonen werden verkregen door de inductie van FLP tot mitotische recombinatie te bemiddelen in de adPN NB in ​​het embryonale (A - E) en larven (F - T) stadia. Merk op dat adPNs één van de hemi-lijnen in de ALad1 neurale stam, waardoor tsMARCM klonen van een enkele, groene adPN geassocieerd met magenta adPNs in figuur 3 (onbekende oorzaak neuronen van de andere hemi-lijn van de ALad1 neurale lineage sterven). De geboorte-volgorde VL2p, DL1, DC3 en niet-GH146 + adPNs werd bepaald door het tellen van het aantal cellen van adPNs in de magenta meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen (45, 31, 21 en 15 binnen de gestippelde lijnen panelen E, J, O en T). De neuriet patronen zijn meestal complexer de magenta meercellige-NB zijden bij de tsMARCM klonen geïnduceerd bij vroege ontwikkelingsstadia (bijvoorbeeld de dendritische patroon complexer in panel E opzichte panelen I, N en S). tsMARCM analyses worden soms verwarrend wanneer neuronen van andere neurale geslachten ook worden aangeduid door dezelfde GAL4 bestuurder (bijvoorbeeld groen LH neuronen, blijkt uit dubbelblinde pijlen, belemmeren de visualisatie van de axonale uitwerking patroon van de VL2p adPNs in panelen B en C) . Brain neuropiles (weergegeven in blauw) werden gekleurd met antilichaam tegen Bruchpilot (Brp). Heat-shock tijd: 12 min (panelen A - E), 15 min (panelen F - J), en 35 min (panelen K - T). Schaal bar in panelen B - G - J, L - O en Q - S = 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Stappen 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 en 3.2 zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede tsMARCM resultaten. Weefsel-specifieke -GAL4 drivers die niet GAL4 in neurale voorlopers tot expressie brengen hebben de voorkeur voor de stappen 1.1.1 en 1.2.1. Vermijd overbevolking van de dieren gekweekt in de fly-food flesjes in stap 2.3. Omdat de inductie latentie, het expressieniveau van FLP upon heat-shock en de gemiddelde verdelen tijdstip van neurale voorlopercellen (dwz AI en GMC's) niet bekend zijn, is het best om de warmteschok tijd variëren (10, 20, 30 , 40 en 50 min) van verschillende monsters van hetzelfde genotype en het ontwikkelingsstadium in stap 2,5. Hierdoor kan voor het bepalen van de optimale warmte-shock tijd teneinde de beste verhouding van tsMARCM klonen van interesse te verkrijgen. Bovendien, wees voorzichtig tijdens fly hersenen dissectie in stap 3.2 om intacte hersenen monsters te verkrijgen; Dit is essentieel voor het nauwkeurig tellen neuronale celaantallen. voor reseschutters die geïnteresseerd in het gebruik tsMARCM voor het bestuderen van de functie van genen op andere chromosoomarmen (bijvoorbeeld 2R, 3L en 3R) tsMARCM ready vliegen worden gemonteerd in stap 1.2 door het kiezen van geschikte paren van FRT transgenen, UAS- zijn mCD8.GFP.UAS-rCD2i en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, die in tabel 1 zijn vermeld. We raden ook aan dat de vrouwelijke tsMARCM-ready vliegen dragen hs-FLP op het X-chromosoom (bijvoorbeeld hs-FLP ^[22], w, UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +, +), die vergemakkelijkt tsMARCM herhaalde experimenten.

Aanpassingen, problemen oplossen, en beperkingen van de Techniek

De efficiëntie en perdurance van RNAi onderdrukkers en journalisten zijn de belangrijkste determinanten voor het al neurale lineage analyses en gen-functie studies met succes kan worden uitgevoerd in tsMARCM experimenten. In het algemeen, de combinatie van lage perdurance van RNAi onderdrukkers enreporters afgeleid van neurale voorlopercellen, samen met de hoge expressie van RNAi suppressors en reporters in post-mitotische neuronen, maakt betere tsMARCM resultaten. Omdat de expressie van RNAi onderdrukkers en verslaggevers wordt gecontroleerd door GAL4 bestuurders, moeten de onderzoekers sterk GAL4 drivers die GAL4 uitdrukken in gedifferentieerde neuronen, maar niet in neurale voorlopers te selecteren. Bijvoorbeeld GAL4-OK107 is een sterke GAL4 driver die GAL4 uitdrukt paddestoel lichaam (MB) voorlopers en derivaten daarvan, MB γ, α '/ β' en α / β neuronen ^{11, 19.} Unfaithful etikettering van MB y neuronen waargenomen in twee klonale patronen (dwz één cel van eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige-NB klonen) als GAL4-OK107 werd gebruikt tsMARCM experimenten ¹¹ . Intrigerend, kan het bovenstaande probleem worden opgelost door gebruik MB247-GAL4, een andere MB GAL4 driverdie uitdrukt GAL4 in gedifferentieerde MB neuronen ^11.

Niet alle GAL4's kunnen worden gebruikt in de tsMARCM systeem of andere mozaïek labeling systemen (bijvoorbeeld MARCM, Q-MARCM en dubbele spot generator) ^{4, 20, 21} als de bestuurder niet wordt uitgedrukt in de neuronen van belang. Derhalve vóór het gebruik tsMARCM neurale lineage analyses, GAL4 bestuurders moeten worden getest op hun dekking van de neuronen van belang in het duale expressie-controle MARCM een pan-cel driver (bijvoorbeeld tubuline promotor-LexA :: GAD) ²² . We merken op dat tsMARCM klonen soms niet kan worden eenduidig geanalyseerd, in het bijzonder wanneer een GAL4 bestuurder met een complex neuraal uitdrukking patroon wordt gebruikt (bijvoorbeeld groene laterale hoorn (LH) neuronen voorkomen duidelijke visualisatie van het axonale uitwerking patroon van de VL2p adPN in figuur 3B en (bijvoorbeeld MARCM, Q-MARCM en dubbele spot generator) ^{4, 20, 21} omdat de beperking is afkomstig van het GAL4 driver. We stellen ook vast dat, reddings- experimenten voor de authenticatie van genfuncties, moet de redding transgenen worden gemanipuleerd met de doelsequenties van het RNAi onderdrukkers in 5 'of 3' niet-getranslateerde gebieden van de transgene redding constructen, of een andere tweeling ter plaatse labeling systeem (bijvoorbeeld, in combinatie MARCM, een combinatie van Q-MARCM en conventionele MARCM) ²¹ moeten worden vastgesteld.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods

Naast tsMARCM, twin-spot generator en gekoppeld MARCM zou ook, althans in theorie, zorgen voor de visualisatie vanneuronen afgeleid van gemeenschappelijke neurale voorlopercellen in twee verschillende kleuren (vergelijking van deze drie mozaïek etikettering technologie is eerder gepresenteerde ^15). Het minimale aantal transgenen voor de montage nodig tweeling ter plaatse generator, de originele versie van tsMARCM (of de nieuwe versie van tsMARCM) en gekoppeld is MARCM 4, 8 (of 6), en 9, respectievelijk. Echter, tsMARCM is het enige systeem dat is gebruikt om voeren uitgebreide neuronale afstamming analyses ^{12, 15, 18, 23.} Plaatsspecifieke recombinatie optreedt in niet-mitotische cellen in de tweeling ter plaatse generatorsysteem, en dit leidt tot de co-expressie van beide reporters in dezelfde cel, waardoor het moeilijk dit systeem te gebruiken om de ontwikkeling van het centrale bestuderen ¹⁵ zenuwstelsel. Daarentegen mozaïek klonen verkregen in de tsMARCM en gekoppelde systemen een MARCMre afgeleid van mitotische cellen. Omdat de gekoppelde MARCM vereist twee onafhankelijke bestuurders de expressie van de verschillende reporters in de Q-MARCM conventionele MARCM te reguleren, de bezorgdheid over het labelen van neuronen afgeleid van gemeenschappelijke neurale voorlopercellen als de twee onafhankelijke bestuurders niet getrouw label dezelfde neuronen in de neurale geslachten van belang ^15.

Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering the Technique

Met behulp van tsMARCM hoge resolutie neurale afkomst analyses uit te voeren
Door toepassing van de benadering die in figuur 3 systematische analyse tsMARCM klonen adPNs, 40 soorten adPNs, met een totaal van 82 neuronen, werden in een eerdere studie ^12. Onder deze 40 soorten adPNs, 35 waren uni-glomerulaire adPNs (dwz innerveren één glomerulus in de antennaal kwab (AL)), die relay olfactorische informatie aan andere regio's van de Drosophila hersenen ¹² (zie Cijfers 2-4 in Yu et al., 2010). De andere vijf soorten adPNs waren poly-glomerulaire adPNs (dwz innerveren meerdere glomeruli in de AL), die olfactorische informatie uit de AL kon integreren en zorgen voor een extra niveau van functionele complexiteit van de olfactorische systeem ¹² (zie figuren 3E-3H en 4Z in Yu et al., 2010). -Embryonale geboren adPNs slechts één neuron per soort, terwijl larvale geboren adPNs vertegenwoordigd door meerdere neuronen per soort, wat suggereert dat er wisselwerking tussen specificiteit en redundantie in het olfactorische systeem ¹² (zie figuren 2-4 in Yu et al., 2010). Interessant neuronen die binnen bepaalde ontwikkelingsstoornissen ramen zijn voorbestemd om te sterven, en vele soorten adPNs worden gevonden bij een vast aantal neuronen in de ALad1 neurale stam, wat suggereert dat de number en typen adPNs voor het samenstellen van de olfactorische systeem zijn strak gereguleerd ¹² (zie figuren 2H, 4V, en 5 in Yu et al, 2010;. zie ook figuur 3P - 3T).

Gebruik tsMARCM nauwkeurig bestuderen genfuncties
Naast geboorte-dating adPNs is tsMARCM ook toegepast op de geboorte-volgorde van de zes centrale complex neuronen gelabeld door GAL4-OK107 te bepalen. Deze zes neuronen vormen een kleine subset van neuronen in de LALv1 neurale lijn die bijdragen tot de schakeling van de Drosophila centrale complex ingewikkelde patronen motorische controle ^{2, 11} (zie figuur 4a en 4b in Yu et al., 2009). Interessant, elk van de zes centrale neuronen complex bezit een duidelijke neuronale morfologie ¹¹ (zie figuur 4d-4h en 4o in Yu et al., 2009). Allen dragen verschillende axonale patronen in de lateral accessoire kwab (LAL). De eerste vier neuronen dendrieten verspreiden hun sub-compartimenten van de noduli, een substructuur van het centrale complex, terwijl de overige twee neuronen hun dendrieten uitsteken in de ellipsoïde lichaam, een substructuur van het centrale complex. Specifiek, de ^3de de geboren centrale complex neuron projecteert de dendrieten de ventrale noduli, met een compacte axonale patroon in de LAL, terwijl de 4 ^e de geboren centrale complex neuron dendrieten distribueert naar de dorsale noduli met een brede axonale patroon de LAL ¹¹ (zie figuur 4f en 4g in Yu et al., 2009).

Beyond volledig identificeren neuronen, zou de kracht van tsMARCM beter geïllustreerd door het bestuderen van genfuncties in neuronen van belang, omdat de tsMARCM systeem maakt beter fenotypische analyses doordat het onderzoek van dezelfde neuronen verschillende dieren. Bijvoorbeeld tsMARCM detecteert een enkele tijdelijke vete wijziging die chronologisch ongepast morfogenese vereist (chinmo, een BTB-zinkvinger nucleaire eiwit) in de ^3e de geboren centrale complex neuronen ¹¹ (zie figuur 4i, 4p en 4W in Yu et al., 2009). Als de chinmo mutatie had gekenmerkt geweest bij het oorspronkelijke MARCM systeem (dat wil zeggen, enkele groene-gelabelde neuronen, zonder dat de etikettering van neuronen afgeleid van de bijbehorende zijden van de twee cellen als de referentie), de chinmo deficiënte neuron weergegeven in figuur 4i uit Yu et al. , 2009 zou zijn verkeerd geïdentificeerd als 4 ^e de geboren, in plaats van de 3 ^e de geboren, centrale complex neuron. Dit zou hebben geleid tot de verkeerde interpretatie van chinmo functie als het regelen van axonale begeleiding in plaats van het opgeven van het lot ¹¹ tijdelijke (dubbele pijl in figuur 4i van Yu et al., 2009). Echter, met de magenta meercellige-NB zijden van tsMARCM klonen als the referentie (via het tellen van de celaantallen in Figuur 4m, 4n, en 4p van Yu et al. , 2009), de chinmo deficiënte neuronen figuur 4i van Yu et al. , 2009) werd bewezen dat het 3 ^e de geboren centrale complex neuron, die dus leidde tot de juiste conclusie dat functioneert chinmo in tijdelijke lot specificatie voor centrale complex neuronen ¹¹ zijn. Het geheel van bovenstaande resultaten benadrukken de belangrijke voordelen van het tsMARCM voor hoge resolutie fenotypische analyses, waardoor correct vrijgeven genfuncties in neuronen (of andere typen cellen, indien van toepassing) voor toekomstige neurale ontwikkeling studies (of ontwikkelingsstudies andere weefsels).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones