Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Abstract

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Introduction

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung ^{1, 2.} Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen ³ (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen ^4.

MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System ⁴ ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor - Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr ⁴ blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB - Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen - Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere ^{11, 12.}

Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen - Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden ¹¹ ( 2A - 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA - Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion ^{11, 12.} Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

Protocol

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene ^{11, 13}

1. Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden ¹¹ (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um ¹³ mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen.
   1. In einer Elternlinie, montieren die Transgene von FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter, mCD8 :: GFP; Expression des Transgens unter der Kontrolle des Upstream - Aktivierungssequenz Promotor ist, die eine Membran-gebundenen Reporter erzeugt von Maus - Cluster von Proteindifferenzierung 8 mit grün fluoreszierenden Protein fusioniert) und UAS-rCD2RNAi (Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt, die RNAi gegen die Expression von Ratten - Cluster of Differenzierung 2, RCD2) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 ^nd. Ort gewebespezifische -GAL4 Treiber auf dem X oder ^3. Chromosom, falls möglich.
   2. In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene von FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter, RCD2 :: RFP, die andere Membran-gebundenen Reporter aus RCD2 Protein mit rot fluoreszierendes Protein fusioniert) und UAS-GFPRNAi (der Suppressor, der die Expression mCD8 :: GFP hemmt, die RNAi gegen die Expression von gfp) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 ^nd. Platzieren Hitzeschock (hs) -FLP oder Gewebe-Spezifität FLP auf das X oder ^3. Chromosom, wenn möglich.
2. Generieren Sie die neue Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden ¹⁴ (siehe Tabelle 1). Führen Sie Standard-fly genetischen Kreuzungsschemata, die p beschrieben wurdenreviously, durch mehrere Transgene in den gleichen Flug Aktien ¹³ setzen.
   1. In einer Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (ein kombiniertes Transgen mCD8 :: GFP und den Suppressor, die die Expression von RCD2 :: RFP hemmt) zusammen im selben Arm der ^2. oder ^3. Chromosom (entsprechende Paare von Transgenen von FRT und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sind in Tabelle 1 angegeben). Platzieren gewebsspezifische-GAL4 - Treiber auf den Chromosomen anderen als dem Chromosom des gewählten FRT - Stelle, falls möglich.
   2. In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI (den anderen verbundenen Transgen RCD2 :: RFP und den Suppressor, die die Expression von mCD8 :: GFP hemmt) im selben Arm der ^2. oder ^3. Chromosom (geeignete Paare von Transgenen von FRT UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI sind in Tabelle 1) angegeben. Ort hs-FLP oder gewebespezifische FLP-on Chromosome anderen als dem Chromosom des Standortes gewählt FRT, falls möglich.

2. Quer tsMARCM-ready Fliegen zu tsMARCM Klone in ihren Nachkommen generieren

1. Kreuz tsMARCM-ready Fliegen zusammen (zB setzen 10-15 männlichen Fliegen aus Schritt 1.1.1 oder 1.2.1 und 20-30 jungfräulichen Weibchen aus Schritt fliegt 1.1.2 oder 1.2.2 zusammen) in einem Fly-Essen Fläschchen mit frischem -Aus Hefe-Paste an der Wand des Gefäßes.
2. Pflegen Sie die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen bei 25 ° C für 2 Tage, um die Chance der Paarung zu verbessern, bevor befruchteten Eier zu sammeln.
3. Häufig übertragen die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen in frisch yeasted Fläschchen Verdrängung zu vermeiden (tippen Sie die Fliegen oder Kohlendioxid verwenden, um die Fliegen zu betäuben den Transfer zu erleichtern, halten nicht mehr als 80 bis 100 befruchtete Eier in einen 10-ml Fliegen-Food überl zu vermeiden, dass zu viele geschlüpften Larven).
4. Kultur die tsMARCM Tiere (dh befruchtete Eier, ein Beispiel des Genotyps tsMARCM Tiere, wie verwendet in Abbildung 3 ist hs-FLP ^[22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), die in den seriell übertragen Fläschchen bei 25 ° C gelegt wurden , bis sie auf die gewünschten Stufen (zB Embryonen, Larven entwickeln, oder Puppen).
5. Legen Sie die übertragenen Fläschchen, die tsMARCM Tiere in der gleichen Entwicklungsstufe zu einem 37 ° C Wasserbad enthalten für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten, um die optimale Zeit der Hitzeschock, um zu bestimmen, welche die Expression von FLP induziert zu erzeugen, die tsMARCM Klone von Interesse. Überspringen Sie diesen Schritt , wenn Gewebe-Spezifität FLP ist in der tsMARCM Experiment verwendet wird (hs-FLP ist für neuronale Linie bevorzugt analysiert; die Gründe für diese Einstellung zuvor ¹⁵ beschrieben worden ist).
   HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.5 die optimale Zeit des Hitzeschock in Zukunft tsMARCM Experimente, wenn mehr tsMARCM Klone von Interesse verwendet werden wollte; Im Allgemeinen wird in hs-FLP mehr FLP Expression induziert ^[22] im Vergleich zu hs-FLP ^[1] mit der gleichen Hitzeschock - Zeit.
6. Kultur, die einem Hitzeschock tsMARCM Tiere bei 25 ° C, bis sie die entsprechende Entwicklungsstufe erreicht, und dann gehen Sie zu Schritt 3.

3. Bereiten Sie, Beize und Mount Fly Gehirne mit einem Gehalt tsMARCM Clones

1. Bereiten Sie zangen Schutz Gerichte. Mischen Sie Teil A (30 g) und Teil B (3 g) des Silikon-Elastomer-Kit mit Aktivkohle (0,25 g). Gießen Sie die Mischung in die entsprechenden Gerichte.
2. Präparieren Larven-, pupal oder Erwachsenen-Gehirn aus der tsMARCM Tiere in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Zange auf einem zangenSchutzSchale betrachtet durch eine Dissektion Mikroskop. HINWEIS: Ein Protokoll für das Fliegen Gehirnsezierung wurde abribed ¹⁶ zuvor.
3. Fix the fly Gehirn in einem Glas Tüpfelplatte mit 1x PBS für 20 min 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur enthält. Verarbeiten Sie die Fliege Gehirne in diesem Glas Tüpfelplatte für den Rest der Schritte.
4. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT (1x PBS mit 1% Triton X-100) und waschen Sie sie dreimal für je 30 min in 1% PBT (rinse: entfernen PBT und fügen Sie neue PBT schnell; waschen: entfernen PBT, fügen Sie neue PBT, und brüten die Fliege Gehirne in der neuen PBT einen Orbitalschüttler verwenden).
5. Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel der Mischung aus primärem Antikörper ist Ratte anti-CD8-Antikörper (1: 100), Kaninchen-Anti-DsRed-Antikörper (1: 800) und Maus-Anti-Bruchpilot (BRP) Antikörper (1:50) in 1% PBT, enthaltend 5% normalem Ziegenserum (NGS).
6. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT.
7. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. Montieren sie auf einem Mikroobjektträger mit einem Anti-Quenching-Reagenz. Setzen Sie ein Mikrodeckglas auf der Mikro Dia-the-fly Gehirne zu bedecken und zu schützen. Seal die Ränder des Mikrodeckglas und Mikro-Schlitten mit klarem Nagellack. Bewahren Sie diese montiert und versiegelt Gehirn Proben bei 4 ° C fliegen.

Nehmen 4., Prozess- und Analysieren Fluoreszenzbilder von tsMARCM Clones

1. Erfassen Fluoreszenzbilder von tsMARCM Klone from die Proben in Schritt 3.8 mit der konfokalen Mikroskopie System der Wahl erstellt.
2. Projektstapel tsMARCM konfokalen Fluoreszenzbildern in zweidimensionalen, abgeflachten Bilder die Bildverarbeitungs - Software mit dem konfokalen Mikroskopiesystem der Wahl zugeführt (siehe Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O und 3Q - 3T für Beispiele von abgeflachten konfokale Fluoreszenzbilder).
3. Zählen der Zellanzahl der mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone eine geeignete Bildverarbeitungssoftware (beispielsweise die "Zellzähler" -Funktion in ImageJ ^17; siehe Figur 3E, 3J, 3O und 3T für die Beispiele der Zelle Leichen von Neuronen).

Representative Results

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen ^{11, 12, 18} (siehe die Diskussion Abschnitt Informationen zur Verwendung tsMARCM zu neuronale Linie Analysen durchführen oder die Genfunktion Studien). Hier verwendeten wir vier tsMARCM Klone anterodorsal olfaktorischen Projektionsneuronen (adPNs im ALad1 neuralen lineage des olfaktorischen Systems Drosophila) , markiert mit GAL4-GH146 als Beispiele zu veranschaulichen , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen ^{1, 2.} Nach dem FLP-Expression wurde in der embryonalen Phase, eine si induziertngle, grün VL2p ADPN mit 45 Magenta adPNs assoziiert wurde in einem tsMARCM Klon (- 3E 3A) nachgewiesen. Wenn dagegen FLP später induziert wurde, bei verschiedenen Larvenstadien, einzeln, grün adPNs (DL1 ADPN oder DC3 ADPN) oder bei Nicht GH146 + adPNs mit unterschiedlichen Anzahlen von magenta adPNs zugeordnet (31, 21, oder 15) wurden in drei anderen beobachtet tsMARCM Klone (Abbildung 3F - 3T). Die Geburt von VL2p adPNs vor der Geburt von DL1-, DC3- und No-GH146 + -adPNs wurde durch Zählen der Zellzahlen von adPNs in ihren zugehörigen mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone (45, 31, 21, bestimmt und 15 in 3E, 3J, 3O und 3T, respectively). Zusätzlich zu den Zellzahlen zu zählen, um die Komplexität der axonalen und dendritischen Muster in den vielzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone können die relative Geburten Reihenfolge ihrer zugehörigen zweizelligen-GMC Seiten der zur Bestimmung verwendet werden,tsMARCM Klone. Mosaik - Klone in frühen Entwicklungsstadien induziert enthalten in der Regel mehr Neuronen und somit auch komplexere axonalen und dendritischen Muster, während Mosaik - Klone in der späten Entwicklungsstadien induziert weniger Neuronen enthalten und haben somit weniger komplexe axonalen und dendritischen Muster (3C - 3D, 3H - 3I 3M - 3N und 3R - 3S).

Abbildung 1: Schematische Darstellungen von Drosophila Neurogenese und die drei Arten von klonalen Muster in einem MARCM Experiment gefunden. (A) Eine schematische Darstellung , die Neurogenese in den meisten neuronalen Abstammungslinien des Drosophila zentralen Gehirn: Neuroblasten (NBS) durchlaufen eine asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und ganglion Mutterzellen zu erzeugen (GMCs) und GMCs teilen ein weiteres Mal zwei Tochter Neuronen (Ns) zu erzeugen. (B) Drei klonalen Muster werden in einem MARCM Experiment beobachtet: Einzelzellklone (a), wenn Flippase (FLP) in GMCs induziert wird, und zwei Zellen-GMC Klone (b) und mehrzelligen-NB Klone (c ), wenn FLP in NBs induziert wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des tsMARCM Systems. (A) tsMARCM-ready Fliegen: ein Eltern Fliege enthält Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter), UAS-rCD2RNAi (die erste Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt), und einem Gewebe -spezifische -GAL4; das andere Eltern Fliege enthält eine FRT UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter), UAS-GFPRNAi (die zweite Suppressor, die die Expression des ersten Reporter hemmt) und hs-FLP. (B) Das Vorhandensein der beiden RNAi-basierte Suppressoren in der Nachkommenschaft der gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen hemmt die Expression von Reporter (dh mCD8 :: GFP und RCD2 :: RFP in den G1- und G2 - Phasen des Paneels B). Die Expression von FLP wird durch Hitzeschock induziert und FLP vermittelt dann die ortsspezifische Rekombination von homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle nach Bindung an FLP Erkennungsziele (FRT). Dies führt zu der Trennung der RNAi-basierten Suppressoren in den Zwillingszellen nach mitotische Teilung der Expression von verschiedenen Reportern zu ermöglichen. (C) Zwei klonalen Muster werden in einem tsMARCM Experiment beobachtet: single-Zelle, assoziiert mit Single-Zell - Klone (a) , wenn sich FLP in GMCs induziert und zwei Zellen-GMC, verbunden mit mehrzelligen-NB - Klone(B) wenn FLP in NBs induziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Unter Verwendung von vier tsMARCM Klone von adPNs als Beispiele dafür , wie ein tsMARCM Experiment in einem neuronalen Linie Analyse durchzuführen. Vier tsMARCM Klone adPNs dargestellt sind, mit Diagrammen der Neurogenese Muster (A, F, K und P); konfokale Bilder des gesamten Gehirns (B, G, L und Q), welche die Seitenhorn (LH; C, H, M und R), Antennallobus (AL; D, I, N, und S) und das Soma(E, J, O und T); und die Muster der neuronalen Morphologien. Single adPNs (VL2p, DL1, DC3 und no-GH146 + adPNs; grün) zugeordnet mehrzelligen-NB adPNs (magenta) der tsMARCM Klone wurden durch die Induktion von FLP abgeleitet am embryonalen mitotische Rekombination in der ADPN NB zu vermitteln (A - E) und Larven (F - T) Stufen. Beachten Sie, dass adPNs sind eine der hemi-Abstammungslinien in der ALad1 neuronalen Linie, die in tsMARCM Klone einer einzelnen, grün ADPN mit Magenta adPNs in Figur 3 (aus unbekannten Gründen, Neuronen aus dem anderen hemi-Linie der ALad1 neuralen assoziiert ergibt Linie die). Die Geburt Ordnung von VL2p, DL1, DC3 und Nicht GH146 + adPNs wurde durch Zählen der Zellzahlen von adPNs in den magenta mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone (45, 31, 21 und 15 innerhalb der gestrichelten bestimmt Linien von Platten E, J, O und T). Die Neuriten - Muster sind in der Regel komplexer in den magenta mehrzelligen-NB Seiten , wenn die tsMARCM Klone in frühen Entwicklungsstadien induziert werden (beispielsweise das dendritische Muster ist komplexer in Tafel E im Vergleich zu Platten I, N, und S). tsMARCM analysiert werden manchmal verwirrend , wenn Neuronen von anderen neuronalen Linien auch durch den gleichen GAL4 - Treiber gekennzeichnet sind (zB grün LH Neuronen, durch Doppelpfeile dargestellt ist , behindern die Visualisierung der axonalen Ausarbeitung Muster der VL2p adPNs in den Feldern B und C) . Gehirn Neuropile (in blau dargestellt) wurden mit einem Antikörper gegen Bruchpilot (BRP) gefärbt. Hitzeschockzeit: 12 min (Tafeln A - E), 15 min (Platten F - J) und 35 min (Platten K - T). Maßstabsbalken in den Feldern B - G - J, L - O und Q - S = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und die durchschnittliche Teilungszeit von neuralen Vorläuferzellen (dh NBS und GMCs) nicht bekannt sind, ist es am besten , die Hitzeschock - Zeit zu variieren (10, 20, 30 , 40 und 50 min) auf unterschiedlichen Proben des gleichen Genotyp und Entwicklungsstadium in Schritt 2.5. Dies wird für die Bestimmung der optimalen Hitzeschock Zeit ermöglichen, um das beste Verhältnis von tsMARCM Klone von Interesse zu erhalten. Darüber hinaus soll während fly Gehirnsezierung in Schritt 3.2 zu erhalten, um intakte Gehirnproben vorsichtig sein; Dies ist entscheidend für die genaue neuronale Zellzahlen zu zählen. Für ReseBogenschützen , die sich mit der tsMARCM interessiert sind für die Funktion von Genen auf andere Chromosomenarme studieren (zB 2R, 3L und 3R), tsMARCM-ready Fliegen sollte , wie in Schritt 1.2 durch die Wahl geeigneter Paare von Transgenen von FRT, UAS- zusammengebaut werden mCD8.GFP.UAS-rCD2i und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI, die in Tabelle 1 angegeben sind. Wir empfehlen auch , dass die weiblichen tsMARCM-ready Fliegen hs-FLP auf dem X - Chromosom tragen (zB hs-FLP ^[22], w; UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), die erleichtert tsMARCM Experimente wiederholt.

Änderungen, Fehlerbehebung und Einschränkungen der Technik

Die Effizienz und perdurance von RNAi Suppressoren und Reporter sind die wichtigsten Determinanten für die, ob neuronale Abstammungslinie analysiert und Genfunktion Studien erfolgreich in tsMARCM Experimente durchgeführt werden können. Im Allgemeinen ist die Kombination von niedriger perdurance von RNAi Suppressoren undReporter aus neuralen Vorläuferzellen abgeleitet sind, zusammen mit der hohen Expression von RNAi Suppressoren und Reporter in post-mitotischen Neuronen, ermöglicht eine bessere tsMARCM Ergebnisse. Da die Expression von RNAi Suppressoren und Reporter von GAL4 Fahrer gesteuert wird, sollten Forscher starke GAL4-Treiber auswählen, die GAL4 in differenzierten Neuronen, aber nicht in neuralen Vorläuferzellen exprimieren. Zum Beispiel ist GAL4-OK107 eine starke GAL4 - Treiber, der GAL4 in Pilzkörper (MB) Progenitoren und deren Derivate, MB γ, α '/ β' und α / β - Neuronen ^{11, 19} drückt. Unfaithful Kennzeichnung von MB & ggr Neuronen wurde in zwei klonalen Muster beobachtet (dh Einzelzelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei Zellen-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone) , wenn GAL4-OK107 ¹¹ in tsMARCM Experimenten verwendet wurde , . Erstaunlicherweise kann die obige Problem durch die Verwendung MB247-GAL4, einen anderen MB GAL4-Treiber gelöst werdendass zum Ausdruck GAL4 in differenzierten Neuronen MB ^11.

Nicht alle GAL4 - Treiber können in der tsMARCM System oder in anderen Mosaik-Kennzeichnungssysteme (zB MARCM, Q-MARCM und Twin-Spot - Generator) ^{4, 20, 21} verwendet werden , wenn der Fahrer nicht in den Neuronen von Interesse exprimiert wird. Daher sollten Sie vor tsMARCM für neuronale Linie zur Verwendung von Analysen sollten die GAL4 - Treiber für ihre Berichterstattung über den Neuronen des Interesses an der Dual-Ausdruck-Steuerung MARCM mit einem pan-Zellentreiber (zB Tubulin - Promotor-LexA :: GAD) ²² getestet werden . Wir stellen fest , dass tsMARCM Klone können manchmal nicht eindeutig analysiert werden, vor allem , wenn ein GAL4 - Treiber mit einem komplexen neuronalen Expressionsmuster verwendet wird (zB grüne Seitenhorn (LH) Neuronen verhindern klare Visualisierung der axonalen Ausarbeitung Muster des VL2p ADPN in 3B und (zB MARCM, Q-MARCM und Twin-Spot - Generator) ^{4, 20, 21} , weil die Beschränkung mit dem Fahrer GAL4 stammt. Wir stellen ferner fest, dass Rettungsversuche für die Authentifizierung von Genfunktionen zu führen, die Rettung Transgene sollte mit den Zielsequenzen der RNAi Suppressoren in 5 'oder 3'-untranslatierte Regionen der transgenen Rettungs Konstrukte oder ein alternatives Doppel vor Ort entwickelt werden Kennzeichnungssystem (zB gekoppelt MARCM, eine Kombination von Q-MARCM und konventionellen MARCM) ²¹ angenommen werden sollte.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

Neben tsMARCM, Twin-Spot-Generator und gekoppelt MARCM auch wäre, zumindest in der Theorie, ermöglichen die Visualisierung vonabgeleiteten Neuronen aus gemeinsamen neuronalen Vorläuferzellen in zwei verschiedenen Farben (ein Vergleich dieser drei Mosaik-Kennzeichnungstechnologien wurde ¹⁵ vorgestellt zuvor). Die minimale Anzahl von Transgenen für die Montage Zweipunktgenerator erforderlich, die ursprüngliche Version von tsMARCM (oder die neue Version von tsMARCM) und gekoppelt MARCM 4, 8 (oder 6), bzw. 9. Allerdings ist tsMARCM das einzige System , das verwendet wurde , ¹² umfassende neuronale Abstammungslinie Analysen ^{durchzuführen, 15, 18, 23.} Ortsspezifische Rekombination in nicht-mitotischen Zellen in dem Doppelpunktgeneratorsystem auftreten, und dies führt zur Koexpression der beiden Reporter in der gleichen Zelle, es schwierig zu verwenden, dieses System so dass die Entwicklung des zentralen studieren Nervensystem ^15. Im Gegensatz dazu erhalten mosaic Klone in der tsMARCM und gekoppelt MARCM Systeme are von mitotischen Zellen abgeleitet. Da jedoch die gekoppelt MARCM System zwei unabhängige Treiber erfordert die Expression der verschiedenen Reportern in der Q-MARCM und konventionellen MARCM Systeme zu steuern, stellt sich Sorgen über die Markierung von Neuronen aus gemeinsamen neuronalen Vorläufern abgeleitet sind, wenn die beiden unabhängigen Treiber nicht originalgetreu beschriften Sie die gleichen Neuronen in den neuralen Abstammungslinien von Interesse ^15.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach der Technik Mastering

Mit tsMARCM hochauflösende neuronale Abstammungslinie Analysen durchzuführen
Durch den Ansatz , die Anwendung in Abbildung 3 verwendet , um systematisch tsMARCM Klone von adPNs, 40 Arten von adPNs, mit insgesamt 82 Neuronen wurden in einer früheren Studie ¹² identifiziert analysieren. Unter diesen 40 Arten von adPNs, waren 35 uni-glomerulären adPNs (dh Innervation eine einzelne Glomeruli in Antennallobus (AL)), die relay Geruchsinformation in andere Regionen des Drosophila - Gehirns ¹² (siehe Die Abbildungen 2-4 in Yu et al., 2010). Die anderen fünf Typen von adPNs waren poly-glomerulären adPNs (dh innervieren multiple Glomeruli in der AL), die Geruchsinformation von der AL integrieren konnte , und eine zusätzliche Ebene der funktionalen Komplexität des olfaktorischen Systems ¹² (siehe Figuren 3E-3H bereitzustellen und 4Z in Yu et al., 2010). Embryonale geborene adPNs haben nur ein Neuron pro Typ, während Larven geborene adPNs von mehreren Neuronen pro Typ dargestellt werden, was darauf hindeutet , dass es Wechselwirkungen zwischen Spezifität und Redundanz im olfaktorischen System ¹² (siehe Abbildungen 2-4 in Yu et al., 2010). Interessanterweise ist in bestimmten Entwicklungs Fenster erzeugt Neuronen sind dazu bestimmt, zu sterben, und viele Arten von adPNs sind mit einer festen Anzahl von Neuronen in der neuralen ALad1 lineage gefunden, was darauf hindeutet, dass die number und Arten von adPNs für das olfaktorische System der Montage sind geregelt fest ¹² (siehe Figuren 2H, 4V und 5 in Yu et al, 2010;. auch Abbildung 3P sehen - 3T).

Mit tsMARCM genau Genfunktionen studieren
Neben der Geburt Datierung adPNs hat tsMARCM auch die Geburtsfolge von sechs zentralen Komplex Neuronen zu bestimmen, gekennzeichnet durch GAL4-OK107 angewendet. Diese sechs Neuronen machen eine kleine Untergruppe von Neuronen in der LALv1 neuronale Abstammungslinie bis die mit der Schaltung des Drosophila zentralen Komplex beitragen , um komplizierte Motorsteuermuster ^{2, 11} (4a und 4b in Yu et al sehen., 2009). Interessanterweise besitzt jede dieser sechs zentralen Komplex Neuronen eine deutliche neuronale Morphologie ¹¹ (siehe Abbildung 4d-4h und 4o in Yu et al., 2009). Alle von ihnen tragen verschiedene axonalen Muster in den spätenral Zubehörlappen (LAL). Die ersten vier Neuronen verteilen ihre Dendriten Unterfächer des noduli, einer Unterkonstruktion des zentralen Komplexes, während die übrigen zwei Neuronen ihre Dendriten zum Ellipsoid Körper projizieren, eine andere Unterstruktur des zentralen Komplexes. Insbesondere Projekte der ^3. -born zentralen Komplex Neuron seine Dendriten zu den ventralen noduli, mit einem kompakten axonalen Muster im LAL, während das ^4. -born zentralen Komplex Neuron seine Dendriten auf die dorsale noduli verteilt, mit einem breiten axonalen Muster in der LAL - ¹¹ (Abbildung 4f und 4g in Yu et al., 2009 zu sehen).

Darüber hinaus umfassend zu identifizieren Neuronen, wäre die Macht der tsMARCM besser am Beispiel von Gen-Funktionen in Neuronen von Interesse zu studieren, da die tsMARCM System analysiert durch Aktivieren der Prüfung von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren besser phänotypische ermöglicht. Zum Beispiel erkennt tsMARCM eine einzige zeitliche Fette Änderung , die zeitlich unpassend Morphogenese (chinmo, ein BTB-Zinkfinger - Kernprotein) in der ^3. -born zentralen Komplex Neuronen ¹¹ (siehe Abbildung 4i, 4p, und 4W in Yu et al., 2009) erfordert. Wenn die chinmo Mutation war in der ursprünglichen MARCM System (dh einzelne aus grün-markierten Neuronen, ohne die Kennzeichnung von Neuronen abgeleitet von den zugehörigen Seiten der Zwillingszellen als Referenz), die chinmo -Mangel Neuron in Abbildung 4i charakterisiert aus Yu et al. , Hätte 2009 als ^4. -born falsch identifiziert, statt der ^3. -born, zentralen Komplex Neuron. Dies würde in der Fehlinterpretation der chinmo Funktion geführt haben , als axonalen Führung zu steuern , anstatt zeitliche Schicksal ¹¹ angibt (Doppelpfeil in Abbildung 4i von Yu et al., 2009). Jedoch durch die magenta mehrzelligen-NB Seiten tsMARCM Klone unter Verwendung als the-Referenz (über das Zählen der Zellzahlen in Abbildung 4m, 4n und 4p von Yu et al. 2009), der chinmo defizienten Neuron in Figur 4i von Yu et al gezeigt. Zu sein wurde, 2009) bewiesen die ^3. -born zentralen Komplex Neuron, die deshalb auf den richtigen Schluss geführt , dass ¹¹ für die zentrale komplexen Neuronen Funktionen in zeitlichen Schicksal Spezifikation chinmo. Zusammengenommen markieren die obigen Ergebnisse die wichtigen Vorteile der tsMARCM System für hochauflösende phänotypische Analysen, wodurch genau Genfunktionen in Neuronen Offenlegung (oder andere Arten von Zellen, wo zutreffend) für zukünftige neuronale Entwicklungsstudien (oder die Entwicklungsstudien anderer Gewebe).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones