Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l'aide Twin-tache marcm

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de marquage mosaïque qui permet la visualisation des neurones dérivées d'une cellule progénitrice commune en deux couleurs distinctes. Ceci facilite l'analyse de la lignée neuronale avec la capacité des neurones individuels naissance à jour et de la fonction du gène à étudier dans les mêmes neurones de différents individus.

Abstract

M osaic un nalyse avec un r epressible c ell m arker (marcm) est un système d'étiquetage de la mosaïque positive qui a été largement appliqué dans les études neurobiologiques de drosophile pour représenter morphologies complexes et de manipuler la fonction des gènes dans les sous - ensembles de neurones au sein autrement non marqué et non perturbé organismes. mosaïques génétiques générées dans le système de marcm sont médiés par une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues au sein de la division des cellules précurseurs afin de produire à la fois des clones marqués (marcm) et des cellules filles non marquées au cours de la mitose. Une extension de la méthode de marcm, appelé bi-place marcm (tsMARCM), étiquettes à la fois des cellules jumeaux issus d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes. Cette technique a été développée pour permettre la récupération des informations utiles à partir des deux hémi-lignées. En analysant en détail les différentes paires de clones tsMARCM, le système permet tsMARCM haute résolution lignage neuronal Mapping pour révéler la naissance ordre exact des neurones marqués produites à partir de cellules progénitrices communes. En outre, le système tsMARCM étend également des études de fonction de gène en permettant l'analyse phénotypique des neurones identiques de différents animaux. Ici, nous décrivons comment appliquer le système de tsMARCM pour faciliter les études de développement neural chez la drosophile.

Introduction

Le cerveau, composé d'un grand nombre et la diversité des types de neurones, dote les animaux avec la capacité de percevoir, de traiter et de répondre aux défis du monde extérieur. Neurones de la drosophile adulte cerveau central sont dérivés d'un nombre limité de cellules souches neuronales, appelées neuroblastes (NBS), au cours du développement ^{1, 2.} La plupart des NBs participants dans le cerveau neurogenèse chez la drosophile subissent la division asymétrique pour générer NBs d'auto-renouvellement et les cellules ganglionnaires mères (MGC), et les CMG ensuite passer par une autre série de division pour produire deux cellules filles qui se différencient en neurones ³ (figure 1A ). En raison de la complexité de la morphologie neuronale et les défis associés à l'identification des neurones spécifiques, une technologie d'étiquetage mosaïque positif, l'analyse de la mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (marcm), a été inventé pour permettre à l'visualization d'un seul neurone ou un petit sous - ensemble de neurones de la population de neurones environnants non marqués ^4.

Marcm utilise la flippase (FLP) / système cible de reconnaissance de FLP (FRT) pour médier une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues dans une cellule précurseur de séparation portant un allèle hétérozygote d'un gène répresseur, dont l' expression normalement inhibe l'expression d'un gène rapporteur ^4. Après la division mitotique des chromosomes recombinants sont isolés dans des cellules jumelles, de telle sorte qu'une cellule contient des alleles homozygotes du gène répresseur et l'autre cellule n'a pas de gène répresseur expression du rapporteur dans la cellule (et ses descendants) ne soit plus ⁴ bloqué. Trois modèles clonales sont habituellement trouvés dans une expérience de marcm quand FLP est induit stochastiquement en NBs ou CMG: une seule cellule et deux cellules-GMC clones, qui représentent la morphologie neuronale au resolutio une seule cellulen, et multi-cellulaire-NB clones, qui révèlent entiers modèles morphologiques de neurones dérivés d'un NB commun (figure 1B). La technique de marcm a été largement appliquée dans des études neurobiologiques de Drosophila, y compris l'identification du type de neurones permettant de reconstruire des réseaux de câblage du cerveau entier, des analyses de la lignée neuronale de la divulgation de l'histoire du développement des neurones, la caractérisation phénotypique des fonctions de gènes impliqués dans la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse neuronale et étudie la différenciation ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Étant donné que les étiquettes classiques marcm une seule des deux cellules filles (et les lignées) après l'événement de recombinaison mitotique induite, des informations potentiellement utiles depuis le côté non marqué est perdue. Cette limitation empêche l'application de la base MSystème ARCM à haute résolution analyse de nombreuses lignées neurales qui changent le destin des cellules dans le tempo rapide ou à la précision des analyses des fonctions des gènes dans les neurones identiques de différents animaux ^{11, 12.}

Twin-tache marcm (tsMARCM) est un système avancé qui marque les neurones dérivés d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes, ce qui permet la récupération des informations utiles à partir des deux côtés des cellules jumeaux, surmontant ainsi la limitation du système marcm ¹¹ initial ( Figure 2A - 2C). Dans le système tsMARCM, deux ARN interférence (ARNi) à base suppresseurs sont situés au trans-sites de chromosomes homologues dans une cellule précurseur, et l'expression de ces suppresseurs inhibent l'expression indépendamment de leurs reporters respectifs (figure 2B). Après mitotique recombinaison spécifique de site à médiation par le système FLP / FRT, le twsuppresseurs à base RNAi-o devenus séparés en cellules doubles pour permettre l'expression des journalistes distincts (figure 2B). Deux modèles clonales, une seule cellule associée à des clones monocellulaires et deux cellules-GMC associés aux clones multicellulaire-NB, sont généralement considérés dans une expérience tsMARCM (figure 2C). Informations dérivé d'un côté des cellules jumelles peuvent être utilisées comme référence pour l'autre côté, ce qui permet à haute résolution des analyses lignage neural, telles que la naissance à jour des neurones marqués, et analyse phénotypique des neurones identiques dans différents animaux pour l'enquête précise la fonction du gène de neurones ^{11, 12.} Ici, nous présentons un protocole étape par étape décrivant la façon de mener une expérience tsMARCM, qui peut être utilisé par d' autres laboratoires d'élargir leurs études sur le développement neuronal (ainsi que le développement d'autres tissus, le cas échéant) chez la drosophile.

Protocol

1. Construire tsMARCM-ready Flies Utilisation du Requis transgènes ^{11, 13}

1. Générer la version originale de mouches tsMARCM-prêt de transgènes qui sont transportés par les mouches individuelles ¹¹ (voir le tableau 1). Effectuer génétiques schémas de passage des mouches standard, qui ont été décrites précédemment, en mettant plusieurs transgènes dans les mêmes stocks de mouches ^13.
   1. Dans une lignée parentale, assembler les transgènes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (le premier journaliste, mCD8 :: GFP; expression du transgène est sous le contrôle du promoteur de la séquence d'activation en amont, ce qui produit un journaliste de membrane-tethered du groupe de souris de différenciation 8 protéine fusionnée avec une protéine fluorescente verte) et UAS-rCD2RNAi (le suppresseur qui inhibe l'expression du second rapporteur, l'ARNi contre l'expression de groupe de rat of différenciation 2, RCD2) sur le bras gauche de la 2 ^ème chromosome. Endroit -GAL4 pilote sur le X ou du chromosome 3 ^ème, si possible tissu-spécifique.
   2. Dans l'autre lignée parentale, assembler les transgènes de FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (le deuxième journaliste, RCD2 :: RFP, l'autre journaliste de la membrane-tethered constitué de la protéine RCD2 fusionnée avec une protéine fluorescente rouge) et UAS-GFPRNAi (le dispositif de suppression qui inhibe l'expression de la GFP de mCD8, l'ARNi contre l'expression de la gfp) sur le bras gauche de la 2 ^ème chromosome. Placez choc thermique (hs) -FLP ou FLP de tissu-specific- sur le X ou 3 ^e chromosome, si possible.
2. Générer la nouvelle version de mouches tsMARCM-prêt de transgènes qui sont transportés par les mouches individuelles ¹⁴ (voir le tableau 1). Effectuer mouche génétique schémas de croisement standard, qui ont été décrits précédemment, en mettant plusieurs transgènes dans les mêmes stocks de mouches ^13.
   1. Dans une lignée parentale, assembler les transgènes d'un site FRT et UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (un transgène combiné de mCD8 :: GFP et le suppresseur qui inhibe l'expression de RCD2 :: RFP) dans le même bras le 2 ^e ou 3 ^e chromosome (paires appropriées de transgènes de FRT et UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sont indiqués dans le tableau 1). Placer un tissu conducteur spécifique GAL4 sur les chromosomes autres que le chromosome du site FRT choisi, si possible.
   2. Dans l'autre lignée parentale, assembler les transgènes d'un site FRT et UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (l'autre transgène combiné de RCD2 :: DP et le suppresseur qui inhibe l'expression de mCD8 :: GFP) dans le même bras des 2 ^e ou 3 ^e chromosomiques (paires appropriées de transgènes de FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi sont indiqués dans le tableau 1). Placer hs-FLP ou un tissu spécifique, FLP sur les chromosomes autres que le chromosome du site FRT choisi, si possible.

2. Cross tsMARCM prêt Mouches pour générer tsMARCM Clones dans leur descendance

1. Mouches Croix-tsMARCM prêts ensemble (par exemple, mettre 10-15 mouches mâles de l' étape 1.1.1 ou 1.2.1 et 20-30 femelle vierge mouches de l' étape 1.1.2 ou 1.2.2 ensemble) dans un flacon fly-alimentaire avec des produits frais -made pâte de levure sur la paroi du flacon.
2. Maintenir les mouches tsMARCM-prêts croisés à 25 ° C pendant 2 jours pour augmenter les chances de l'accouplement avant la collecte des œufs fécondés.
3. Fréquemment transférer les mouches tsMARCM-prêts croisés dans des flacons fraîchement yeasted pour éviter l'encombrement (appuyez vers le bas vol ou l'utilisation du dioxyde de carbone pour anesthésier les mouches pour faciliter le transfert, gardez pas plus de 80-100 oeufs fécondés dans un 10 ml fly-alimentaire vial pour éviter un trop grand nombre de larves écloses).
4. Culture animaux tsMARCM (ie, les œufs fécondés, un exemple du génotype des animaux tsMARCM, tel qu'il est utilisé dans la figure 3, est hs-FLP ^[22], p / p; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) qui ont été mis dans les flacons en série transférés à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils développent les étapes souhaitées (par exemple, les embryons, larves, ou nymphes).
5. Placez les flacons transférés qui contiennent des animaux tsMARCM au même stade de développement à un bain de 37 ° de l'eau pour 10, 20, 30, 40, et 50 min pour déterminer le temps optimal de choc thermique qui induit l'expression de FLP pour générer la clones tsMARCM d'intérêt. Passer cette étape si FLP de tissu-specific- est utilisé dans l'expérience tsMARCM (hs-FLP est préféré pour la lignée neurale analyses, les raisons de cette préférence ont été décrits précédemment ¹⁵).
   REMARQUE: Répétez l'étape 2.5 en utilisant le temps optimal de choc thermique dans les futures expériences de tsMARCM si plusieurs clones tsMARCM d'intérêt sont recherchés; généralement, plus d' expression FLP est induite dans hs-FLP ^[22] par rapport à hs-FLP ^[1] avec le même temps de choc thermique.
6. Culture des tsMARCM animaux de choc thermique à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de développement approprié, puis passez à l'étape 3.

3. Préparer, Teinté et Brains mont Fly contenant tsMARCM Clones

1. Préparer des plats pince-protection. Mélanger la partie A (30 g) et la partie B (3 g) de la trousse d'élastomère silicone avec du charbon actif (0,25 g). Verser le mélange dans les plats appropriés.
2. Disséquer larvaires, la pupe, ou les cerveaux adultes sur les animaux tsMARCM dans 1x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant une pince sur un plat pince-protection vu à travers un microscope de dissection. NOTE: Un protocole pour la mouche dissection du cerveau a été described précédemment ^16.
3. Fixer les cerveaux de mouches dans une plaque de tache de verre avec 1x PBS contenant 4% de formaldéhyde à la température ambiante pendant 20 min. Traiter les cerveaux des mouches dans cette plaque de tache de verre pour le reste des étapes.
4. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT (1x PBS contenant 1% de Triton X-100) et les laver trois fois pendant 30 minutes chacun dans 1% PBT (rinçage: retirer PBT et ajouter de nouvelles PBT rapidement; laver: supprimer PBT, ajouter de nouvelles PBT, et incuber les cerveaux de mouches dans la nouvelle PBT utilisant un agitateur orbital).
5. Incuber le cerveau de la mouche avec le mélange d'anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à la température ambiante. Un exemple de mélange d'anticorps primaires de rat est un anticorps anti-CD8 (1: 100), un anticorps anti-lapin DsRed (1: 800) et anti-Bruchpilot (BRP) un anticorps de souris (01h50) dans 1% de PBT contenant 5% de sérum de chèvre normal (NGS).
6. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT, puis les laver trois fois pendant 30 minutes chacune avec 1% PBT.
7. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT, puis les laver trois fois pendant 30 minutes chacune avec 1% PBT. Montez-les sur une lame micro avec un réactif anti-trempe. Mettez un micro couvercle en verre sur la diapositive micro pour couvrir et protéger le cerveau de la mouche. Sceller les bords du verre de couverture et micro slide micro à l'aide de vernis à ongles transparent. Stockez ces montées et scellées voler des échantillons de cerveau à 4 ° C.

4. Prendre, processus et l'analyse des images fluorescentes de tsMARCM Clones

1. Capture d'images fluorescentes de tsMARCM clones from les échantillons créés à l'étape 3.8 en utilisant le système de microscopie confocale de choix.
2. Piles de projets de tsMARCM images fluorescentes confocale en deux dimensions, aplaties images en utilisant le logiciel de traitement d'image fourni avec le système de microscopie confocale de choix (voir Figure 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O et 3Q - 3T pour des exemples de aplaties confocale des images fluorescentes).
3. Comptez le nombre de cellules des côtés multicellulaire-NB des clones tsMARCM utilisant un logiciel de traitement d'image approprié (par exemple, la fonction "Cell Counter" dans ImageJ ^17; voir la figure 3E, 3J, 3O et 3T pour des exemples de la cellule les corps des neurones).

Representative Results

Le système tsMARCM a été utilisé pour faciliter l'analyse et la lignée neuronale études de la fonction génique en récupérant des informations importantes sur les neurones dérivés de NBs communs. Le système a été utilisé pour identifier la plupart (sinon tous) types de neurones, déterminer le nombre de cellules de chaque type neuronal, et déterminer la naissance ordre de ces neurones ^{11, 12, 18} (voir la section Discussion pour plus de détails sur l' utilisation de tsMARCM à mener lignage neuronal analyses ou des études de la fonction des gènes). Ici, nous avons utilisé quatre clones tsMARCM de neurones olfactifs antérodorsale de projection (de adPNs dans la lignée de neurones ALad1 du système olfactif chez la drosophile) marqués avec GAL4-GH146 comme exemples pour illustrer la façon de mener une expérience tsMARCM ^{1, 2.} Après l'expression FLP a été induite au stade embryonnaire, un single, vert VL2p ADPN associé à 45 adPNs magenta a été détecté dans un clone tsMARCM (figure 3A - 3E). En revanche, lorsque FLP a été induite par la suite, à différents stades larvaires, unique, adPNs vert (DL1 ADPN ou DC3 ADPN) ou non-GH146 + adPNs associée à un nombre différent de adPNs magenta (31, 21, ou 15) ont été observées dans les trois autres clones tsMARCM (Figure 3F - 3T). La naissance de VL2p adPNs avant la naissance de DL1-, DC3- et no-GH146 + -adPNs a été déterminée en comptant le nombre de cellules de adPNs dans leurs associés côtés multicellulaire-NB des clones tsMARCM (45, 31, 21, et 15 la figure 3E, 3J, 3O et 3T, respectivement). En plus de compter le nombre de cellules, la complexité des axones et des motifs dendritiques dans les côtés multicellulaire-NB des clones tsMARCM peuvent être utilisés pour déterminer la naissance d'ordre relatif de leurs associés côtés de deux cellules GMC duclones tsMARCM. Clones Mosaic induits à des stades précoces du développement contiennent normalement plus de neurones et ont donc axonale plus complexes et les modèles dendritiques, alors que les clones mosaïque induites à des stades de développement tardifs contiennent moins de neurones et ont ainsi des motifs de axonales et dendritiques moins complexes (figure 3C - 3D, 3H - 3I 3M - 3N et 3R - 3S).

Figure 1: Schéma de Drosophila illustrations neurogenèse et les trois types de motifs clonales trouvés dans une expérience marcm. (A) Un diagramme de neurogenèse schématique illustrant dans les lignées les plus neuronaux du cerveau central Drosophila: neuroblastes (NBS) subissent une division asymétrique pour générer NBs d'auto-renouvellement et les cellules ganglionnaires mères (CMG), et CMG divisent une fois de plus pour produire deux neurones filles (Ns). (B) Trois modèles clonales sont observés dans une expérience de marcm: clones monocellulaires (a), lorsque flippase (FLP) est induite dans les CMG et clones à deux cellules-GMC (b) et clones multicellulaire-NB (c ), lorsque FLP est induit dans NBs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Schémas du système tsMARCM. (A) mouches tsMARCM-prêts: une mouche parentale contient transgènes d'un site FRT et UAS-mCD8 :: GFP (le premier journaliste), UAS-rCD2RNAi (le premier suppresseur qui inhibe l'expression du second rapporteur), et un tissu -GAL4 spécifique de ; l'autre braguette parental contient un TRAF UAS-RCD2 :: RFP (le deuxième journaliste), UAS-GFPRNAi (le second suppresseur qui inhibe l'expression du premier journaliste), et hs-FLP. (B) La présence des deux suppresseurs à base d' ARNi dans la descendance des mouches tsMARCM-prêts croisés inhibe l'expression de journalistes (ie, mCD8 :: GFP et RCD2 :: RFP dans les phases G1 et G2 du panel B). L'expression de la FLP est induite par un choc thermique, et sert d'intermédiaire FLP puis la recombinaison site-spécifique des chromosomes homologues dans une cellule précurseur de division lors de la liaison à des cibles de reconnaissance de FLP (FRT). Il en résulte la séparation des suppresseurs à base d'ARNi dans les cellules jumelles après la division mitotique pour permettre l'expression des rapporteurs distincts. (C) deux motifs clonales sont observés dans une expérience tsMARCM: une seule cellule, associée à des clones monocellulaires (a) lorsque FLP est induite dans les CMG et deux cellules GMC, associée à des clones multicellulaire-NB(B) lorsque FLP est induit dans NBs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Utilisation de quatre clones tsMARCM de adPNs comme exemples de la façon de mener une expérience tsMARCM dans une analyse de la lignée neuronale. Quatre clones tsMARCM de adPNs sont illustrés, avec des diagrammes de leurs habitudes de neurogenèse (A, F, K et P); images confocales du cerveau global (B, G, L et Q), montrant la corne latérale (LH; C, H, M et R), le lobe antennaire (AL; D, I, N et S) et le soma(E, J, O, T); et les motifs de leurs morphologies neuronales. adPNs simples (VL2p, DL1, DC3, et no-GH146 + adPNs; vert) associés à multi-cellulaire-NB adPNs (magenta) des clones tsMARCM ont été obtenus par l'induction de FLP de médiation recombinaison mitotique dans le ADPN NB à l'embryon (A - E) et larvaires (F - T) étapes. A noter que adPNs sont l' un des hémi-lignées de la lignée neuronale ALad1, ce qui se traduit par des clones tsMARCM d'une seule ADPN vert associée à adPNs magenta sur la figure 3 (pour des raisons inconnues, les neurones de l'autre hémi-lignée des neurones ALad1 lignage die). La naissance ordre de VL2p, DL1, DC3, et no-GH146 + adPNs a été déterminée en comptant le nombre de cellules de adPNs dans les côtés magenta multi-cellulaire-NB des clones tsMARCM (45, 31, 21, et 15 dans le pointillé lignes de panneaux E, J, O et T). Les modèles de neurites sont généralement plus complexes dans les magenta côtés multicellulaire-NB lorsque les clones tsMARCM sont induits à des stades précoces du développement (par exemple, le modèle dendritique est plus complexe dans le panneau E par rapport aux panneaux I, N, et S). tsMARCM analyses sont parfois source de confusion lorsque les neurones d'autres lignées neurales sont également marqués par le conducteur même GAL4 (par exemple, les neurones LH verts, représentés par des doubles-flèches, obstruent la visualisation du motif d'élaboration axonale des adPNs VL2p dans les panneaux B et C) . neuropiles Brain (en bleu) ont été colorées avec un anticorps contre Bruchpilot (Brp). Temps de chauffe-choc: 12 min (panneaux A - E), 15 min (panneaux F - J), et 35 min (panneaux K - T). Barre d'échelle dans les panneaux B - G - J, L - O, et Q - S = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Les étapes 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, et 3.2 sont essentiels pour obtenir de bons résultats de tsMARCM. Les conducteurs de -GAL4 spécifiques de tissus qui n'expriment pas GAL4 dans les progéniteurs neuraux sont préférées pour les étapes 1.1.1 et 1.2.1. Éviter le surpeuplement des animaux cultivés dans les flacons fly-alimentaires à l'étape 2.3. Parce que le temps de latence d'induction, le niveau d'expression de FLP lors de choc thermique, et le temps de séparation moyenne de progéniteurs neuronaux (ie, NBS et MGC) ne sont pas connus, il est préférable de faire varier le temps de choc thermique (10, 20, 30 , 40 et 50 min) sur différents échantillons du même génotype et le stade de développement à l'étape 2.5. Cela permettra de déterminer le temps optimal de choc thermique afin d'obtenir le meilleur rapport de clones tsMARCM d'intérêt. De plus, soyez prudent lors de la mouche dissection du cerveau à l'étape 3.2 afin d'obtenir des échantillons de cerveau intactes; ce qui est crucial pour compter avec précision le nombre de cellules neuronales. Pour researchers qui sont intéressés à utiliser tsMARCM pour étudier la fonction des gènes sur d' autres bras chromosomiques (par exemple, 2R, 3L et 3R), les mouches tsMARCM-prêt doit être assemblé comme à l' étape 1.2 en choisissant des paires appropriées de transgènes de FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i et UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, qui sont indiqués dans le tableau 1. Nous recommandons également que les femmes à vol d'tsMARCM prêt portent hs-FLP sur le chromosome X (par exemple, hs-FLP ^[22], w; UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), qui facilite tsMARCM expériences répétées.

Modifications, Dépannage et limites de la technique

L'efficacité et la perdurance de suppresseurs et les journalistes ARNi sont les principaux déterminants pour savoir si la lignée neurale analyses et des études de la fonction des gènes peut être réalisée avec succès dans des expériences tsMARCM. En général, la combinaison d'une faible perdurance de suppresseurs d'ARNi etjournalistes issus de progéniteurs neuronaux, ainsi que la forte expression de suppresseurs et reporters ARNi dans les neurones post-mitotiques, permet de meilleurs résultats tsMARCM. Parce que l'expression de suppresseurs et reporters ARNi est contrôlé par les pilotes GAL4, les chercheurs doivent choisir les pilotes de GAL4 forts qui expriment GAL4 dans les neurones différenciés, mais pas dans les progéniteurs neuronaux. Par exemple, GAL4-OK107 est un facteur GAL4 GAL4 solide qui exprime dans le corps de champignon (MB) progéniteurs et leurs dérivés, MB γ, α '/ β' et a / ß neurones ^{11, 19.} Étiquetage infidèle MB neurones y a été observée dans deux configurations clonales ( par exemple, une seule cellule associée à des clones monocellulaires et deux cellules GMC associés à des clones multicellulaire-NB) lors de GAL4 OK107 a été utilisé dans des expériences tsMARCM ¹¹ . Curieusement, la question ci-dessus peut être résolu en utilisant MB247-GAL4, un pilote MB GAL4 différentqui exprime GAL4 dans les neurones différenciés MB ^11.

Tous les pilotes GAL4 peuvent être utilisés dans le système tsMARCM ou dans d' autres systèmes d'étiquetage de la mosaïque (par exemple, marcm, Q-marcm et générateur double spot) ^{4, 20, 21} si le conducteur n'a pas exprimé dans les neurones d'intérêt. Par conséquent, avant d'utiliser tsMARCM pour lignage neuronal analyses, les conducteurs GAL4 doivent être testés pour leur couverture des neurones d'intérêt dans le marcm double expression de contrôle avec un pilote pan-cellule (par exemple, promoteur-LexA tubuline :: GAD) ²² . Nous notons que les clones tsMARCM parfois ne peuvent pas être analysés sans ambiguïté, surtout quand un pilote de GAL4 avec un motif d'expression neuronal complexe est utilisé (par exemple, corne latérale verte (LH) neurones empêchent une visualisation claire du motif d'élaboration axonale du VL2p ADPN à la figure 3B et (par exemple, marcm, Q-marcm et générateur double spot) ^{4, 20, 21} parce que la limitation provient avec le pilote GAL4. Nous notons également que, pour mener des expériences de sauvetage pour l'authentification des fonctions des gènes, les transgènes de sauvetage doivent être conçus avec les séquences cibles des suppresseurs ARNi dans 5 'ou 3' des régions non traduites des constructions de sauvetage transgéniques, ou un jumeau-spot alternatif système d'étiquetage (par exemple, couplé marcm, une combinaison de Q-marcm et marcm conventionnel) ²¹ devrait être adopté.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

Outre tsMARCM, générateur bi-place et marcm couplé serait également, au moins en théorie, permettre la visualisation deneurones dérivés de progéniteurs neuronaux communs dans deux couleurs distinctes (une comparaison de ces trois technologies d'étiquetage mosaïque a été présenté précédemment ^15). Le nombre minimum de transgènes requis pour l'assemblage générateur bi-place, la version originale de tsMARCM (ou la nouvelle version de tsMARCM), et marcm couplé est de 4, 8 (ou 6), et 9, respectivement. Cependant, tsMARCM est le seul système qui a été utilisé pour effectuer des analyses de la lignée neurale complète ^{12, 15, 18, 23.} recombinaison spécifique du site ne se produisent dans les cellules non-mitotiques dans le système de générateur à double place, et cela conduit à la co-expression des deux journalistes dans la même cellule, ce qui rend difficile d'utiliser ce système pour étudier le développement de la centrale système nerveux ^15. En revanche, les clones mosaïque obtenus dans le tsMARCM et les systèmes de marcm couplés unre dérivé de cellules en mitose. Cependant, parce que le système de marcm couplé nécessite deux pilotes indépendants pour contrôler l'expression des différents journalistes dans les systèmes de marcm classiques Q-marcm et, ce qui soulève des préoccupations au sujet de l'étiquetage des neurones dérivés de progéniteurs neuronaux communs si les deux pilotes indépendants ne le font pas fidèlement étiqueter les mêmes neurones dans les lignées neurales d'intérêt ^15.

Applications futures ou les directions après Maîtriser la technique

Utilisation de tsMARCM pour effectuer des analyses de neurones lignage haute résolution
En appliquant l'approche utilisée dans la figure 3 pour analyser systématiquement les clones tsMARCM de adPNs, 40 types de adPNs, avec un total de 82 neurones, ont été identifiés dans une étude précédente ^12. Parmi ces 40 types de adPNs, 35 étaient adPNs uni-glomérulaire (ie, innervant un seul glomérule dans le lobe antennaire (AL)), qui relay information olfactive à d' autres régions du cerveau Drosophila ¹² (voir Les figures 2-4 dans Yu et al., 2010). Les cinq autres types de adPNs étaient adPNs poly-glomérulaire (ie, innervant glomérules multiples dans le AL), ce qui pourrait intégrer l' information olfactive de l'AL et de fournir un niveau supplémentaire de complexité fonctionnelle du système olfactif ¹² (voir les figures 3E-3H et 4Z dans Yu et al., 2010). AdPNs de Embryonic-nés ont un seul neurone par type, alors que adPNs larvaires-nés sont représentés par plusieurs neurones par type, ce qui suggère qu'il ya interaction entre la spécificité et la redondance dans le système olfactif ¹² (voir les figures 2-4 dans Yu et al., 2010). Fait intéressant, les neurones produits dans certaines fenêtres de développement sont destinés à mourir, et de nombreux types de adPNs sont trouvés avec un nombre fixe de neurones dans la lignée de neurones ALad1, suggérant que le number et les types de adPNs pour l' assemblage du système olfactif sont étroitement réglementées ¹² (voir les figures 2H, 4V, et 5 dans Yu et al, 2010;. voir aussi Figure 3P - 3T).

Utilisation de tsMARCM pour étudier avec précision les fonctions des gènes
Outre la naissance datant adPNs, tsMARCM a également été appliquée pour déterminer la naissance ordre de six neurones complexes centraux marqués par GAL4-OK107. Ces six neurones forment un petit sous - ensemble de neurones dans la lignée de neurones LALv1 qui contribuent au circuit du complexe central de drosophile pour contrôler les modèles de moteur complexes ^{2, 11} (voir la figure 4a et 4b dans Yu et al., 2009). Fait intéressant, chacun de ces six neurones complexes centraux possède une morphologie neuronale distincte ¹¹ (voir la figure 4d-4h et 4o dans Yu et al., 2009). Tout d'entre eux portent des motifs axonales distincts à la finlobe accessoire ral (LAL). Les quatre premiers neurones distribuent leurs dendrites à des sous-compartiments du noduli, une sous-structure du complexe central, tandis que les deux autres neurones projettent leurs dendrites au corps ellipsoïdal, une autre sous-structure du complexe central. Plus précisément, le 3 ^ème de neurone complexe central projette ses dendrites aux noduli ventrales, avec un motif axonale compact dans le LAL, alors que le 4 ^e -Born neurone complexe central distribue ses dendrites à la noduli dorsale, avec un large motif axonale dans LAL ¹¹ (voir la figure 4f et 4g de Yu et al., 2009).

Au-delà de neurones identifiant globalement, la puissance de tsMARCM serait mieux exemplifié par l'étude des fonctions des gènes dans les neurones d'intérêt, puisque le système tsMARCM permet une meilleure phénotypique analyses en permettant l'examen des neurones identiques dans différents animaux. Par exemple, tsMARCM détecte une seule graisse temporellechangement e qui nécessite chronologiquement morphogenèse inappropriée (de chinmo, une protéine nucléaire doigt BTB-zinc) dans les neurones complexes centraux de la ^rd 3 de ¹¹ (voir la figure 4i, 4p, et 4w dans Yu et al., 2009). Si la mutation chinmo a été caractérisé dans le système de marcm d' origine ( à savoir, seules les neurones vert marqué, sans l'étiquetage des neurones dérivés des côtés associés des cellules doubles comme référence), le chinmo neurone ayant un déficit représentés sur la figure 4i de Yu et al. 2009 aurait été à tort comme la 4 ^e -Born, plutôt que le 3 ^ème -Born, neurone complexe central. Cela aurait donné lieu à une interprétation erronée de la fonction chinmo que le contrôle de guidage axonal plutôt que de spécifier le temps sort ¹¹ (double flèche sur la figure 4i de Yu et al., 2009). Cependant, en utilisant les côtés magenta multi-cellulaire-NB de clones tsMARCM comme thréférence e (par comptage du nombre de cellules dans Figure 4m, 4n, et 4p de Yu et al. , 2009), le chinmo neurone déficient illustré à la figure 4i de Yu et al. , 2009) a été prouvé être neurone complexe central de la 3 ^ème de, qui a donc conduit à la conclusion correcte que chinmo fonctions dans la spécification du destin temporel pour les neurones complexes centraux ^11. Pris ensemble, les résultats ci-dessus mettent en évidence les avantages importants du système tsMARCM pour haute résolution analyse phénotypique, de ce fait de divulguer avec précision les fonctions des gènes dans les neurones (ou d'autres types de cellules, le cas échéant) pour les futures études sur le développement neural (ou les études sur le développement des autres tissus).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones